Summary
Dieses Manuskript beschreibt Standardprotokolle zur Messung der Hyperphosphorylierung Tau, Tau Bindung an Mikrotubuli und Lokalisierung von intrazellulären Tau nach medikamentösen Behandlungen zu messen. Diese Protokolle können wiederholt verwendet werden, für das screening von Drogen oder andere Substanzen, die auf Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli binden.
Abstract
Die Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau ist ein neuronalen Protein, das vor allem in Axone lokalisiert. Im Allgemeinen ist Tau für normale neuronalen funktionieren, da es bei der Montage von Mikrotubuli und Stabilisierung beteiligt ist. Neben Neuronen ist in menschlichen Brust-, Prostata-, Magen-, Darm-, und Pankreaskarzinome wo es zeigt fast ähnlichen Struktur und ähnliche Funktionen ausübt, als die neuronalen Tau Tau ausgedrückt. Die Höhe der Tau und die Phosphorylierung kann ändern ihre Funktion als Stabilisator von Mikrotubuli und führte zur Entwicklung der gekoppelten spiralförmigen Filamente in verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer. Ermittlung des Tau und die Mikrotubuli-Bindungseigenschaften Phosphorylierung ist wichtig. Darüber hinaus ist es wichtig bei verschiedenen Krankheiten, untersuchen die intrazelluläre Lokalisation der Tau. Dieses Manuskript Details Standardprotokolle zur Messung der Phosphorylierung von Tau und Tau Bindung an Mikrotubuli in colorectal Krebszellen mit oder ohne Curcumin und LiCI Behandlung. Diese Behandlungen können eingesetzt werden, um Krebs Zellproliferation und Entwicklung zu stoppen. Intrazelluläre Lokalisation der Tau wird mithilfe von Immunohistochemistry und konfokalen Mikroskopie mit geringen Mengen von Antikörpern untersucht. Diese Tests können wiederholt verwendet werden, für das screening von Verbindungen, die Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli Bindung auswirken. Neuer Therapeutika für verschiedene Tauopathies oder Verwandte Anti-Krebs-Agenten können potenziell charakterisiert werden, mit Hilfe dieser Protokolle.
Introduction
Tau wurde ursprünglich als hitzebeständig Mikrotubuli-assoziierten Protein identifiziert, das Co gereinigtem Tubulin1war. Tau wird ausschließlich in höheren Eukaryoten2,3,4angegeben. Die Hauptfunktion des Tau ist, Mikrotubuli Montage1,5,6zu kontrollieren. Es trägt auch zur Polymerisation von Mikrotubuli7, axonalen Transport8, Veränderungen der axonalen Durchmesser9, Bildung von Neurom Polarität und Neurodegeneration10. Tau fungiert auch als Protein Gerüst, einige Signalwege zu kontrollieren. Ratte Gehirn Studien deuten darauf hin, dass Tau Neuron-spezifische und dass es in erster Linie in Axone11lokalisiert. Da Tau für Mikrotubuli Polymerisation und neuronale Entwicklung unabdingbar ist, war Tau vermutet, um eine wichtige Rolle in der axonalen Entwicklung in das zentrale Nervensystem; Diese Hypothese wurde später von in Vitro und in Vivo Experimente verifiziert. Neben der Neuronen drückt sich Tau in verschiedenen nicht-neuronale Zellen, einschließlich Leber, Niere und Muskel Zellen12,13. Tau drückt sich auch in menschlichen Brust-, Prostata-, Dickdarm-, Magen-, und pankreatischer Krebs Zelle Linien und Gewebe14,15,16,17,18, 19. Tau findet sich auch in Einbeziehung Körper Myositis als verdrehte Tubulofilaments Einschlusskörperchen20.
Tau kann mehrere post-translationalen Modifikationen vornehmen. Phosphorylierung ist alle post-translationalen Modifikationen die am weitesten verbreitete. Erhöhten Tau Phosphorylierung verringert seine Affinität für Mikrotubuli, schließlich das Zellskelett zu destabilisieren. Fünfundachtzig Phosphorylierung Websites wurden in Tau-Protein isoliert von Hirngewebe menschlichen Alzheimer-Krankheit beschrieben. Dieser Seiten sind 53 % Serin, 41 % Threonin und nur 6 % Tyrosin Rückstände21,22,23. Tau-Phosphorylierung wirkt sich auf die Lokalisierung, Funktion, Bindung, Löslichkeit und seiner Anfälligkeit für andere post-translationalen Modifikationen. Auch Tau Phosphorylierung um mehr als die normale Ausdehnung (oder vollständig gesättigt mit Phosphatgruppen) ist bekannt als Hyperphosphorylierung, die strukturelle und funktionelle Merkmale der Alzheimer-Krankheit24repliziert. Tau unterhält Funktionsfähigkeit des axonalen Mikrotubuli und sorgt für normale neuronale Funktion unter physiologischen Bedingungen. Hyperphosphoryliertem Tau schlägt jedoch fehl, eine gut organisierte Mikrotubuli binden, was neuronaler Verlust wegen Mikrotubuli Demontage beizubehalten. Ein normales Niveau von Tau Phosphorylierung sind erforderlich für die ordnungsgemäße Funktionsweise Tau, aber Tau nicht, normal zu funktionieren, wenn seine charakteristische Phosphorylierung-Ebene verändert wird und wenn es hyperphosphoryliertem25. In der Alzheimer-Krankheit und einigen anderen altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen Tau wird hyperphosphoryliertem und bildet die gepaarten spiralförmigen Fäden und neurofibrillären Verschlingungen26,27. Daher sind die Methoden zur Bestimmung von Tau Phosphorylierung und Mikrotubuli binden wichtig.
Colorectal Krebs, eine Alterung verbundenen Krebs ist die dritte am häufigsten diagnostizierte Krebs und der dritte prominente Tod verursacht Krebs für Männer und Frauen28. Darmkrebs ist eine der wichtigsten Tod verursachen Krebserkrankungen in der westlichen Welt29. Weil colorectal Krebs und Alzheimer-Krankheit mit Altern verbunden sind, und beides vor allem in den entwickelten Ländern geschieht, wo die Menschen ähnliche Ernährungsgewohnheiten genießen, können die beiden Krankheiten irgendwie korreliert werden. Darüber hinaus reagieren Tau-Positive und Tau-Negative Krebszellen unterschiedlich auf Chemotherapeutika, z.B., Paclitaxel16.
Curcumin ist eines der wichtigsten Derivate von Curcuma Longa, die indische Gewürz Kurkuma30. Jahrhundertelang haben die asiatische Populationen Kurkuma in ihrer Ernährung auf einer täglichen Basis verbraucht. Curcumin ist zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Darmkrebs, Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Mukoviszidose, entzündliche Darm-Krankheit, Arthritis, Hyperlipidämie, Arteriosklerose und ischämischen Herzkrankheiten31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. Lithium auch colorectal Krebszellen zu töten oder zu verhindern, dass ihre Verbreitung39. Lithium kann auch verwendet werden, für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit40 wie es Tau Aggregation verringert und die Hyperphosphorylierung verhindert wie in einem transgenen Maus Modell41,42,43beobachtet, 44.
Dieses Manuskript soll: 1) messen Sie die Gesamt-Tau und Phospho-Tau Ausdruck Niveaus im behandelten Zellen; (2) beschreiben Sie eine Phosphatase Test zur Messung der gesamten Tau Phosphorylierung; (3) Mikrotubuli-Bindung von Tau zu prüfen; und 4) lokalisieren Tau konfokalen Mikroskopie in colorectal Krebs-Zelllinien mit Curcumin oder LiCI behandelt. Ergebnisse zeigen, dass Zelltherapie mit Curcumin, die einen vermeintlich guten Chemotherapeutikum für Darmkrebs und Behandlung mit LiCI reduzieren Ausdruck der beiden total Tau und Tau in colorectal Krebs-Zelllinien phosphoryliert. Diese Behandlungen verursachen auch nukleare Translokation von Tau. Jedoch nicht unerwartet, Curcumin, Bindung von Tau zu Mikrotubuli zu verbessern.
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Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- fügen Sie 10 µL (1 mM) Phenylmethylsulfonyl Fluorid Lösung, 10 µL Protease-Inhibitor-cocktail-Lösung (1 X 100 X lagermäßig) und 10 µL (1 X 100 X lagermäßig) Phosphatase Inhibitor cocktail Lösung 1 mL 1 X radioimmunoprecipitation (RIPA) Testpuffer komplette RIPA Lyse Puffer vorzubereiten.
- Vorbereitung 10 x allgemeine Tubulin Puffer (PEM) Puffer.
- Add 800 mM (6,0474 g) Piperazin-N-N ' - Bis - 2-Ethanesulfonic Säure, 10 mM (95,1 mg) Ethylen Glykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-Tetraacetic Säure, 10 mM (51 mg) MgCl 2 und 1,25 M (10 M 3 mL) NaOH in einen 50-mL-Tube , mit 15 mL destilliertem Wasser mischen, und mit einem Wirbel auflösen. Überprüfen Sie den pH-Wert (6,9 sein sollte). Wenn pH > 6.9, entsorgen Sie den Puffer und viel frische remake.
Hinweis: NaOH sollte unter 1,25 M um sicherzustellen, dass dieser pH-Wert 6,9 nicht Überschwingen. Es ist nicht ratsam, HCl für pH-Wert verwenden > 6.9. - Add NaOH tropfenweise bis pH 6,9 ist. Fügen Sie destilliertes Wasser um bis zu 25 mL 10 X PEM-Puffer zu machen. Zu guter Letzt mit einer Spritze und einem 0,2 µm Spritze Filter filtern Teilen Sie diesen Puffer in Aliquote in 1,5 mL Tuben und Lagerung bei 4 ° c
- Add 800 mM (6,0474 g) Piperazin-N-N ' - Bis - 2-Ethanesulfonic Säure, 10 mM (95,1 mg) Ethylen Glykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-Tetraacetic Säure, 10 mM (51 mg) MgCl 2 und 1,25 M (10 M 3 mL) NaOH in einen 50-mL-Tube , mit 15 mL destilliertem Wasser mischen, und mit einem Wirbel auflösen. Überprüfen Sie den pH-Wert (6,9 sein sollte). Wenn pH > 6.9, entsorgen Sie den Puffer und viel frische remake.
- Prepare 5 x Probenpuffer mit Reduktionsmittel und Farbstoff.
- Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25 %) von 50 % Glyzerin, 1 mL (2 %) von 10 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) und 1,2 mL destilliertem Wasser 5 mL 5 x SDS-Probenpuffer ausmachen. Lagerung bei − 20 ° c
Hinweis: Da Glycerin zähflüssig ist, ist Messung 1,25 mL Glycerin schwierig. 1 mL 100 % Glyzerin wiegt 1,26 g. So wiegen 1,575 g 100 % Glycerin (das entspricht 1,25 mL von 100 % oder 2,5 mL 50 % Glycerin) in einem 15 mL tube zuerst; Mischen Sie gut mit den anderen Komponenten.
- Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25 %) von 50 % Glyzerin, 1 mL (2 %) von 10 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) und 1,2 mL destilliertem Wasser 5 mL 5 x SDS-Probenpuffer ausmachen. Lagerung bei − 20 ° c
2. Zell-Kultur, Behandlung mit Curcumin oder LiCI Behandlung und Untersuchung von Protein-Expression
- Add ~ 1 x 10 6 HCT-116 Zellen in 100 mm Gewebekultur Speisen mit der Minimum wesentlichen Medien (MEM) mit 10 % fetalen Rindern ergänzt Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Nach einem Tag der Kultivierung, Zellen werden 60-70 % Zusammenfluss erreichen.
Hinweis: Die Anzahl der benötigten Platten hängt von der Anzahl der nachstehend beschriebenen Behandlungen. - , Wenn Zellen ~ 65 % Zusammenfluss (angenähert mit Mikroskopie) zu erreichen, das MEM ergänzt Medium zu entfernen und serumfreien MEM mit 5 µM, 10 µM und 30 µM Curcumin oder 25 mM, 50 mM und 100 mM LiCI hinzufügen. Inkubation bei 37 ° C für 24 h in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO 2.
- 24 h nach der Behandlung der Zellen mit 1 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) waschen und kratzen Sie die Zellen mit einem Schaber Zelle. Übertragung der geschabten Zellen in 1,5 mL Röhrchen Zentrifugieren und Zentrifugieren für 4 min bei 1.800 X g bei 4 ° C Zelle Pellets erhalten.
- Lyse der Zellen durch die Aussetzung der Pellets in 100 µL kompletten RIPA Puffer bei 4 ° C für 20 min während regelmäßig Antippen der Rohre. Die Proben kurz beschallen.
- Zentrifugieren der Zelle Homogenates in einer Zentrifuge Benchtop bei 22.570 X g für 20 min bei 4 ° c die Überstände auf andere beschrifteten Röhrchen mit einer Pipette übertragen.
- Messen die Proteinkonzentration in die Überstände an der Bradford-Test 45 mit kommerziellen Protein-Test-Kits.
- Vorbereiten Proben gleich Proteinkonzentration (10 µg Protein/13 µL Probe) der Zelle Lysates mit 4 X SDS Gel-Loading Puffer. 4 x SDS-Gel-laden-Puffer frisch mit 400 mM Dithiothreitol (DTT) vorbereitet.
Hinweis: In diesem Stadium Proben können gespeichert werden auf − 20 ° C bei Bedarf. - Inkubation die Proben auf einem Heizblock bei 100 ° C für 5 min. Mischen der Proben mit einem Wirbel und warten, bis sie kaltstellen ~ 10-15 min.
- Montieren ein Elektrophorese-System.
- Last 10 µg Protein (13 µL Probe) pro Bohrloch auf einem 10 % SDS-Polyacrylamid-Gel für Elektrophorese (SDS-PAGE). Laden Sie die Molekulargewicht Leiter auf das Gel einspurig.
Hinweis: Als Elektrophorese beginnt, löst die Protein-Leiter in Protein-Bands der scheinbaren Molekulargewichten. Diese Bänder verwenden, um die Molekulargewichte der unbekannten Protein Bands schätzen. - Nach dem Laden der Proben, schließen Sie die positiven und negativen Elektroden der Elektrophorese-System an eine Stromquelle, um eine konstante Spannung aufrecht zu erhalten. Zunächst beginnen Sie bei 70 V für 20 min die Proteinproben aus dem Stapel Gel in die Lösung von Gel. Dann erhöhen die Spannung 125 V ca. 70-120 Minuten, bis das Ende des Gels Proben und Protein-Leiter erreichen.
- Nach Abschluss der Elektrophorese, das Gel auf einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran mit einem nassen Elektroblotting System übertragen. Transfer für ~ 100 min bei 100 V. Block die Membran in 4 % Rinderserumalbumin (BSA) blockierende Puffer für 90 min. bei Raumtemperatur von rund 25 ° c
- Last 10 µg Protein (13 µL Probe) pro Bohrloch auf einem 10 % SDS-Polyacrylamid-Gel für Elektrophorese (SDS-PAGE). Laden Sie die Molekulargewicht Leiter auf das Gel einspurig.
- Den Blot markieren, indem Sie auf der Seite mit dem Molekulargewicht Leiter schneiden. Verwenden Sie eine transparente Plastikfolie und ein scharfes Messer zum Schneiden des Blot. Bereiten Sie die Lösungen der primär-Antikörper (Anti-Tau mit 1:5, 000, Anti-Phospho-Tau bei 1:4 000) und über Nacht den Blot in dieser Lösung bei 4 ° C inkubieren.
- Nach der Inkubation über Nacht, waschen den Fleck für 7 min viermal in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-Tween-20 (PBST) Lösung.
- Bereiten die relevanten Sekundär-Antikörper-Lösungen (Ziege Anti-Kaninchen oder Anti-Maus IgG bei 1:5 000), und den Fleck in dieser Lösung für 90 min. bei Raumtemperatur ca. 25 ° c zu waschen in PBST viermal, 7 min inkubieren.
- Entwicklung den Fleck mit einem Chemilumineszenz-Kit nach Angaben des Herstellers ' s Empfehlungen. Decken Sie den Fleck mit einer durchsichtigen Plastikfolie. Abrufen von Bildern durch eine Chemilumineszenz imaging-System für Chemilumineszenz mit entsprechender Software.
3. Phosphatase-Assay
- die Zelle Lysates (aus Schritt 2.5) mit alkalischer Phosphatase in der alkalischen Phosphatase-Puffer zu behandeln.
- Beispiele für beide Steuern und behandelte Proben vorbereiten 20 µL mit 20 µg Gesamt-Protein. Fügen Sie das Volumen der Zelle Lysates, die 20 µg Gesamt-Protein, gefolgt von 2 µL alkalische Phosphatase Puffer und 10 µL alkalische Phosphatase enthält. Hinzufügen von destilliertem Wasser auf 20 µL ausmachen.
- Die Proben bei 37 ° C inkubieren, 1 h. Stop die Reaktion durch Zugabe von Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) auf eine Endkonzentration von 50 mM oder durch Zugabe von Natrium Orthovanadate (Na 3 VO 4) auf eine Endkonzentration von 10 mM. Die Reaktion kann auch durch Erhitzen bei 75 ° C für 5 min. gestoppt werden
- Vor der Bebrütung von Proben mit Phosphatase beendet, Proben der gleichen Konzentration ohne Zugabe von Phosphatase zum Vergleich mit Phosphatase-behandelten Proben vorbereiten.
- Add die frisch zubereitete 4 X SDS Gel-Loading Puffer mit 400 mM DVB-t.
- Brüten die Proben auf einem Heizblock bei 100 ° C für 5 min. Mix der Proben mit einem Wirbel. Bei Raumtemperatur für cool ~ 10-15 min.
- Bauen eine Elektrophorese System für die Ausführung von einer 10 % Polyacrylamid-Gels durch SDS-PAGE.
- Last 10 µg Protein (13 µL Probe) pro Bohrloch auf einen 10 % polyacryLamide Gel. Die Molekulargewicht Leiter laden.
- Nach dem Laden der Probenmaterials, schließen Sie die positiven und negativen Elektroden der Elektrophorese-System an eine Stromquelle, um eine konstante Spannung aufrecht zu erhalten. Zunächst beginnen Sie bei 70 V für 20 min die Proteinproben aus dem Stapel Gel in die Lösung von Gel. Dann erhöhen die Spannung 125 V und das Gel für ca. 70-120 min laufen, bis das Ende des Gels Proben und Protein-Leiter erreichen.
- Nach Abschluss der Elektrophorese, Gel auf einer PVDF-Membran mit einem nassen Elektroblotting System zu übertragen. Transfer für ~ 100 min bei 100 V.
- Markieren indem man einen kleinen Schnitt auf der Seite die Molekulargewicht Leiter den Blot. Verwenden Sie eine transparente Plastikfolie und ein scharfes Messer zum Schneiden des Blot.
- Blockieren die Membran in 4 % BSA blockierende Puffer für 90 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren den Blot in PV-Antikörperlösung (Anti-Tau in der 1:5 000) bei 4 ° C über Nacht. Waschen den Blot in PBST vier Mal für 7 min.
- Bereiten Sie die relevanten Sekundär-Antikörper-Lösung (Ziege Anti-Maus IgG bei 1:5 000) und den Fleck für 90 min bei Raumtemperatur inkubieren. Vier Mal für 7 min in PBST waschen.
- Entwicklung den Fleck mit einem Chemilumineszenz-Kit nach Angaben des Herstellers ' s Empfehlungen. Den Fleck in eine transparente Plastikfolie abdecken. Abrufen von Bildern durch eine Chemilumineszenz imaging-System für Chemilumineszenz mit entsprechender Software.
4. Mikrotubuli-Bindung Assay
- für die Mikrotubuli binden Assay, wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6.
- Vorbereiten 1 X (2 mL) PEM-Puffer von 10 X PEM Puffer gespeichert bei 4 ° C durch Zugabe von 20 µM (40 µL) Paclitaxel und 1 mM (20 µL) GTP. Die Mikrotubuli (MT) Bestandsaufnahme von − 80 ° C Gefrierschrank und der E. Coli Tau Arbeit bestand aus − 20 ° C Gefrierschrank.
- Bereiten Proben gemäß Tabelle 1.
- 30 min. Ultrazentrifugen bei 25 ° C für 60 min bei 100.000 X g bei 37 ° C inkubieren.
- Transfer 120 µL Überstände mit ungebundenen Tau, zu reinigen und Röhren beschriftet.
- Fügen Sie 120 µL (gleiche Volumen wie überstand) 5 X Puffer zum Pellet mit gebundenen Tau zu probieren und gründlich mischen. Die Lösung um beschriftete Rohre zu reinigen und gründlich mischen.
- Messen die Konzentration des Proteins (siehe Punkt 2.6).
Hinweis: Verwenden Sie während der Vorbereitung der Proben, das Volumen der Lösung (Schritt 4.6) für die Pellets und überstand Probenvorbereitung. - Proben von gleichwertigen Proteinkonzentration vorbereiten und fügen Sie frisch zubereitete 4 x SDS-Gel-laden-Puffer mit DVB-t (400 mM).
Hinweis: Proben können gespeichert werden, am − 20 ° C in diesem Stadium. - Wiederholen Sie die Schritte 3,5-3.10.
| Probe | Name | Mikrotubuli benötigt | Main Protein benötigt | PEM-GTP-PTX | ||||
| 1 | HCT-116-Control (6,21 μg/μl) | 2 μl | 9,66 μl (60 μg) | 108.34 μl | ||||
| 2 | HCT-116-Curcumin 10 μM (4,81 μg/μl) | 2 μl | 16.63 μl (80 μg) | 101.37 μl | ||||
| 3 | HCT 116-Curcumin 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30.49 μl (100 μg) | 87.51 μl | ||||
| 4 | HCT-116-LiCI 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18.42 μl (100 μg) | 99.58 μl | ||||
| 5 | E. Coli Tau | 2 μl | 1 μl Tau-352 | 117 μl | ||||
| 6 | MT nur | 2 μl | X | 118 μl | ||||
| < td Colspan = " 2"> | 120 μl | |||||||
Tabelle 1: Probenvorbereitung für Mikrotubuli-Bindung Assay.
5. Lokalisierung und Ausdruck der Tau nach Behandlung der Zellen mit Curcumin
- einem Deckgläschen mit 70 % Ethanol zu reinigen und trocknen Sie es mit einem Labor-Gewebe. Legen Sie ein einzelnes Deckglas in jede Vertiefung einer Gewebekultur beschrifteten 6-Well-Platte. Die Platte zur biologischen Sicherheit Kabinett und schalten Sie ein UV-Licht für mindestens 3 h
- Subkultur der Zellen und säen sie in die entsprechenden Vertiefungen der 6-Well-Platte 2,5 x 10 5 Zellen/Brunnen im empfohlenen Kulturmedium.
- Nach ca. 24 h, untersuchen die Zellen mit einem inversen Mikroskop indem Sie 10 X und 40 X Ziele für zelluläre morphologische Veränderungen zu überprüfen. Fotos aufnehmen, wenn nötig.
- Spülen die Zellen zweimal mit PBS. Die Zellen in 3,7 % Formaldehyd in einem Inkubator 37 ° C im Dunkeln zu beheben.
Hinweis: Fixierung durch Formaldehyd bei Raumtemperatur funktioniert gut, auch. Tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung beim Umgang mit Formaldehyd. - Waschen der Zellen mit PBS-Puffer. Zellen im eiskalten Methanol zu beheben − 20 ° C für 15 min. Permeabilize Zellen durch brüten sie in 3 % BSA und 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer auf dem Eis für 10 min. die Zellen mit PBS waschen.
- Inkubieren Sie die Zellen in blocking-Puffer (3 % BSA und 0,1 % Tween 20 in PBS-Lösung) für 1 h bei Raumtemperatur.
Hinweis: Inkubation für 2 h bei 4 ° C funktioniert gut, auch. - Bereiten Sie die primär-Antikörper (Anti-Tau bei 1: 200) Lösung in 3 % BSA und 0,1 % Tween 20 in PBS (z. B. 2 µL Tau-13 Antikörper in 0,4 mL Puffer).
- Schneiden Sie kleine Stücke von einer PVDF Membran so dass die Stücke passen in jede Vertiefung des 6-Well-Platte; sie in Wasser einweichen für 5 min. Ort den Schnitt PVDF in jede Vertiefung.
- Fügen Sie 60 µL Primärantikörper Lösung bis zum Schnitt PVDF Stück in jede Vertiefung. Platzieren Sie die Deckgläsern, derart, dass die Zellen der primären Antikörperlösung berühren können. Über Nacht bei 4 ° C in einer dunklen, feuchten Kammer inkubieren. Waschen mit PBS-Puffer viermal.
- Bereiten Sie die Sekundär-Antikörper-Lösung (Fluorescein konjugiert 594 Anti-Maus IgG bei 1: 400) in 3 % BSA und 0,1 % Tween 20 in PBS.
- Schneiden kleine Stücke einer PVDF-Membran, so dass die Stücke in jede Vertiefung des 6-Well-Platte passen, und sie in Wasser für 5 min. Platz den Schnitt PVDF in jede Vertiefung genießen.
- Hinzufügen 80 µL der Sekundär-Antikörper-Lösung für die PVDF-Stücke in der 6-Well-Platte. Das Deckglas zu platzieren, so dass die Zellen, die Sekundär-Antikörper-Lösung berühren können. Inkubieren Sie vier Mal in einer dunklen, feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 2 h mit PBS waschen.
- Mount Proben in das Eindeckmittel mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und befestigen Sie den Deckgläsern auf Objektträgern.
- Hinzufügen einer Tropfen Eindeckmittel mit DAPI auf Objektträgern. Entfernen Sie die Deckgläsern aus jedem Brunnen und legen Sie sie auf die Glas-Folien mit Eindeckmittel mit DAPI. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche der einzelnen Deckglas mit gefärbten Zellen die Moun berührtTing-Medium auf die entsprechenden Glasobjektträger.
- Übernehmen Nagellack rund um jedes Deckglas zu versiegeln und zu lösen auf der Glas-Folien luftdicht. Falls erforderlich, führen Sie diesen Schritt zweimal.
- Für 1,5 h bei Raumtemperatur in einer dunklen Kammer inkubieren.
- Untersuchen die Folien mit einem konfokalen Mikroskop mit Immersionsöl auf das Deckglas in einem dunklen Raum.
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Representative Results
Ausdruck der gesamten Tau und Phospho-Tau wurde geprüft, nach der Behandlung der Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Curcumin oder LiCI (Abbildung 1). Behandlung der Zellen mit den drei verschiedenen Konzentrationen von Curcumin verringerte Tau Ausdruck; Phospho-Tau Ausdruck erhöht bei der Behandlung mit geringen Konzentration von Curcumin jedoch verringerte sich auf Behandlung von Zellen mit höheren Konzentrationen von Curcumin. Anti-Phospho-Tau (Ser396) wurde für die Erkennung von Phospho-Tau verwendet. Ebenen der gesamten Tau und Phospho-Tau verringerte sich auf Behandlung der Zellen mit den drei verschiedenen Konzentrationen der LiCI (Abbildung 1). Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass Tau Ausdruck in verschiedenen Krebsarten und an verschiedenen Standorten die gleichen Krebsarten unterschiedlich. Vorherigen Daten auf Darmkrebs zeigten, dass Tau in beiden Zelllinien (HCT-116 und SW480) von kolorektalen Karzinomen zum Ausdruck kam, die auch phosphorylierten19waren. Phospho-Tau waren in Zellen mit 5 µM Curcumin behandelt höher als bei unbehandelten Zellen. Phospho-Tau Ebenen waren höher als insgesamt Tau in Zellen mit der gleichen Konzentration von Curcumin behandelt. Behandlung der Zellen mit 10 µM Curcumin verringerte Phospho-Tau im Vergleich zu unbehandelten Zellen aber Phospho-Tau Ausdruck war noch mehr als insgesamt Tau Ausdruck Niveaus. Behandlung der Zellen mit 30 µM Curcumin gesenkt Phospho-Tau Ausdruck gegenüber Phospho-Tau in den unbehandelten Zellen und total Tau Ebenen behandelten Zellen.
Dieses Manuskript etabliert eine einfache Protokoll für die Beurteilung des Phosphorylierung Status der Tau durch eine Phosphatase-Assay (Abbildung 2). Nach der Behandlung Curcumin insgesamt Tau Phosphorylierung änderte sich nicht signifikant und Phosphorylierung an spezifischen Aminosäureresten war bedeutende (Abbildung 1). Insgesamt hielt sich Tau Phosphorylierung in Zellen mit LiCI im Vergleich zu unbehandelten Zellen behandelt. Phosphatase-behandelten Proben electrophoresed schneller als bei unbehandelten Proben, Überprüfung, dass unbehandelte Proben mehr hyperphosphoryliertem als Phosphatase-behandelten Proben waren. Curcumin-behandelten Zellen zeigten fast die gleichen Ergebnisse, die darauf hinweist, dass die Behandlung von Darmkrebs-Zell-Linien nicht Tau Phosphorylierung reduziert, wie in Abbildung 1dargestellt. Phosphatase-behandelten und unbehandelten Proben electrophoresed an fast der gleichen Größenordnung in Proben von Zellen mit LiCI behandelt, darauf hinweist, dass Tau Phosphorylierung in diesen Zellen wurde reduziert (Abbildung 2). Hier wurden hohe Konzentrationen (20 µM oder 30 µM) von Curcumin-behandelten Proben genommen, Gesamtstatus Phosphorylierung als niedrige Konzentration Behandlung zeigte höhere ortsspezifische Phosphorylierung offenbart durch spezifische Phospho-Tau (S396) Antikörper zu vergleichen.
Darüber hinaus wurde in dieser Übungseinheit die Mikrotubuli binden Assay von Zellproben gegründet erfolgreich mit Tau-352 als positive Kontrolle und nur MT als Negativkontrolle (Abbildung 3). Für Curcumin und LiCI Behandlung war Mikrotubuli-bindende Aktivität gehemmt, wie der Mikrotubuli binden Test zeigt. In diesem Experiment zeigte Curcumin Behandlung keine Mikrotubuli bindend Fähigkeiten jedoch gehemmt, die Bindung, die ähnlich wie in früheren Studien46,47, während es um ortsspezifische Tau Phosphorylierung zu hemmen wirksam war höhere Konzentration. In Abbildung 1führte 10 µM Curcumin Behandlung minimale Ausdruck des Phospho-Tau verglichen mit Kontrolle aber höheren Ausdruck als total Tau. Allerdings wurde in der unbehandelten Probe Mikrotubuli-Bindungskapazität des kolorektalen Karzinoms Tau Curcumin Nachbehandlung sowie niedrige Konzentration von LiCI Behandlung verringert. Standortspezifische Tau Phosphorylierung Effekte Mikrotubuli binden und selbständige Aggregation48. Tau-Phosphorylierung an Prolin-reiche Region behindert Mikrotubuli-Bindungseigenschaften, während C-terminalen Region diese Eigenschaften erhöht, und beide Regionen zusammen mit MT-bindende Region seiner Bindeeigenschaften durch ungefähr 70 % verringert und ungeordnet die Mikrotubuli-48. Einige andere Faktoren als auch andere ortsspezifische Phosphorylierung des Tau könnte für diese Mikrotubuli Destabilisierung des kolorektalen Karzinoms Tau mit Curcumin oder LiCI behandelt einbezogen werden.
Eine einfache Protokoll mit kleinen Mengen von primären und sekundären Antikörper aktiviert Lokalisierung der Tau in colorectal Krebs-Zell-Linien nach Curcumin Behandlung (Abbildung 4). Ergebnisse zeigten, dass Tau auf den Kern nach Curcumin Behandlung versetzt hatte, ähnlich wie bei früheren Studien berichten, dass nukleare Tau Feststellung ist ein wichtiger Akteur in neuronalen DNA-Schutz bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer49 ,50.
Abbildung 1: Tau und Phospho-Tau Ausdruck in colorectal Krebszellen nach Curcumin oder LiCI Behandlung. Kontrollzellen entnommenen Proben oder Zellen für 24 h mit drei unterschiedlichen Konzentrationen von Curcumin (A) und (B) LiCI behandelt wurden gelöst auf 10 % Polyacrylamid-Gele durch SDS-PAGE und sondiert mit Anti-Tau oder Anti-Phospho-Tau Antikörper. Densitometrie Analysen der Western-Blot-Ergebnisse werden auf der rechten Seite dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: insgesamt Phosphorylierung des Tau in unbehandelt oder differentiell behandelt Zellproben von der Phosphatase-Test erkannt. Ungeraden Bahnen zeigen Kontrolle Zelle Extrakten, während sogar Gassen Phosphatase Behandlung von Curcumin-behandelten oder LiCI-behandelten Proben zeigen. Phosphatase Behandlung der Tau elektrophoretische Mobilität schneller als unbehandelte Proben, enthielt phosphorylierten Tau gemacht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Mikrotubuli binden von Tau in colorectal Krebszellen durch die Mikrotubuli-Bindung-Assay nachgewiesen. HCT-116 Zellen Kontrollproben, Curcumin-behandelten oder LiCI-behandelten Zellproben und E. Coli Tau wurden mit Mikrotubuli wie in Abschnitt 4 Protokoll inkubiert. Äquivalenzbeträge des Überstandes (S) und Pellets (P) Fraktionen wurden Immunoblotted mit einem Anti-Tau-Antikörper. Negativkontrolle Bahnen mit nur MT wurde durchgeführt, um bestätigen, dass MT keine gebundenen endogenen Tau enthielt. Untere Leiste zeigt Densitometrie Analysen des Western Blots von Einzelproben ermöglicht Vergleich zwischen überstand (ungebundene Tau) und Pellets (gebundene Tau) Brüche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Tau Protein Lokalisierung von konfokalen mic geprüftRoscopy.
Tau auf der Nukleolus in colorectal Krebszellen peripher lokalisiert. Linken Tafeln zeigen Tau Lokalisierung-Erkennung anhand der Anti-Tau monoklonale Antikörper während mittleren Platten Kern von DAPI Färbung zeigen. Repräsentative Beispiele der behandelten Zellen zeigen Tau Translokation in den Zellkern werden ebenfalls angezeigt. Kontrollzellen zeigte Tau hauptsächlich in und außerhalb der Kerne während Tau im behandelten Zellen auch in den Zellkernen lokalisiert. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Manuskript verschiedenen verfahrensrechtliche Voraussetzungen für die Erkennung von insgesamt Tau etabliert und phosphoryliert Tau in colorectal Krebszellen mit Curcumin und LiCI behandelt. Um den Gesamtstatus der Phosphorylierung des Tau in Proteinproben zu beurteilen, wurde eine Phosphatase-Assay beschrieben. Dieser Assay kann möglicherweise verwendet werden, um den Status der Phosphorylierung von jedem Protein untersuchen.
Dieser Test basiert auf dem Prinzip, die Protein bewegt sich langsamer als seinen Zustand nicht phosphoryliert phosphoryliert. Alkalische Phosphatase und alkalische Phosphatase Puffer werden in diesem Protokoll verwendet. Nach dem Hinzufügen der Assay-Komponenten, die Zelle Lysates, sollten Proben für eine bestimmte optimale Dauer bei einer bestimmten Temperatur inkubiert werden. Nach der Inkubation sollten Proben in das SDS-Probenpuffer um die Reaktion zu stoppen gekocht werden. Zuvor können verschiedene experimentelle Protokolle verwendet worden sein, die Bindung von Tau zu Mikrotubuli zu beurteilen. Die hier vorgestellten Mikrotubuli-Bindung-Assay ist einfach durchzuführen während einschließlich der positive und negative Kontrollen zur Qualitätssicherung mit Überstand und Pellet-Fraktionen bieten. Die MT-nur negative-Kontrolle wurde verwendet, um sicherzustellen, dass MT keine gebundenen endogenen Tau enthält. Darüber hinaus ist reine menschliche Tau-352, wurde ein Tau Mikrotubuli-Bindung als die positive Kontrolle verwendet. Um eine unverbindliche Bruchteil (überstand) Ultra-Speed Zentrifugation den Mikrotubuli-Bindung Bruch (Pellet) trennen verwendet; Dieses Verfahren kann eine Einschränkung sein, da solche Ultrazentrifugen teuer und nicht überall verfügbar ist. Da geringe Mengen von Proben verwendet, lange werden, sind darüber hinaus dünne Zentrifuge Rohre mit Adapter für den Einsatz in der Ultrazentrifuge Rotor erforderlich. Obwohl es solche Rohre Wiederverwendung möglich ist, empfiehlt die Einweg-Cross-Kontamination zu vermeiden. Zu guter Letzt ist ein Vorteil des Tau-Lokalisierung-Protokolls, dass nur geringe Mengen von primären und sekundären Antikörper benötigt werden. Nach Fixierung, Permeabilisierung und Sperrung von der Zellen-Anhänger auf Deckgläsern war ein kleiner Tropfen des Antikörpers auf einem kleinen Stück aus PVDF, hinterlegt, die dann in die Vertiefungen der 6-Well-Platte platziert wurde. Die Deckgläsern wurden gehalten, so dass die Antikörper die Zellen zugreifen könnte. Mithilfe dieses Protokolls kann die Menge der verwendeten Antikörper minimiert werden.
Einige Vorsichtsmaßnahmen sollten beachten Sie zuverlässige und quantifizierbare Ergebnisse sicherzustellen gehalten werden. Erstens sollte strengere aseptische Techniken zur Vermeidung von Kontaminationen in Zellkulturen verwendet werden und Zelle extrahiert. Der komplette RIPA Lyse Puffer sollte frisch zubereitet werden. In der Phosphatase-Test ist es wichtig, die Proben 3 min kochen und SDS-PAGE sofort nach Inkubation der Phosphatase-behandelten und unbehandelten Proben beginnen. Tau-352 sollte in kleine aliquoten unterteilt und auf Eis nach der Entnahme aus der Tiefkühltruhe −20 ° C gehalten und sofort nach Gebrauch wieder in den Tiefkühler hinterlegt. Nach der Entnahme aus dem −80 ° C, MT sollten Aktien auf dem Eis wird nochmals innerhalb von 72 h gehalten werden; Andernfalls behalten Sie sie bei Raumtemperatur. Die PEM-Puffer sollten bereit sein, als ein 10 X Lösung konzentriert, weil der Puffer 1 X muss frisch zubereitet werden, beim Hinzufügen von GTP und Paclitaxel.
Tau-Funktionen werden durch das Ausmaß seiner Phosphorylierung reguliert. Tau Hyperphosphorylierung tritt nicht in normalen Erwachsenen Gehirn Tau Tau-352, ähnlich wie die als Positivkontrolle in den Mikrotubuli-Bindung-Assay verwendet wurde. Allerdings tritt Tau Hyperphosphorylierung bei neurodegenerativen Erkrankungen. Dieses Protokoll und die daraus resultierenden Ergebnisse zeigen, dass menschliche colorectal Krebs-Zell-Linien auch phosphorylierten Tau ähnlich, die in den Gehirnen von Alzheimer-Krankheit führen. Behandlung mit hoch dosierten Curcumin und vor allem LiCI kann Tau Phosphorylierung minimieren. So eine gute Korrelation zwischen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit und Darmkrebs kann in Bezug auf Tau Hyperphosphorylierung existieren, und Curcumin oder LiCI einsetzbar, colorectal Krebs und Alzheimer-Krankheit zu behandeln. Schließlich ist die Studium der Phosphorylierung von Tau und Tau Mikrotubuli binden deutlich nicht nur relevant für Neurodegenerative Krankheiten, sondern auch für einige Chemotherapeutika weil Agenten, die Tau Mikrotubuli Bindung ändern dynamisch als Krebs untersucht werden Therapeutika51. Die hier vorgestellten Protokolle werden dazu beitragen, die Entdeckung und Entwicklung von neuen Therapeutika zur Behandlung von verschiedenen Tauopathies und Krebserkrankungen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durchgeführt im Rahmen des Projekts mit dem Titel "Entwicklung und Industrialisierung von hochwertigen kosmetischen Rohstoffen aus marine Mikroalgen", durch das Ministerium der Ozeane und Fischerei, Korea gefördert und durch einen intramuralen Grant (2Z04930 unterstützt wurde) KIST Gangneung Institute of Naturprodukte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
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