Summary
Este manuscrito descreve protocolos padrão para medir a tau hyperphosphorylation, medindo a vinculação de tau de microtúbulos e localização de tau intracelular após tratamentos com drogas. Estes protocolos podem ser usados repetidamente para triagem de drogas ou outros compostos que se destinam a ligação de hyperphosphorylation ou microtubule tau.
Abstract
O tau de proteína microtubule-associada é uma proteína neuronal que localiza-se principalmente em axônios. Geralmente o tau é essencial para o normal funcionamento neuronal porque está envolvido na estabilização e montagem de microtúbulos. Além de neurônios, tau é expresso em humana mama, próstata, gástrica, colorretal e cânceres pancreáticos, onde mostra a estrutura quase semelhante e exerce funções semelhantes como o tau neuronal. A quantidade de tau e sua fosforilação pode alterar o seu funcionamento como um estabilizador de microtúbulos e levar ao desenvolvimento de filamentos helicoidais emparelhados em doenças neurodegenerativas diferentes, tais como a doença de Alzheimer. Determinar o estado de fosforilação da tau e suas características de microtubule-ligação é importante. Além disso, examinar a localização intracelular do tau é importante em diferentes doenças. Este manuscrito detalhes protocolos padrão para medir a fosforilação da tau e tau vinculação de microtúbulos nas células de cancro colo-rectal com ou sem a curcumina e tratamento LiCl. Esses tratamentos podem ser usados para parar o desenvolvimento e proliferação de células cancerosas. Localização intracelular do tau é examinada com o uso de imuno-histoquímica e microscopia confocal enquanto estiver usando quantidades baixas de anticorpos. Estes ensaios podem ser usados repetidamente para compostos que afetam hyperphosphorylation tau ou vinculação do microtubule de triagem. Novela terapêutica usada para diferentes Tauopatias ou agentes anticancerígenos relacionados potencialmente podem ser caracterizados usando esses protocolos.
Introduction
Tau foi originalmente identificada como uma proteína associada a microtúbulos estável ao calor que estava co purificada com tubulina1. Tau é exclusivamente expressos em eucariontes superiores2,3,4. A principal função do tau é controlar microtubule montagem1,5,6. Também contribui para a polimerização de microtúbulos7, transporte axonal8, alterações no diâmetro axonal9, formação de neuroma polaridade e neurodegeneração10. Tau também atua como um andaime de proteína para controlar algumas vias de sinalização. Estudos do cérebro de rato sugerem que tau é neurônio-específica e que é principalmente localiza em axônios11. Porque tau é essencial para o desenvolvimento neuronal e polimerização de microtúbulos, tau era a hipótese de desempenhar um papel importante no desenvolvimento axonal no sistema nervoso central; mais tarde, esta hipótese foi verificada por experimentos in vitro e in vivo . Além dos neurônios, tau é expressa em células não-neuronais diferentes, incluindo fígado, rim e músculo células12,13. Tau é expressa também em humana mama, próstata, colorretal, gástrica e câncer pancreático célula linhas e tecidos14,15,16,17,18, 19. tau é também encontrado na miosite inclusão-corpo como torcida tubulofilaments em corpos de inclusão20.
Tau pode transportar várias modificações borne-translational. De todas as modificações borne-translational, fosforilação é a mais comum. Fosforilação da tau aumento diminui sua afinidade para os microtúbulos, finalmente, desestabilizando o citoesqueleto. Oitenta e cinco sítios de fosforilação têm sido descritos na proteína tau isolada de tecidos do cérebro humano a doença de Alzheimer. Desses sites, 53% constituem apenas 6% tirosina resíduos21,22,23, 41% de treonina e serina. Fosforilação da Tau afeta sua localização, função, ligação, solubilidade e sua susceptibilidade a outras modificações borne-translational. Também fosforilação de tau a mais do que na medida do normal (ou totalmente saturada com grupos fosfato) é conhecido como hyperphosphorylation que Replica as características estruturais e funcionais da doença de Alzheimer24. Tau mantém o bom funcionamento dos microtúbulos axonal e assegura o funcionamento neuronal normal sob condições fisiológicas. No entanto, hyperphosphorylated tau não consegue manter uma vinculação microtubule bem-organizado, causando perda neuronal por causa de desmontagem do microtubule. Níveis normais de fosforilação da tau são necessários para tau adequado funcionamento, mas tau não funcionar normalmente, se seu nível de fosforilação característico é alterada e se hyperphosphorylated25. Na doença de Alzheimer e algumas outras doenças neurodegenerativas relacionadas com a idade, tau torna-se hyperphosphorylated e forma filamentos helicoidais emparelhados e tangles neurofibrillary26,27. Assim, os métodos para determinar a fosforilação da tau e vinculação de microtúbulos são importantes.
Câncer colorretal, câncer um envelhecimento associada, é que o terceiro mais frequentemente diagnosticado cancro e o terceiro câncer proeminente causadores de morte para homens e mulheres28. Cancro colo-rectal é um dos principais cânceres causadoras de morte no mundo ocidental29. Porque tanto câncer colorretal e doença de Alzheimer estão associados com o envelhecimento e ambos acontecem principalmente em países desenvolvidos, onde as pessoas gostam de hábitos alimentares semelhantes, as duas doenças de alguma forma podem ser correlacionadas. Além disso, as células cancerosas positiva tau e tau respondem de forma diferente de agentes quimioterápicos, por exemplo, paclitaxel16.
A curcumina é um dos principais derivativos de Curcuma longa, açafrão especiaria indiana30. Durante séculos, as populações do Sul da Ásia consumiu cúrcuma em suas dietas em uma base diária. A curcumina é usada para tratar diferentes doenças, incluindo câncer colorretal, doença de Alzheimer, diabetes, fibrose cística, doença inflamatória intestinal, artrite, hiperlipidemia, aterosclerose e cardiopatia isquêmica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lítio também pode matar células de câncer colorretal ou impedir a sua proliferação39. Lítio também pode ser usado para tratar a doença de Alzheimer40 que diminui a agregação de tau e impede a sua hyperphosphorylation, como observado em um rato transgênico modelo41,42,43, 44.
Este manuscrito visa: 1) medir o tau total e os níveis de expressão de fosfo-tau em células tratadas; 2) descrevem um ensaio da fosfatase para medir global fosforilação da tau; 3) examinar microtubule-vinculação de tau; e 4) localizar tau pela microscopia confocal em linhas de células de câncer colorretal tratados com curcumina ou LiCl. Os resultados revelam que tratamento com células com curcumina, um supostamente bom agente quimioterapêutico para câncer de cólon, e tratamento com LiCl pode reduzir a expressão de ambos total tau fosforilada tau em linhas de células de câncer colorretal. Estes tratamentos também podem causar a translocação nuclear de tau. No entanto, inesperadamente, a curcumina falha melhorar a ligação do tau de microtúbulos.
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Protocol
1. preparação de reagentes
- Adicionar 10 µ l da solução de fluoreto de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da solução coquetel de inibidor de protease e 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da fosfatase solução de coquetel inibidor para 1 mL de 1 buffer de ensaio (RIPA) x radioimmunoprecipitation para preparar a Lise completa de RIPA.
- Preparar 10 x buffer buffer (PEM) de tubulina geral.
- Adicionar 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-ácido etanesulfónico, 10mm (95,1 mg) etileno glicol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic ácido, 10mm (51 mg) MgCl 2 e 1,25 M (3 mL de 10 M) NaOH em um tubo de 50 mL , misture com 15 mL de água destilada e dissolver usando um vórtice. Verifica o pH (deve ser 6,9). Se pH > 6,9, descartar o buffer e remake muito fresco.
Nota: NaOH deve ser abaixo de 1,25 M para garantir que o pH não superação 6,9. Não é aconselhável usar HCl para ajustar o pH > 6.9. - Adicionar NaOH gota a gota até pH 6,9. Adicione água destilada para fazer até 25 mL de tampão de PEM X 10. Finalmente, filtre usando uma seringa e um filtro de seringa 0,2 µm. Dividir esse buffer em alíquotas em tubos de 1,5 mL e armazene a 4 ° C.
- Adicionar 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-ácido etanesulfónico, 10mm (95,1 mg) etileno glicol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic ácido, 10mm (51 mg) MgCl 2 e 1,25 M (3 mL de 10 M) NaOH em um tubo de 50 mL , misture com 15 mL de água destilada e dissolver usando um vórtice. Verifica o pH (deve ser 6,9). Se pH > 6,9, descartar o buffer e remake muito fresco.
- Prepare 5 x tampão de amostra com um agente redutor e tintura.
- Mix 300 µ l (60 mM) de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) de glicerol a 50%, 1 mL (2%) de 10% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e 1,2 mL de água destilada para compensar a 5 mL de 5 x tampão de amostra SDS. Guarde este medicamento em − 20 ° C.
Nota: Porque o glicerol é viscoso, medindo 1,25 mL glicerol é difícil. 1 mL de glicerol 100% pesa 1,26 g. Assim, pesar 1,575 g de glicerol de 100% (que equivale a 1,25 mL de 100% ou 2,5 mL de glicerol a 50%) em um 15 mL tubo primeiro; Misture bem com os outros componentes.
- Mix 300 µ l (60 mM) de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) de glicerol a 50%, 1 mL (2%) de 10% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e 1,2 mL de água destilada para compensar a 5 mL de 5 x tampão de amostra SDS. Guarde este medicamento em − 20 ° C.
2. Cultura, o tratamento com curcumina ou LiCl tratamento e análise da expressão da proteína de célula
- Adicionar ~ 1 x 10 6 HCT 116 células em 100 mm pratos de cultura de tecidos contendo o mínimo essencial Media (MEM) suplementado com 10% de bovino fetal soro (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina. Depois de um dia de cultivo, células vão chegar a confluência de 60-70%.
Nota: O número de placas necessária depende do número de tratamentos descritos abaixo. - Quando as células alcançar confluência de ~ 65% (aproximada usando microscopia), remover o meio MEM suplementado e adicionar MEM isento de soro com 5 µM, 10 µM e 30 µM curcumina ou 25 mM, 50 mM e 100 mM LiCl. Incubar a 37 ° C por 24 h em um ambiente umidificado contendo 5% de CO 2.
- 24 h após o tratamento, lavar as células com 1 mL gelada fosfato salino (PBS) e raspe as células com uma espátula de célula. Transferência das células raspadas em 1,5 mL tubos de centrifuga e centrifugar durante 4 min a 1.800 x g a 4 ° C para obter célula Pelotas.
- Lisar as células, suspendendo as pelotas em 100 µ l de tampão RIPA completa a 4 ° C por 20 min enquanto grampeia regularmente os tubos. Proceda à sonicação as amostras brevemente.
- Centrifugar a célula homogenates em uma centrífuga de bancada a 22.570 x g por 20 min a 4 ° C. transferir os sobrenadantes para outros tubos etiquetados usando uma pipeta.
- Medir a concentração de proteína nos sobrenadantes pelo ensaio de Bradford 45 usando kits de ensaio-proteína comercial. Tampão de carregamento de gel de
- preparar amostras de concentração de proteína igual (10 µ g proteína/13 µ l da amostra) de lisados celulares com 4 X SDS. Preparado 4x do tampão de carregamento de gel de SDS fresco contendo 400 mM ditiotreitol (DTT).
Nota: Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas em − 20 ° C, se necessário. - Incubar as amostras em um bloco de calor a 100 ° C por 5 min. misturam as amostras usando um vórtice e esperem para refrigerá-los para ~ 10-15 min.
- Montar um sistema de eletroforese.
- Carga 10 µ g de proteína (13 µ l da amostra) por bem em um gel de poliacrilamida-SDS 10% por eletroforese (SDS-PAGE). Carregar a escada de peso molecular para o gel de uma faixa.
Nota: Como começa a electroforese, a escada de proteína irá resolver em bandas de proteínas de peso moleculares aparentes. Use essas bandas para estimar os pesos moleculares das bandas desconhecidas da proteína. - Depois de carregar as amostras, conectar os eletrodos positivos e negativos do sistema de electroforese para uma fonte de energia para manter uma tensão constante. Inicialmente, começa a 70 V por 20 min mover as amostras da proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução. Em seguida, aumentar a tensão para 125 V para aproximadamente 70-120 min até amostras e proteína escada chegam ao final do gel.
- Após a conclusão da electroforese, transferência do gel para uma membrana de polivinilideno difluoreto (PVDF) usando um sistema de eletroblotting molhado. Transferência para ~ 100 min a 100 V. bloco a membrana em 4% albumina de soro bovino (BSA) tampão de bloqueio para 90 min à temperatura de cerca de 25 ° C.
- Carga 10 µ g de proteína (13 µ l da amostra) por bem em um gel de poliacrilamida-SDS 10% por eletroforese (SDS-PAGE). Carregar a escada de peso molecular para o gel de uma faixa.
- Marcar o blot por cortá-lo do lado com a escada de peso molecular. Use uma folha de plástico transparente e um cortador afiado para cortar o Borrão. Preparar as soluções primárias-anticorpo (anti-tau a 1:5, 000; antifosfo-tau em 1:4, 000) e incube a mancha nesta solução a 4 ° C durante a noite.
- Após incubação durante a noite, lavar o Borrão para min 7 quatro vezes em solução tampão fosfato salino-Tween-20 (PBST).
- Preparar as soluções relevantes do secundário-anticorpo (cabra anticoelho ou anti-mouse IgG em 1:5, 000) e incubar o blot nesta solução para 90 min à temperatura de cerca de 25 ° C. lavagem em PBST quatro vezes, 7 min cada.
- Desenvolver o blot usando um kit de quimioluminescência de acordo com o fabricante ' recomendações de s. Cobrir a mancha usando um plástico transparente. Adquirir imagens de uma sistema para quimioluminescência com relevante software de imagem de quimioluminescência.
3. Ensaio de fosfatase
- tratar os lisados celulares (da etapa 2.5) com fosfatase alcalina no buffer de fosfatase alcalina.
- Para ambos controlam e amostras tratadas, prepare-se 20 µ l amostras contendo 20 µ g proteína total. Adicione o volume de lisados celulares que contém 20 µ g da proteína total, seguido de 2 µ l fosfatase alcalina buffer e fosfatase alcalina de 10 µ l. Adicionar água destilada para compensar a 20 µ l.
- Incubar as amostras a 37 ° C por 1 h. parar a reação pela adição de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a uma concentração final de 50 mM, ou adicionando ortovanadato de sódio (at 3 VO 4) em uma concentração final de 10 mM. A reação também pode ser interrompida por aquecimento a 75 ° C por 5 min.
- Antes de termina a incubação das amostras com fosfatase, preparar amostras de mesma concentração sem adicionar fosfatase para comparação com amostras tratadas fosfatase.
- Buffer de carregamento de gel de SDS X Add a 4 recentemente preparada contendo 400 mM DTT.
- Incubar as amostras em um bloco de calor a 100 ° C por 5 min. misturar as amostras usando um vórtice. Legal à temperatura de ~ 10-15 min.
- Montar um sistema de eletroforese para a execução de um gel de poliacrilamida de 10% por SDS-PAGE.
- Carga 10 µ g da proteína (13 µ l da amostra) por bem em um polyacry de 10%gel de lamide. Carregar a peso molecular escada.
- Após o carregamento da amostra, conectar os eletrodos positivos e negativos do sistema de electroforese para uma fonte de energia para manter uma tensão constante. Inicialmente, começa a 70 V por 20 min mover as amostras da proteína do gel de empilhamento para o gel de resolução. Em seguida, aumentar a tensão para 125 V e funcione o gel para aproximadamente 70-120 min até amostras e proteína escada chegam ao final do gel.
- Após a conclusão da electroforese, transferência do gel para uma membrana PVDF usando um sistema de eletroblotting molhado. Transferência para ~ 100 min a 100 V.
- Marcar o blot, fazendo um pequeno corte no lado da escada de peso molecular. Usar uma folha de plástico transparente e um cortador afiado para cortar o blot.
- Bloquear a membrana em tampão de bloqueio BSA 4% para 90 min à temperatura ambiente.
- Incubar o borrão na solução primária-anticorpo (anti-tau a 1:5, 000), a 4 ° C durante a noite. Lave o borrão em PBST quatro vezes, durante 7 min cada.
- Preparar a solução de anticorpo secundário relevante (cabra anti-mouse IgG em 1:5, 000) e incubar o Borrão para 90 min à temperatura ambiente. Lavar em PBST quatro vezes, durante 7 min cada.
- Desenvolver o blot usando um kit de quimioluminescência de acordo com o fabricante ' recomendações de s. Cobrir a mancha dentro de um envoltório de plástico transparente. Adquirir imagens de uma sistema para quimioluminescência com relevante software de imagem de quimioluminescência.
4. Ensaio do microtubule
- para o ensaio de ligação do microtubule, repita os passos 2.1-2.6.
- Preparar 1 X (2 mL) PEM de tampão de buffer de PEM X 10 armazenadas a 4 ° C, adicionando 20 µM (40 µ l) de paclitaxel e GTP (20 µ l) de 1 mM. Inventariar os microtúbulos (MT) de − freezer de 80 ° C e o estoque de trabalho Escherichia coli tau de − congelador de 20 ° C.
- Preparar amostras conforme tabela 1.
- Incubar a 37 ° C por 30 min. se a 25 ° C por 60 min a 100.000 x g.
- Transferência de 120 µ l de sobrenadantes contendo desassociada tau, limpar e rotulado tubos.
- Adicionar 120 µ l (mesmo volume que o sobrenadante) de 5 X buffer para a pelota contendo limite tau da amostra e misture bem. Transferir a solução para limpar tubos etiquetados e misture bem.
- Medir a concentração de proteína (ver passo 2.6).
Nota: Durante a preparação de amostras, use o volume de solução (etapa 4.6) para a preparação de amostras da pelota e o sobrenadante. - Preparar amostras de concentração da proteína equivalente e adicionar preparadas 4 x tampão de carregamento de gel de SDS contendo DTT (400mm).
Nota: As amostras podem ser armazenadas em − 20 ° C, nesta fase. - Repita os passos 3.5-3.10.
| amostra | nome | Microtubule necessário | principal proteína necessária | PEM-GTP-PTX | ||||
| 1 | HCT 116-controle (6.21 μg/μl) | 2 μl | 9,66 μl (60 μg) | μl de 108.34 | ||||
| μl 101.37 | 16.63 μl (80 μg) | 2 μl | doHCT 116-curcumina 10 μM (4.81 μg/μl) | 2 | ||||
| 3 | HCT 116-curcumina 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30.49 μl (100 μg) | μl 87.51 | ||||
| 4 | HCT 116-LiCl 25mm (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18.42 μl (100 μg) | μl 99.58 | ||||
| 5 | Escherichia coli tau | 2 μl | 1 μl Tau-352 | μl 117 | ||||
| 6 | MT apenas | 2 μl | X | μl 118 | ||||
| < td colspan = " 2"> | 120 μl de cada | |||||||
tabela 1: preparação para o ensaio do microtubule-vinculação da amostra.
5. localização e expressão de Tau após tratamento das pilhas com curcumina
- limpar uma lamela usando 70% de etanol e seque-o com um tecido de laboratório. Inserir uma lamela única em cada poço da placa rotulado 6-poços-cultura de tecidos. Coloque a placa em uma câmara de segurança biológica do armário e ligue um UV luz pelo menos 3 h.
- Subcultura das células e semente-los nos poços relevantes da chapa 6-poços em 2.5 x 10 5 células/poço no meio de cultura recomendado.
- ~ 24 h, depois de examinar as células com um microscópio invertido usando tanto o X 10 e 40 objetivos X para verificar se há alterações morfológicas celulares. Gravar fotos se necessário.
- Lavar as células duas vezes com PBS. Consertar as células em 3,7% de formaldeído em uma incubadora de 37 ° C no escuro.
Nota: Fixação por formaldeído à temperatura funciona bem, também. Usar equipamento de protecção adequado ao manusear formaldeído. - Lavar as células em PBS. Consertar as células em metanol gelada no − 20 ° C durante 15 min. Permeabilize as células incubando-os em 3% BSA e 0,1% Triton X-100 em PBS no gelo durante 10 min. Lave as células com PBS.
- Incube as celulas em tampão de bloqueio (3% de BSA e 0.1% Tween-20 em solução de PBS) por 1h à temperatura ambiente.
Nota: Incubação durante 2 h a 4 ° C funciona bem, também. - Preparar a solução primária-anticorpo (anti-tau em 1: 200) em BSA 3% e 0,1% Tween-20 em PBS (por exemplo, 2 µ l tau-13 anticorpo em 0,4 mL de tampão).
- Cortar pequenos pedaços de um PVDF membrana para que as peças se encaixam dentro de cada poço da placa de 6-poços; mergulhe-os em água por 5 min. lugar o corte PVDF em cada poço.
- Adicionar 60 µ l de solução de anticorpo primário para o corte de peças PVDF em cada poço. Coloque as lamelas tal que as células podem tocar a solução primária-anticorpo. Incube a 4 ° C, numa câmara escura, úmida, durante a noite. Lavagem em PBS quatro vezes.
- Prepare a solução anticorpo secundário (conjugada com fluoresceína 594 anti-mouse IgG em 1: 400) em 3% BSA e 0.1% Tween-20 em PBS.
- Cortar pequenos pedaços de uma membrana PVDF, de modo que as peças encaixam-se dentro de cada poço da placa de 6-bem e mergulhe-os em água por 5 min. lugar o corte PVDF em cada poço.
- Adicionar 80 µ l da solução para cada uma das peças PVDF na placa 6-poços-anticorpo secundário. Coloca a lamela tal que as células podem tocar a anticorpo secundário solução. Incubar em uma câmara escura, úmida à temperatura ambiente por 2 h. lavagem com PBS quatro vezes.
- Montar amostras no meio de montagem com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e corrigir as lamelas em lâminas de vidro.
- Adicionar uma gota do meio de montagem com DAPI em lâminas de vidro. Remover as lamelas de cada poço e colocá-los nas corrediças de vidro contendo o meio de montagem com DAPI. Certifique-se de que a superfície de cada lamela contendo células coradas toca o mounmédio de Ting do slide de vidro correspondente.
- Aplicar esmalte ao redor cada lamela para selar e corrigi-los hermético nas corrediças de vidro. Se necessário, fazer essa etapa duas vezes.
- Incubar por 1,5 h em temperatura ambiente em uma câmara escura.
- Examinar os slides usando um microscópio confocal, usando óleo de imersão sobre a lamela em uma sala escura.
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Representative Results
Analisou-se a expressão de fosfo-tau e tau total após o tratamento das células com diferentes concentrações de curcumina ou LiCl (Figura 1). Tratamento das células com as três diferentes concentrações de curcumina diminuiu níveis de expressão de tau; no entanto, expressão fosfo-tau aumentou após o tratamento com baixa concentração de curcumina mas diminuiu após tratamento de células com altas concentrações de curcumina. Antifosfo-tau (Ser396) foi utilizada para detecção de fosfo-tau. Níveis de fosfo-tau e tau total diminuíram após o tratamento das células com as três diferentes concentrações de LiCl (Figura 1). Pesquisas anteriores haviam demonstrado que os níveis de expressão de tau variam em tipos diferentes de câncer e em locais diferentes, os mesmos tipos de câncer. Dados anteriores sobre câncer colorretal mostram que tau foi expressa em duas linhas celulares (HCT 116 e SW480) de câncer colorretal que eram também fosforilada19. Fosfo-tau em células tratadas com 5 µM de curcumina eram mais elevados do que aqueles em células não tratadas. Fosfo-tau eram superiores a tau total nas células tratadas com a mesma concentração de curcumina. Tratamento das pilhas com 10 µM de curcumina diminuiu níveis de fosfo-tau em comparação com células não tratadas, mas expressão fosfo-tau foi ainda mais do que total tau níveis de expressão. Tratamento das células com 30 µM curcumina reduziu fosfo-tau expressão comparado com fosfo-tau em células não tratadas e tau total níveis nas células tratadas mesmos.
Este manuscrito estabeleceu um protocolo de fácil para avaliar o status de fosforilação da tau por um ensaio de fosfatase (Figura 2). Após o tratamento de curcumina, fosforilação da tau total não se alterou significativamente e fosforilação em resíduos de aminoácidos específicos foi significativo (Figura 1). No geral fosforilação da tau foi interrompida em células tratadas com LiCl em comparação com células não tratadas. Amostras tratadas fosfatase electrophoresed mais rápido do que as amostras não tratadas, verificar que as amostras não tratadas foram hyperphosphorylated mais do que amostras tratadas fosfatase. Células tratadas curcumina mostraram quase os mesmos resultados, indicando que o tratamento de linhas de células de câncer colorretal não reduz a fosforilação da tau como mostrado na Figura 1. Amostras de fosfatase-tratados e não tratadas electrophoresed quase o mesmo intervalo no amostras de células tratadas com LiCl, indicando que a fosforilação tau nestas células foi reduzido (Figura 2). Aqui, concentrações elevadas (20 µM ou 30 µM) de amostras de curcumina-tratados foram levadas para comparar o status geral de fosforilação, como baixa concentração tratamento mostrou maior site-specific fosforilação revelada pelo anticorpo específico fosfo-tau (S396).
Além disso, neste laboratório, o ensaio de ligação do microtubule de amostras de células foi estabelecido com êxito usando o tau-352 como um controle positivo e só MT como um controle negativo (Figura 3). Para tanto a curcumina e o tratamento de LiCl, actividade de microtubule-ligação foi inibida, como demonstrado pelo ensaio do microtubule. Neste experimento, curcumina tratamento não mostrou microtubule recursos de vinculação, mas inibiu a ligação semelhante ao que em anteriores estudos46,47, Considerando que foi eficaz inibir a fosforilação da tau site-specific no maior concentração. Na Figura 1, tratamento de curcumina 10 µM resultou na expressão mínima de fosfo-tau comparado com controle mas a expressão mais elevada do que tau total. No entanto, capacidade de tau de câncer colorretal após tratamento de curcumina microtubule-ligação, bem como a baixa concentração de LiCl tratamento diminuiu na amostra não tratada. Site-specific tau fosforilação efeitos microtubule vinculação e auto-agregação48. Fosforilação da Tau na região rica em prolina impedido microtubule-ligação Propriedades Considerando que a região C-terminal aumentado essas propriedades, e ambas as regiões, juntamente com a região de MT-ligação diminuiu suas propriedades de ligação em cerca de 70% e desordenada do microtúbulos48. Alguns outros fatores, bem como outra site-specific fosforilação da tau pode estar envolvida por esta desestabilização do microtubule de câncer colorretal tau tratado com curcumina ou LiCl.
Um protocolo simples usando pequenas quantidades de anticorpos primários e secundários habilitado localização do tau em linhas de células de câncer colorretal após o tratamento de curcumina (Figura 4). Os resultados mostraram que tau tinha translocados para o núcleo após o tratamento de curcumina, uma constatação semelhante aos anteriores estudos relatando que tau nuclear é um jogador chave na proteção neuronal de DNA em doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer49 ,50.
Figura 1: fosfo-tau e Tau expressão em células de cancro colo-rectal, seguindo a curcumina ou tratamento LiCl. Amostras extraídas células controle ou células tratadas durante 24 h com três diferentes concentrações de curcumina (A) e (B) LiCl foram resolvidas em gel de poliacrilamida de 10% por SDS-PAGE e analisadas com anticorpo anti-tau ou antifosfo-tau. Densitometria análises dos resultados borrão ocidental são apresentadas no painel direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: global fosforilação da tau em não tratada ou tratada diferencialmente amostras de células detectadas pelo ensaio de fosfatase. Lanes estranhos mostram controle celular extratos, Considerando que pistas mesmo mostram tratamento fosfatase de curcumina-tratados ou tratados com LiCl amostras. Tratamento de fosfatase feita a mobilidade electrophoretic tau mais rápido do que as amostras não tratadas, que continha tau fosforilada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: vinculação de Microtubule de tau em células de cancro colo-rectal detectado pelo ensaio do microtubule. Controle HCT 116 amostras de células, a curcumina-tratados, ou amostras de células tratadas LiCl e tau de e. coli foram incubados com microtúbulos como detalhado no protocolo seção 4. Quantidades equivalentes de sobrenadante (S) e frações de pelota (P) foram immunoblotted com um anticorpo anti-tau. Pistas de controlo negativo contendo apenas MT foram executadas para confirmar que MT não continha qualquer limite tau endógena. Painel inferior mostra densitometria análises de Western blots de amostras individuais, permitindo a comparação entre o sobrenadante (desacoplado tau) e frações de pelota (limite tau). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Localização de proteína Tau examinada pelo mic confocalroscopy.
Tau localizado perifericamente para o nucléolo, em células de câncer colorretal. Painéis esquerdos mostram localização tau detectada utilizando o anticorpo monoclonal anti-tau Considerando que meio painéis mostram núcleo coloração por DAPI. Exemplos representativos de células tratadas mostrando translocação tau para o núcleo também são mostrados. Células de controle mostraram tau, principalmente ao redor e fora dos núcleos, Considerando que tau em células tratadas também localizadas dentro dos núcleos. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este manuscrito estabeleceu diferentes condições processuais para a detecção de tau total e fosforilada tau em células de cancro colo-rectal, tratados com curcumina e LiCl. Para avaliar o status geral de fosforilação da tau em amostras da proteína, foi descrito um ensaio da fosfatase. Este ensaio potencialmente pode ser usado para examinar o status de fosforilação de proteínas.
Este ensaio é baseado no princípio de que fosforilado proteína movimentos mais lento do que o seu estado não-fosforilada. Fosfatase alcalina e buffer de fosfatase alcalina são utilizados no presente protocolo. Depois de adicionar os componentes de ensaio para os lisados celulares, as amostras devem ser incubadas para uma duração específica ideal a uma temperatura específica. Após a incubação, as amostras devem ser fervidas no tampão de amostra SDS para parar a reação. Anteriormente, diferentes protocolos experimentais podem ter sido usados para avaliar a vinculação do tau de microtúbulos. O ensaio do microtubule apresentado aqui é fácil de executar ao mesmo tempo, incluindo controles positivos e negativos para fornecer garantia de qualidade usando frações sobrenadante e sedimento. O controlo negativo somente MT foi utilizado para verificar que MT não contém qualquer limite tau endógena. Além disso, o tau humano puro-352, utilizou-se um tau de microtubule-ligação como controlo positivo. Para separar a fração de ligação de microtúbulos (pellet) a centrifugação de ultra velocidade (sobrenadante) vinculativa fração foi usado; Este procedimento pode ser uma limitação, porque tal um se é caro e não está amplamente disponível. Além disso, como baixas quantidades de amostras são usadas, longo, tubos de centrífuga fina com adaptadores são necessários para o uso no rotor se. Embora seja possível para re-utilizar tais tubos, uso único é aconselhável para evitar contaminação cruzada. Finalmente, uma vantagem do protocolo tau-localização é que são necessárias apenas pequenas quantidades de anticorpos primários e secundários. Após a fixação, permeabilização e bloqueio do aderente de células de lamelas, uma pequena gota de anticorpo foi depositada em um pequeno pedaço de PVDF, que foi então colocado dentro dos poços de uma placa de 6. As lamelas foram mantidas tal que o anticorpo pode acessar as células. Usando este protocolo, a quantidade de anticorpos usados pode ser minimizada.
Algumas precauções devem ser mantidas em mente para garantir resultados confiáveis e quantificáveis. Em primeiro lugar, rigorosas técnicas assépticas devem ser usadas para evitar a contaminação em culturas de células, e a célula extrai. A Lise completa de RIPA deve ser preparada fresca. No ensaio de fosfatase, é importante ferver as amostras por 3 min e SDS-PAGE de começar imediatamente após a incubação das amostras da fosfatase-tratados e não tratadas. Tau-352 deve ser dividido em pequenas alíquotas e mantidas no gelo após remoção do freezer −20 ° C e depositados volta no freezer imediatamente após o uso. Após a remoção da −80 º C, MT estoques devem ser mantidos no gelo se reutilizado dentro de 72 h; caso contrário, mantê-los em temperatura ambiente. O buffer PEM deve ser preparado como um 10 x solução concentrada porque o buffer de 1 x precisa ser feita recentemente quando GTP e paclitaxel são adicionados.
Funções de Tau são reguladas pela extensão de sua fosforilação. Tau hyperphosphorylation não ocorre em tau do cérebro de um adulto normal semelhante ao tau-352, que foi usado como controle positivo no ensaio de microtubule-ligação. No entanto, tau hyperphosphorylation ocorre em doenças neurodegenerativas. Este protocolo e subsequentes resultados demonstram que linhas de células humanas de câncer colorretal também levar tau fosforilada, semelhante ao que nos cérebros de doença de Alzheimer. Tratamento com altas doses de curcumina e especialmente LiCl pode minimizar a fosforilação da tau. Assim, uma boa correlação entre as doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer e câncer colorretal pode existir em relação ao tau hyperphosphorylation e curcumina ou LiCl pode ser usado para tratar a doença de Alzheimer e câncer colorretal. Por último, estudar a fosforilação da tau e tau microtubule vinculação é significativamente relevante não apenas para doenças neurodegenerativas, mas também para alguns chemotherapeutics porque agentes que modificam a vinculação do microtubule tau dinamicamente são estudados como câncer terapêutica51. Os protocolos aqui apresentados potencialmente ajudará a descoberta e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para tratar cancros e Tauopatias diferentes.
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Disclosures
Os autores declaram que eles não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi realizada como parte do projeto intitulado 'Desenvolvimento e industrialização de matérias primas cosméticas de alto valor de microalgas marinhas', financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, Coreia e foi apoiado por uma subvenção intramural (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de produtos naturais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
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