Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

Published: October 10, 2017 doi: 10.3791/55932
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

Summary

Bu el yazması tau hyperphosphorylation, tau bağlama mikrotübüller ve hücre içi tau ilaç tedavileri takip yerelleştirilmesini ölçme ölçmek için standart iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller sürekli uyuşturucu ya da tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama hedef diğer bileşikler eleme için kullanılabilir.

Abstract

Mikrotubul ilişkili protein tau çoğunlukla akson yerelleştirir nöronal bir proteindir. Genellikle tau Mikrotubul derleme ve sabitleme yer çünkü normal nöronal işleyişi için gereklidir. Nöronlar yanı sıra, tau insan meme, prostat, mide, kolorektal ve nerede neredeyse benzer yapısını gösterir ve benzer işlevleri nöronal tau giderek artan pankreas kanserleri ile ifade edilir. Tau ve onun fosforilasyon miktarı onun işlevini mikrotübüller sabitleyici değiştirin ve Alzheimer hastalığı gibi farklı nörodejeneratif hastalıklarda eşleştirilmiş Helisel filamentler gelişmesine yol. Tau ve Mikrotubul bağlama özellikleri fosforilasyon durumunu belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, tau hücre içi lokalizasyonu inceleyerek farklı hastalıklarda önemlidir. Tau fosforilasyon ve mikrotübüller kolorektal kanser hücreleri veya curcumin ve LiCl tedavi olmadan içinde tau bağlama ölçmek için bu el yazması detayları standart iletişim kuralları. Bu tedaviler kanser hücre çoğalması ve geliştirme durdurmak için kullanılabilir. Hücre içi tau yerelleştirilmesini immünhistokimya ve confocal mikroskobu antikorlar düşük miktarda kullanırken kullanarak incelenir. Bu deneyleri hkr tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama etkileyen bileşikler eleme için kullanılabilir. Roman therapeutics için farklı tauopathies kullanılan veya bu iletişim kurallarını kullanarak ilgili antikanser ajanların potansiyel olarak karakterize edilebilir.

Introduction

Tau aslında tübülin1ile birlikte saf bir ısı-kararlı Mikrotubul ilişkili protein olarak tespit edilmiştir. Tau sadece daha yüksek Ökaryotlar2,3,4' te ifade edilir. Tau ana fonksiyonu Mikrotubul derleme1,5,6kontrol etmektir. Ayrıca mikrotübüller7, aksonal transport8, aksonlar çapı9değişimler, nöroma polarite ve ateş10polimerizasyon için katkıda bulunur. Tau da bazı sinyal yolları kontrol etmek için bir protein iskele davranır. Sıçan beyin çalışmalar önermek o tau nöron özel ve akson11' öncelikle yerelleştirir. Tau Mikrotubul polimerizasyon ve nöronal gelişim için gerekli olduğundan, tau merkezi sinir sistemi aksonal gelişiminde önemli bir rol oynamaya onaylanmadığına karar; Bu hipotez sonraki vitro ve in vivo deneyler tarafından doğrulanmadı. Nöronlar yanı sıra, karaciğer, böbrek ve kas hücreleri12,13de dahil olmak üzere farklı nöronal olmayan hücrelerde, tau ifade edilir. Tau da insan meme, prostat, kolorektal, mide ve pankreas kanseri hücre satırları ve dokular14,15,16,17,18, ifade edilir 19. tau da dahil organları20bükülmüş tubulofilaments olarak dahil-vücut miyozit içinde bulundu.

Tau birkaç translasyonel modifikasyonlar taşıyabilir. Tüm translasyonel modifikasyonlar fosforilasyon yaygın olarak kullanılır. Artan tau fosforilasyon mikrotübüller, nihayet sitoiskeleti istikrarsızlaştırıcı için onun ilgi azalır. Seksen beş fosforilasyon siteleri insan Alzheimer hastalığı beyin dokulardan izole tau protein tarif edilmistir. Bu siteleri, serin, % 41 treonin ve sadece % 6 tirozin kalıntıları21,22,%2353 teşkil etmektedir. Tau fosforilasyon onun yerelleştirme, fonksiyon, bağlama, çözünürlük ve diğer translasyonel modifikasyonlar, duyarlılık etkiler. Ayrıca tau fosforilasyon normal ölçüde daha (veya fosfat grupları ile tam doygun) Alzheimer hastalığı24yapısal ve işlevsel özellikleri çoğaltır hyperphosphorylation bilinir. Tau aksonal mikrotübüller düzgün tutar ve normal nöronal fizyolojik koşullar altında çalışmasını sağlar. Ancak, hyperphosphorylated tau Mikrotubul sökme nedeniyle nöronal kaybına neden bir iyi organize edilmiş Mikrotubul bağlama korumak başarısız olur. Tau fosforilasyon normal düzeyde uygun tau işleyişi için gereklidir, ancak tau karakteristik fosforilasyon seviyesine bir değişiklik yapıldığında ve hyperphosphorylated25ise normal işlevine başarısız olur. Alzheimer hastalığı ve bazı diğer yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıklar, tau hyperphosphorylated olur ve eşleştirilmiş Helisel filamentler ve neurofibrillary tangles26,27oluşturur. Böylece, tau fosforilasyon ve Mikrotubul bağlama belirlemek için önemli yöntemlerdir.

Kolorektal kanser, bir yaşlanma ilişkili kanser üçüncü en sık kanser ve ölümüne neden olan üçüncü önde gelen kanser hem erkek hem de kadınlar için28tanısı var. Kolorektal kanser Batı dünyasının29ana ölümüne neden olan kanser biridir. Kolorektal kanser ve Alzheimer hastalığı yaşlanma ile ilişkili olan ve her ikisi de nerede insanlar benzer beslenme alışkanlıkları zevk gelişmiş ülkelerde özellikle oldu çünkü iki hastalık bir şekilde ilişkili. Buna ek olarak, tau-pozitif ve negatif tau kanser hücrelerinin farklı yanıt kemoterapötik ajanlar, örneğin, Paklitaksel16için.

Curcumin Curcuma longa, Hint baharat zerdeçal30ana türevleri biridir. Yüzyıllar boyunca, Güney Asya nüfus zerdeçal günlük olarak besinlerinde tüketilen sahip. Curcumin kolorektal kanser, Alzheimer hastalığı, şeker hastalığı, Kistik fibrozis, inflamatuvar barsak hastalığı, artrit, hiperlipidemi, ateroskleroz ve iskemik kalp hastalığı31, de dahil olmak üzere farklı hastalıkları tedavi etmek için kullanılır 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lityum veya kolorektal kanser hücrelerini öldürmek de onların nükleer silahların yayılmasına karşı39önlemek. Lityum de tau toplama azalır ve onun hyperphosphorylation bir transgenik fare modeli41,42,43gözlemlediği gibi engeller olarak Alzheimer hastalığı40 tedavi etmek için kullanılabilir, 44.

Bu el yazması amaçlamaktadır: 1) ölçü toplam tau ve fosfo-tau ifade seviyelerinde işlem görmüş hücreleri; 2) genel tau fosforilasyon ölçmek için bir fosfataz tahlil tarif; 3) tau Mikrotubul bağlama incelemek; ve 4) kolorektal kanser hücre çizgiler curcumin veya LiCl ile tedavi confocal mikroskobu tarafından tau yerelleştirilmesine. Sonuçları curcumin ile hücre tedavi, hangi kolon kanseri için sözde iyi bir kemoterapötik Ajan ve tedavi LiCl ile her iki toplam tau ifade azaltabilir ve tau kolorektal kanser hücre hatlarında fosforile olduğunu ortaya koyuyor. Bu tedaviler de tau nükleer translocation neden olabilir. Ancak, beklenmedik bir şekilde, curcumin tau mikrotübüller için bağlama geliştirmek başarısız olur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. reaktifler hazırlık

  1. Ekle 10 µL (1 mM) phenylmethylsulfonyl florür çözüm, 10 µL (1 x 100 x stoktan) proteaz inhibitörü kokteyl çözüm ve 10 µL (1 x 100 x stoktan) fosfataz inhibitörü kokteyl çözüm 1 x radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabelleği tam RIPA lizis arabellek hazırlamak için 1 ml.
  2. Hazırla 10 x genel tübülin arabellek (PEM) arabellek.
    1. Ekle 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic asit, 10 mM (95,1 mg) etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic asit, 10 mM (51 mg) MgCl 2 ve 1.25 M (10 M 3 mL) NaOH bir 50 mL tüp , mix 15 mL distile su ile ve bir girdap kullanarak geçiyoruz. (6,9 olmalıdır) pH kontrol edin. Eğer pH > 6,9, arabellek atmak ve taze çok remake.
      Not: NaOH bu pH 6,9 aşma değil emin olmak için 1.25 M olmalıdır. HCl pH ayarlama için kullanmak için tavsiye değil > 6,9.
    2. Dropwise pH 6,9 olana Ekle NaOH. 10 X PEM arabellek ilâ 25 mL distile su ekleyin. Son olarak, bir şırınga ve 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre uygulama. Bu arabellek aliquots 1,5 mL tüpler içine bölmek ve depolamak saat 4'te ° C.
  3. Hazırla 5 örnek arabellek indirgeyici ve boya ile x.
    1. Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-5 mL 5 x SDS örnek arabellek de makyaj HCl (pH 6.8), 2.5 mL (% 25) % 50 gliserol, % 10 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), 1.2 mL distile su ve 1 mL (% 2). Mağaza − 20 ° c
      Not: gliserol viskoz olduğu için ölçüm 1,25 mL gliserol zordur. Bir mL % 100 gliserol 1.26 g ağırlığında. Böylece, % 100 gliserol 1,575 g tartmak (hangi eşittir %100 1,25 mL veya 2.5 mL % 50 gliserol) bir 15 mL tüp ilk; Mix de diğer bileşenlerle.

2. Hücre kültürü, Curcumin tedavisi veya LiCl tedavi ve muayene Protein ifade

  1. Ekle ~ 1 10 6 HCT 116 hücreleri x 100 mm içine doku kültürü yemekleri ile % 10 fetal sığır takıma en az temel medya (MEM) içeren Serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin. Kültür bir gün sonra hücrelerin % 60-70 izdiham ulaşacaktır.
    Not: Aşağıda açıklanan tedaviler Sayısı Tabaklar gerekli sayısını bağlıdır.
    2. Hücreleri (mikroskopi kullanarak yaklaşık olarak) ~ %65 izdiham ulaşmak, takıma MEM orta kaldırıp serum ücretsiz MEM 5 mikron, ile 10 µM ve 30 µM curcumin veya 25 mM, 50 mM, 100 mM LiCl eklediğinizde
  2. . Oksijen bir atmosferde % 5 CO 2 içeren 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. 24 saat sonra tedavi, 1 mL buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) hücrelerle yıkama ve hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazımak. Alıntı hücrelerin içine 1,5 mL tüpler santrifüj kapasitesi ve santrifüj kapasitesi 1.800 x g 4 ° C'de hücre granül elde etmek için de 4 dk için transfer.
  4. Düzenli olarak tüpler dokunarak süre içinde tam RIPA arabelleği için 20 dk 4 ° C'de 100 µL granül askıya tarafından hücreleri parçalayıcı. Kısaca örnekleri solüsyon içeren temizleyicide.
  5. Hücre homogenates 22,570 x g de benchtop santrifüj 20 dakika içinde 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants bir pipet kullanarak etiketli diğer tüpler.
  6. Supernatants protein konsantrasyonu ticari protein-tahlil Kitleri kullanarak Bradford tahlil 45 tarafından tedbir.
  7. Hazırlama örnekleri eşit protein konsantrasyonu (10 µg protein/13 µL örnek) hücre lysates ile 4 X SDS jel-yükleme arabellek. 4 x SDS jel-yükleme arabellek 400 mM dithiothreitol (DTT) içeren taze hazırlanan.
    Not: Bu aşamada, örnekleri, saklanabilecek olan − 20 ° C gerekirse.
  8. Örnekleri 5 dakika süreyle 100 ° C'de ısı blokta bir girdap kullanarak örnekleri Mix ve onları ~ 10-15 için soğumasını bekleyin Incubate dk.
  9. Araya bir Elektroforez Sistemi.
    1. Yük 10 µg protein (13 µL örnek) başına % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) için iyi. Molekül ağırlıklı merdiveni tek şeritli jöleye üzerine yük.
      Not: Elektroforez başlatılırken, protein merdiven belirgin moleküler ağırlık protein grupları çözümler. Moleküler ağırlık bilinmeyen protein gruplarından tahmin etmek için bu bantları kullanın.
    2. Örnekleri yükledikten sonra pozitif ve negatif elektrotlar Elektroforez Sistemi sabit voltaj korumak için bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, 70 V 20 dk için protein örnekleri yığın jel çözme jel taşımak başlangıç. Örnekleri ve protein merdiven jel sonuna ulaşana kadar sonra 125 V yaklaşık 70-120 min için voltajı yükseltin.
    3. Islak electroblotting sistemini kullanarak polivinilidin difluoride (PVDF) membran Jel Elektroforez tamamlanmasından sonra transfer. ~ 100 dk 100 blok V. için 25 90 dakika oda sıcaklığında %4 sığır serum albumin (BSA) engelleme arabellekte membran aktarım ° C.
  10. Leke molekül ağırlıklı merdiven yanında keserek işaretleyin. Şeffaf plastik levha ve keskin kesici leke kesim için kullanın. İlköğretim-antikor Çözümleri (1:5, 000 Anti-tau; anti-fosfo-tau 1:4, 000) hazırlamak ve bu çözüm 4 ° C'de blot gecede kuluçkaya.
  11. Gecede kuluçka sonra leke 7 min için dört kez fosfat tamponlu tuz-ara-20 (PBST) çözümde yıkayın.
  12. İlgili ikincil-antikor Çözümleri (keçi Anti-tavşan ya da anti-fare IgG 1:5, 000) hazırlamak ve leke dört kez, 7 dk PBST yaklaşık 25 ° C. makinaya 90 dakika oda sıcaklığında Bu çözümde kuluçkaya.
  13. Geliştirmek üreticiye göre bir Kemiluminesan kit kullanarak leke ' s öneriler. Şeffaf plastik wrap kullanarak leke kapsar. Görüntüleri görüntüleme sistemi ile ilgili yazılım Kemiluminesan için bir Kemiluminesan tarafından elde.

3. Fosfataz tahlil

  1. (Kimden adım 2.5) hücre lysates ile alkalen fosfataz alkalen fosfataz arabellekte tedavisi.
    1. İçeren 20 µg toplam protein hem de kontrol ve tedavi örnekleri, 20 µL hazırlamak için örnekler. Ardından 2 µL alkalen fosfataz arabellek ve 10 µL alkalen fosfataz 20 µg toplam protein içeren hücre lysates hacmi ekleyin. Kadar 20 µL distile su ekle.
  2. 1 h. durdurmak 50 mM son bir konsantrasyon ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyerek veya sodyum orthovanadate (Na 3 VO 4) 10 mM son bir konsantrasyon ekleme için tepki örnekleri 37 ° C'de kuluçkaya. Tepki de Isıtma 75 ° c 5 dakika süreyle tarafından durduruldu
  3. Fosfataz örnekleriyle kuluçka bitirmeden önce aynı toplama örnekleri fosfataz fosfataz tedavi örnekleri ile karşılaştırma için eklemeden hazırlayın.
  4. Ekle taze hazırlanmış 4 X SDS jel-yükleme arabellek içeren 400 mM DTT.
  5. Bir girdap kullanarak örnekleri örnekleri 5 dk. Mix için 100 ° C'de ısı blokta kuluçkaya. Serin için oda sıcaklığında ~ 10-15 dk.
  6. % 10 polyacrylamide jel SDS-PAGE tarafından çalıştırmak için bir Elektroforez Sistemi montajı.
    1. % 10 polyacry iyi başına yük 10 µg protein (13 µL örnek)lamide jel. Molekül ağırlıklı merdiveni yük.
    2. Örnek yükledikten sonra pozitif ve negatif elektrotlar Elektroforez Sistemi sabit voltaj korumak için bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, 70 V 20 dk için protein örnekleri yığın jel çözme jel taşımak başlangıç. Daha sonra 125 V gerilim artırmak ve örnekleri ve protein merdiven jel sonuna ulaşana kadar yaklaşık 70-120 dakika için jel çalıştırın.
    3. Islak electroblotting sistemini kullanarak PVDF membran üzerine Jel Elektroforez tamamlanmasından sonra transfer. Aktarım için ~ 100 dk 100 V.
    4. Leke küçük molekül ağırlıklı merdiven üstünde belgili tanımlık yan kesim yaparak mark. Leke kesim için şeffaf plastik levha ve keskin kesici kullanın.
  7. % 4 BSA engelleme arabelleği 90 dakika oda sıcaklığında membran engellemek.
  8. Gecede İlköğretim-antikor çözümü (1:5, 000 Anti-tau) 4 ° C'de blot kuluçkaya. Leke PBST içinde dört kez, 7 dk her yıkayın.
  9. İlgili ikincil-antikor çözüm (keçi Anti-fare IgG 1:5, 000) hazırlamak ve 90 dakika oda sıcaklığında leke kuluçkaya. PBST içinde dört kez, 7 dk her yıkayın.
  10. Geliştirmek üreticiye göre bir Kemiluminesan kit kullanarak leke ' s öneriler. Leke içinde şeffaf plastik bir şal örtmek. Görüntüleri görüntüleme sistemi ile ilgili yazılım Kemiluminesan için bir Kemiluminesan tarafından elde.

4. Mikrotubul bağlama tahlil

  1. Mikrotubul bağlama tahlil için adımları yineleyin 2.1-2.6.
  2. Hazırla 1 X 10 X PEM arabellek (2 mL) PEM arabelleğinden 4 ° C'de 20 µM (40 µL) Paklitaksel ve 1 mM (20 µL) GTP ekleyerek saklı. Mikrotubul üzerinden (MT) hisse senedi almak − 80 ° C dondurucu ve E. coli tau çalışma stoktan − 20 ° C dondurucu.
  3. Hazırlamak örnekleri göre Tablo 1.
  4. 37 ° C'de 30 dk. Ultracentrifuge 60 dk az 100.000 x g için 25 ° c için kuluçkaya.
  5. İçeren supernatants transfer 120 µL tau temizlemek için ilişkisiz ve tüpler etiketli.
  6. 5 X 120 eklemek µL (aynı birim olarak süpernatant) ilişkili tau içeren Pelet arabelleğe örnek ve iyice karıştırın. Etiketli tüpler temiz ve iyice karıştırın çözüm transfer.
  7. Ölçmek protein konsantrasyonu (bkz. Adım 2.6).
    Not: örnekleri hazırlarken, çözüm (Adım 4.6) hacmi Pelet hem süpernatant örnekleri hazırlamak için kullanın.
  8. Hazırlamak eşdeğer protein konsantrasyonu örnekleri ve taze hazırlanmış 4 x SDS jel-yükleme arabellek DTT (400 mM) içeren ekleyin.
    Not:-Ebilmek var olmak stok örnekleri, −, bu aşamada 20 ° C.
  9. 3.5-3.10 adımlarını yineleyin.
< td colspan = " 2">
örnek adı gerekli mikrotubul ana Protein gerekli PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-kontrol (6.21 μg/μl) 2 μl 9.66 μl (60 μg) 108.34 μl
2 HCT 116-Curcumin 10 mikron (4,81 μg/μl) 2 μl 16.63 μl (80 μg) 101.37 μl
3 HCT 116-Curcumin 20 mikron (3.28 μg/μl) 2 μl 30.49 μl (100 μg) 87.51 μl
4 HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) 2 μl 18.42 μl (100 μg) 99.58 μl
5 E. coli tau 2 μl 1 μl Tau-352 117 μl
6 MT sadece 2 μl X 118 μl
120 μl

Tablo 1: örnek Mikrotubul bağlama tahlil için hazırlık.

5. Yerelleştirme ve ifade Tau Curcumin içeren hücreleri tedavi sonra

  1. % 70 etanol kullanarak bir coverslip temiz ve kuru bir laboratuvar doku kullanarak. Bir tek coverslip etiketli 6-iyi doku kültürü plaka her kuyuya yerleştirin. Plaka biyolojik bir emniyeti dolap yerleştirin ve UV ışığı en az 3 h. geçiş
  2. Alt kültür hücreleri ve onları 2. 5 x 10 5 hücreleri/iyi önerilen kültür ortamında, 6-şey plaka ilgili kuyu tohum.
  3. ~ 24 h sonra hücresel morfolojik değişiklikleri denetlemek için X 10 ve 40 X hedefleri kullanarak ters bir mikroskop kullanarak hücreleri incelemek. Gerekirse kaydetmek fotoğraf.
  4. İki kez PBS kullanarak hücreleri durulayın. % 3.7 formaldehit 37 ° C kuluçka karanlık hücrelerde düzeltmek.
    Not: Fiksasyon formaldehit oda sıcaklığında tarafından çok iyi çalışıyor. Formaldehit işleme uygun kişisel koruyucu ekipman giyerler.
  5. PBS hücrelerde yıkayın. Buz gibi metanol hücreleri tamir − 15 dakika süreyle 20 ° C Permeabilize hücreleri % 0,1 ile % 3 BSA kuluçka tarafından PBS 10 dakika süreyle buzda Triton X-100 yıkama PBS hücrelerle.
  6. Kuluçkaya engelleme arabellek hücrelerde (% 3 BSA ve % 0.1 ara-20 PBS çözümünde) oda sıcaklığında 1 h için.
    Not: Kuluçka 4 ° C'de 2 h için iyi, çok çalışıyor.
  7. % 3 BSA ve % 0.1 İlköğretim-antikor (1: 200, Anti-tau) çözüm hazırlamak ara-20 PBS (örneğin, 2 µL tau-13 antikor 0.4 mL arabelleği).
  8. Bir PVDF küçük parçalar koparıp membran parçaları düzgün 6-şey plaka; her şey içinde uygun böylece emmek onları suda 5 dk. yer her şey içinde kesik PVDF.
  9. Ekleyin 60 µL kesme için birincil antikor çözümün PVDF parçalar halinde her şey. Öyle ki hücreleri İlköğretim-antikor çözüm dokunabilir miyim coverslips yerleştirin. Karanlık, nemli odasında 4 ° C'de gecede kuluçkaya. PBS içinde dört kez yıkayın.
  10. % 3 BSA ve % 0.1 ikincil-antikor çözüm (fluoresein Birleşik 594 Anti-fare IgG 1: 400) hazırlamak ara-20 PBS.
  11. Parçaları düzgün 6-şey plaka her şey içinde uygun ve her şey içinde kesik PVDF suda 5 dk. yer onları emmek PVDF membran küçük parçalar koparıp.
  12. Ekleyin 80 µL ikincil-antikor çözüm her 6-şey plaka PVDF parçaları için. Öyle ki hücreleri ikincil-antikor çözüm dokunabilir miyim coverslip yerleştirin. 2 h. PBS ile yıkama için oda sıcaklığında karanlık, nemli bir odasında dört kez kuluçkaya.
  13. Mount örnekleri 4 montaj orta ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve düzeltme coverslips cam slaytlara. Cam slaytlara DAPI ile montaj orta
    1. Ekle bir damla. Coverslips her kuyudan çıkarın ve onları DAPI ile montaj orta içeren cam slaytlara yerleştirin. Yarış lekeli hücreleri içeren her coverslip yüzeyine dokunduğundan emin olunTing orta karşılık gelen cam slaytta.
    2. Uygula tüm her coverslip mühür ve bunları düzeltmek için çevresinde hava geçirmez Cam slaytlara cilası. Gerekirse, iki kez bu adımı yapmak.
  14. Incubate 1,5 saat karanlık bir oda oda sıcaklığında için.
  15. Coverslip karanlık bir odada daldırma yağ kullanarak confocal bir mikroskop kullanarak slaytları inceleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Toplam tau ve fosfo-tau ifadesi curcumin veya LiCl (şekil 1) farklı konsantrasyonları hücrelerle tedavi sonra incelenmiştir. Hücre tedavisi curcumin üç farklı konsantrasyonları ile tau ifade seviyeleri azalma; Ancak, fosfo-tau ifade curcumin düşük konsantrasyon ile tedavi üzerine artmış ama daha yüksek curcumin konsantrasyonları hücrelerle tedavi üzerine düşmüştür. Anti-fosfo-tau (Ser396) fosfo-tau tespiti için kullanıldı. LiCl (şekil 1) üç farklı konsantrasyonları ile hücrelerin tedavi üzerine toplam tau ve fosfo-tau düzeyleri azalmıştır. Önceki araştırma tau ifade düzeyleri farklı kanser türleri ve farklı sitelerde aynı kanser türlerinden farklılık göstermişti. Kolorektal kanser önceki veri o tau da fosforile19olan iki hücre sıra kolorektal kanser (HCT 116 ve SW480) ifade edildi gösterdi. 5 µM curcumin ile tedavi hücrelerdeki fosfo-tau düzeyleri daha fazla tedavi edilmezse hücreleri olan yüksekti. Fosfo-tau düzeyleri curcumin aynı konsantrasyon ile tedavi hücrelerdeki toplam tau daha yüksekti. 10 µM curcumin hücrelerle tedavi tedavi edilmezse hücreleri ile karşılaştırıldığında fosfo-tau seviyeleri azalma ama hala daha fazla toplam tau ifade açıdan fosfo-tau ifade değildi. Tedavi 30 µM indirdi curcumin fosfo-tau ifade içeren hücrelerin aynı işlem görmüş hücreleri seviyelerinde fosfo-tau tedavi edilmezse hücrelerinde ve toplam tau ile karşılaştırıldığında.

Bu el yazması bir fosfataz tahlil (Şekil 2) tarafından tau fosforilasyon durumunu değerlendirmek için kolay bir iletişim kuralı kurdu. Curcumin tedavisi, ardından Genel tau fosforilasyon önemli ölçüde değişmedi ve fosforilasyon, belirli amino asitlerin önemli (şekil 1) oldu. Genel olarak tau fosforilasyon LiCl ile tedavi edilmezse hücreleri ile karşılaştırıldığında tedavi hücrelerdeki durduruldu. Tedavi edilmemiş örnekleri, tedavi edilmemiş örnekleri örnekleri fosfataz tedavi daha daha fazla hyperphosphorylated olduğunu doğrulama daha hızlı electrophoresed fosfataz tedavi örnekleri. Curcumin tedavi hücreler neredeyse aynı sonuçları kolorektal kanser hücre hatları tedavisinde tau fosforilasyon şekil 1' de gösterildiği gibi azaltmak yaptı değil olduğunu belirten gösterdi. Bu hücrelerde tau fosforilasyon gösteren hem fosfataz tedavi ve tedavi edilmezse örnekleri, örneklerinde LiCl ile tedavi hücre neredeyse aynı mesafeden electrophoresed yapıldı (Resim 2) azalır. Burada, yüksek konsantrasyonda (20 µM veya 30 µM) curcumin tedavi örnekleri genel fosforilasyon durum, düşük konsantrasyon gösterdi tedavi daha yüksek bir siteye özgü fosforilasyon tarafından belirli fosfo-tau (S396) antikor ortaya olarak karşılaştırmak için alınmıştır.

Ayrıca, bu laboratuvarda, tau-352 bir pozitif kontrol ve sadece MT olarak bir negatif kontrol (şekil 3) kullanarak başarıyla Mikrotubul bağlama tahlil hücre örneklerinin kurulmuştur. Curcumin ve LiCl tedavisi için Mikrotubul bağlama etkinliği, Mikrotubul bağlama tahlil tarafından gösterildiği gibi inhibe. Oysa, siteye özgü tau fosforilasyon inhibe etkili bu deneyde curcumin tedavisi yetenekleri bağlama ama önceki çalışmalar46,47yılında benzer bağlama inhibe Mikrotubul belli etmedi daha yüksek konsantrasyon. Şekil 1' de, fosfo-tau denetimi ancak toplam tau daha yüksek ifade ile karşılaştırıldığında çok az ifade 10 µM curcumin tedavisi sonuçlandı. Ancak, kolorektal kanser tau curcumin tedavisi sonra Mikrotubul bağlama kapasitesinin yanı sıra düşük konsantrasyon LiCl tedavi tedavi edilmezse örnekte azalma. Siteye özgü tau fosforilasyon Mikrotubul bağlama ve kendini toplama48etkiler. Tau fosforilasyon prolin zengini bölge, C-terminal bölgesi arttı bu özellikleri ve her iki bölge ile birlikte MT-bağlama bölge bağlama özelliklerini yaklaşık % 70 oranında azaltılabilir ve düzensiz ise Mikrotubul-bağlama özellikleri engelledi mikrotübüller48. Tau siteye özgü diğer fosforilasyon yanı sıra diğer bazı faktörler kolorektal kanser tau curcumin veya LiCl ile tedavi bu Mikrotubul istikrarsızlık söz konusu.

Birincil ve ikincil antikorları az miktarda kullanarak basit bir protokol tau kolorektal kanser hücre çizgiler curcumin tedavisi (şekil 4) takip yerelleştirilmesini etkin. Sonuçlar gösterdi tau curcumin tedavi aşağıdaki çekirdek translocated, bir bulgu o nükleer tau raporlama önceki çalışmalar için benzer Alzheimer hastalığı49 gibi nörodejeneratif hastalıklarda nöronal DNA korunmasında önemli bir oyuncu olduğunu ,50.

Figure 1
Şekil 1: kolorektal kanser hücrelerinin curcumin veya LiCl tedavi aşağıdaki Tau ve fosfo-tau ifadede. Denetim hücrelerinden çıkarılan numune veya hücreleri(a)curcumin ve (B) LiCl üç farklı konsantrasyonları ile 24 h için tedavi % 10 polyacrylamide jeller üzerinde SDS-PAGE tarafından çözülmüş ve anti-tau veya anti-fosfo-tau antikor ile probed. Dansitometresi analizleri Western blot sonuçlarının sağ panelde sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: genel olarak fosforilasyon tau olarak tedavi edilmediği veya differentially fosfataz tahlil tarafından algılanan hücre örnekleri tedavi. Tek Şerit denetim göster hücre özleri, hatta şerit fosfataz tedavi curcumin tedavi veya LiCl tedavi örnekleri göstermek ise. Fosfataz tedavi tau elektroforetik hareketlilik fosforile tau bulunan tedavi edilmezse örnekleri daha hızlı yaptı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: tau Mikrotubul bağlama tahlil tarafından algılanan kolorektal kanser hücrelerinde Mikrotubul bağlama. Kontrol HCT 116 hücre örnekleri, curcumin-tedavi, veya LiCl tedavi hücre örnekleri ve E. coli tau mikrotübüller ayrıntılı olarak Protokolü Bölüm 4 ile inkübe. (S) süpernatant ve Pelet (P) kesirler eşdeğer miktarda immunoblotted bir anti-tau antikor ile vardı. Sadece MT içeren negatif kontrol şerit MT herhangi bir ilişkili endojen tau içermiyordu onaylamak için işletilmiştir. Alt paneli bireysel örnekleri (ilişkisiz tau) süpernatant ve Pelet (ilişkili tau) kesirler arasında karşılaştırma etkinleştirme Batı lekesi Dansitometresi analizlerini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Resim 4: confocal mikrofon tarafından muayene Tau protein yerelleştirmeroscopy.
Periferik çekirdekçik kolorektal kanser hücreleri için yerelleştirilmiş tau. Sol kapı aynası tau yerelleştirme tarafından DAPI boyama çekirdeği orta kapı aynası göstermek ise Anti-tau Monoklonal antikor kullanarak tespit göster. Tedavi hücre çekirdeği içine tau translocation gösterilen temsilcisi örnekler de gösterilir. Tau tedavi hücrelerde de çekirdek içinde lokalize ise kontrol hücreleri tau esas olarak çevresinde ve çekirdekleri, dışarıda gösterdi. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu el yazması toplam tau algılamak için farklı yordam koşullar kurulmuş ve tau curcumin ve LiCl ile tedavi kolorektal kanser hücrelerinde fosforile. Tau protein örneklerinde genel fosforilasyon durumunu değerlendirmek için fosfataz tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil herhangi bir protein fosforilasyon durumunu incelemek için kullanılabilir.

Bu tahlil protein hamle sigara fosforile durumuna yavaş fosforile ilkesine dayanır. Alkalen fosfataz ve alkalen fosfataz arabellek bu protokol için kullanılır. Hücre lysates tahlil bileşenleri ekledikten sonra örnekleri en uygun belirli bir süre için belirli bir sıcaklıkta inkübe. Kuluçka sonra örnekleri SDS örnek arabellek reaksiyonu durdurmak için haşlanmış. Daha önce farklı deneysel protokoller tau mikrotübüller için bağlama değerlendirmek için kullanılmış olabilir. Burada sunulan Mikrotubul bağlama tahlil süpernatant ve Pelet kesirler kullanarak kalite güvencesi sağlamak için hem olumlu hem de olumsuz denetim birlikte gerçekleştirmek kolaydır. Salt MT negatif kontrol MT herhangi bir ilişkili endojen tau içermediğini doğrulamak için kullanıldı. Buna ek olarak, saf insan tau-352, Mikrotubul bağlama tau pozitif kontrol olarak kullanılan. Mikrotubul bağlama kesir (pelet) bağlayıcı olmayan kesir (süpernatant) ultra hızlı Santrifüjü ayırmak için kullanılan; Çünkü böyle bir ultracentrifuge pahalı ve yaygın olarak kullanılan bu yordam bir sınırlama olabilir. Buna ek olarak, düşük miktarlarda örnekleri olduğu için kullanılan, uzun, ince santrifüj tüpleri adaptörler ile kullanılmak üzere ultracentrifuge rotor ihtiyaç vardır. Böyle tüpler yeniden kullanmak mümkün olsa da, tek kullanımlık Çapraz bulaşma önlemek için tavsiye edilir. Son olarak, bir tau-yerelleştirme Protokolü birincil ve ikincil antikor sadece küçük miktarlarda ihtiyaç vardır avantajdır. Fiksasyon, permeabilization ve coverslips için hücreleri yapışık engelleme sonra PVDF, sonra 6-şey plaka kuyu yerleştirilen küçük bir parçası üzerinde antikor küçük bir damla yatırılır. Öyle ki antikor-ebil giriş hücreleri coverslips tutuldu. Bu iletişim kuralını kullanarak, kullanılan antikor miktarı en aza indirilebilir.

Bazı önlemler güvenilir ve ölçülebilir sonuçlar emin olmak için göz önünde tutulmalıdır. İlk olarak, hücre kültürlerinde kirlenmesini önlemek için sıkı aseptik teknikler kullanılmalıdır ve hücre ayıklar. Tam RIPA lizis arabellek taze hazırlanmalıdır. Fosfataz tahlil örnekleri 3 dakika kaynatın ve SDS-sayfaya hemen fosfataz tedavi ve tedavi edilmezse örnekleri kuluçka sonra başlamak önemlidir. Tau-352 olmalı küçük aliquots bölünmüş ve buza −20 ° C dondurucudan çıkarıldıktan sonra devam etti ve kullanımdan hemen sonra dondurucu içine yatırılır. −80 ° C, MT çıkarıldıktan sonra hisse senetleri içinde 72 h yeniden Eğer buz üstünde tutulmalıdır; Aksi takdirde, oda sıcaklığında kalsın. 10 x 1 x arabellek GTP ve Paklitaksel eklendiğinde taze yapılması gerekiyor çünkü çözüm konsantre olarak PEM arabellek hazırlanmalıdır.

Tau işlevleri onun fosforilasyon ölçüde tarafından düzenlenmektedir. Normal bir yetişkin beyni tau tau-352, Mikrotubul bağlama tahlil pozitif kontrol olarak kullanılan benzer, Tau hyperphosphorylation oluşmaz. Ancak, tau hyperphosphorylation nörodejeneratif hastalıklarda oluşur. Bu iletişim kuralı ve sonraki sonuçlar insan kolorektal kanser hücre hatları da benzer şekilde bu Alzheimer hastalığı beynindeki fosforile tau taşıdığını göstermektedir. Tedavi yüksek doz curcumin ve özellikle LiCl tau fosforilasyon en aza indirebilirsiniz. Böylece, tau hyperphosphorylation açısından nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer hastalığı ve kolorektal kanser gibi arasında iyi bir bağlantı var olabilir ve curcumin veya LiCl kolorektal kanser ve Alzheimer hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir. Tau Mikrotubul bağlama değiştirmek ajanları dinamik olarak kanseri olarak incelendiği çünkü son olarak, tau fosforilasyon ve tau Mikrotubul bağlama eğitimi önemli ölçüde sadece nörodejeneratif hastalıklar için de bazı chemotherapeutics ilgilidir tedavi51. Burada sunulan iletişim kuralları potansiyel olarak keşif ve farklı tauopathies ve kanser tedavisi için yeni tedavi edici ajanların geliştirme yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar ifşa birşey yok bildirin.

Acknowledgments

Projenin bir parçası 'Kalkınma ve sanayileşme yüksek değer kozmetik hammadde deniz mikroalg' başlıklı, okyanuslar Bakanlığı ve balıkçılık, Kore tarafından finanse edilen ve intramural grant (2Z04930) tarafından desteklenen bu araştırma gerçekleştirildi Doğal ürünlerin KIST nin Gangneung Enstitüsü '.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X - 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Tags

Biyokimya sorunu 128 Alzheimer hastalığı tauopathy fosforilasyon mikrotübüller curcumin lityum klorür confocal mikroskobu
Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan,… More

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. H. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter