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Biochemistry

फास्फारिलीकरण के लिए परख और कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में ताऊ प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ बाध्यकारी Microtubule

Published: October 10, 2017 doi: 10.3791/55932
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

Summary

यह पांडुलिपि ताऊ hyperphosphorylation को मापने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, ताऊ बंधन को मापने microtubules, और intracellular ताऊ के स्थानीयकरण निंनलिखित दवा उपचार । इन प्रोटोकॉल दोहराए दवाओं या अंय यौगिकों कि लक्ष्य ताऊ hyperphosphorylation या microtubule बाध्यकारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

microtubule-जुड़े प्रोटीन ताऊ एक न्यूरॉन प्रोटीन है कि axons में ज्यादातर स्थानीयकृत है । आम तौर पर ताऊ सामान्य न्यूरॉन कामकाज के लिए आवश्यक है क्योंकि यह microtubule विधानसभा और स्थिरीकरण में शामिल है. न्यूरॉन्स के अलावा, ताऊ मानव स्तन, प्रोस्टेट, गैस्ट्रिक, कोलोरेक्टल, और अग्नाशय के कैंसर में व्यक्त की है जहां यह लगभग इसी तरह की संरचना से पता चलता है और न्यूरॉन ताऊ के रूप में इसी तरह के कार्यों डालती है. ताऊ की राशि और उसके फास्फारिलीकरण microtubules के एक स्थिरता के रूप में अपने कार्य को बदल सकते हैं, और अल्जाइमर रोग जैसे विभिंन neurodegenerative विकारों में युग्मित पेचदार रेशा के विकास के लिए सीसा । ताऊ के फास्फारिलीकरण राज्य का निर्धारण और उसकी microtubule-बाध्यकारी विशेषताएँ महत्वपूर्ण हैं. इसके अलावा, ताऊ के intracellular स्थानीयकरण की जांच विभिन्न रोगों में महत्वपूर्ण है । इस पांडुलिपि के साथ या curcumin और LiCl उपचार के बिना कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में microtubules के लिए ताऊ फास्फारिलीकरण और ताऊ बाइंडिंग को मापने के लिए मानक प्रोटोकॉल का विवरण । इन उपचार कैंसर सेल प्रसार और विकास को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ताऊ का Intracellular स्थानीयकरण immunohistochemistry और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए एंटीबॉडी की कम मात्रा का उपयोग करके जांच की है । इन परख दोहराव यौगिकों कि ताऊ hyperphosphorylation या microtubule बंधन को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उपंयास चिकित्सकीय विभिंन tauopathies या संबंधित विरोधी एजेंटों के लिए इस्तेमाल किया संभावित इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर विशेषता हो सकती है ।

Introduction

ताऊ मूल रूप से एक ऊष्मा-स्थिर microtubule-जुड़े प्रोटीन के रूप में पहचाना जाता था जो कि tubulin1के साथ सह-शुद्धि थी । ताऊ ने विशेष रूप से उच्च eukaryotes2,3,4में व्यक्त की है । ताऊ का मुख्य कार्य microtubule असेंबली1,5,6को नियंत्रित करना है । यह भी microtubules7, axonal परिवहन8, axonal व्यास9में परिवर्तन, ंयुरोमा ध्रुवीकरण के गठन, और neurodegeneration10के बहुलकीकरण के लिए योगदान देता है । ताऊ भी कुछ संकेत रास्ते को नियंत्रित करने के लिए एक प्रोटीन पाड़ के रूप में कार्य करता है । चूहे मस्तिष्क अध्ययन का सुझाव है कि ताऊ ंयूरॉन है और विशिष्ट है कि यह मुख्य रूप से axons11में स्थानीयकरण । क्योंकि ताऊ microtubule बहुलकीकरण और न्यूरॉन विकास के लिए आवश्यक है, ताऊ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में axonal विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए परिकल्पना की गई थी; इस परिकल्पना को बाद में इन विट्रो में और वीवो प्रयोगों में सत्यापित किया गया । न्यूरॉन्स के अलावा, ताऊ जिगर, गुर्दे, और मांसपेशियों की कोशिकाओं को12,13सहित अलग गैर न्यूरॉन कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है. ताऊ मानव स्तन, प्रोस्टेट, कोलोरेक्टल, गैस्ट्रिक, और अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों और ऊतकों में भी व्यक्त किया जाता है14,15,16,17,18, 19. ताऊ का भी समावेश में पाया जाता है-शरीर myositis के रूप में मुड़ tubulofilaments में शामिल निकायों20.

ताऊ कई पोस्ट शोधों के संशोधनों को ले सकता है । सभी के बाद अनुवाद संशोधन, फास्फारिलीकरण सबसे आम है । बढ़ी हुई ताऊ फास्फारिलीकरण microtubules के लिए अपने संबध घटाता है, अंत में cytoskeleton स्थिर । ८५ फास्फारिलीकरण साइटें तौ प्रोटीन मानव अल्जाइमर रोग मस्तिष्क के ऊतकों से पृथक में वर्णित किया गया है । इन साइटों की, ५३% serine का गठन, ४१% threonine, और केवल 6% tyrosine अवशेषों21,22,23। ताऊ फास्फारिलीकरण अपने स्थानीयकरण, समारोह, बंधन, घुलनशीलता, और इसके अन्य पद-शोधों के संशोधनों को झेलते हुए प्रभावित करता है. इसके अलावा ताऊ फास्फारिलीकरण सामांय सीमा से अधिक (या पूरी तरह फॉस्फेट समूहों के साथ संतृप्त) hyperphosphorylation के रूप में जाना जाता है कि अल्जाइमर रोग के संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं24प्रतिकृति है । ताऊ axonal microtubules के समुचित कार्य को बनाए रखता है और शारीरिक स्थितियों के तहत सामान्य न्यूरॉन कार्य सुनिश्चित करता है । हालांकि, hyperphosphorylated ताऊ एक अच्छी तरह से संगठित microtubule बंधन बनाए रखने के लिए विफल रहता है, क्योंकि microtubule विधानसभा के न्यूरॉन नुकसान के कारण. ताऊ फास्फारिलीकरण के सामान्य स्तर उचित ताऊ कामकाज के लिए आवश्यक हैं, लेकिन ताऊ सामान्य रूप से कार्य करने में विफल रहता है अगर इसकी विशेषता फास्फारिलीकरण स्तर बदल गया है और अगर यह hyperphosphorylated है25। अल्जाइमर रोग और कुछ अन्य उम्र से संबंधित neurodegenerative विकारों में, ताऊ hyperphosphorylated हो जाता है और युग्मित पेचदार रेशा और neurofibrillary पेचीदा26,27रूपों. इस प्रकार, ताऊ फास्फारिलीकरण और microtubule बंधन निर्धारित करने के लिए तरीके महत्वपूर्ण हैं ।

कोलोरेक्टल कैंसर, एक उंर से जुड़े कैंसर, तीसरी सबसे अक्सर निदान कैंसर और तीसरा प्रमुख मौत दोनों पुरुषों और महिलाओं को28के लिए कैंसर के कारण है । कोलोरेक्टल कैंसर मुख्य मौत के कारण पश्चिमी दुनिया में कैंसर के29में से एक है । क्योंकि दोनों कोलोरेक्टल कैंसर और अल्जाइमर रोग उंर बढ़ने के साथ जुड़े रहे है और दोनों विकसित देशों में मुख्य रूप से हो जहां लोगों को इसी तरह के आहार की आदतों का आनंद, दो रोगों किसी भी तरह से संबद्ध किया जा सकता है । इसके अलावा, ताऊ-पॉजिटिव और ताऊ-नेगेटिव कैंसर कोशिकाएं कीमोथेरेपी एजेंटों को अलग से जवाब देती हैं, उदा, paclitaxel16.

Curcumin, भारतीय मसाला हल्दी30 अवती लोंगाके मुख्य डेरिवेटिव में से एक है । सदियों से दक्षिण एशियाई आबादी एक दैनिक आधार पर अपने आहार में हल्दी का सेवन किया है । Curcumin में कोलोरेक्टल कैंसर, अल्जाइमर रोग, मधुमेह, सिस्टिक फाइब्रोसिस, भड़काऊ आंत्र रोग, गठिया, hyperlipidemia, atherosclerosis, और कोरोनरी हृदय रोग सहित विभिन्न रोगों का इलाज किया जाता है31, ३२ , ३३ , ३४ , ३५ , ३६ , ३७ , ३८. लिथियम भी कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं को मार या उनके प्रसार३९को रोकने कर सकते हैं । लिथियम भी अल्जाइमर रोग के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है४० के रूप में यह ताऊ एकत्रीकरण कम हो जाती है और इसकी hyperphosphorylation के रूप में एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में मनाया४१,४२,४३, ४४.

इस पांडुलिपि का उद्देश्य: 1) इलाज कोशिकाओं में कुल ताऊ और phospho-ताऊ अभिव्यक्ति के स्तर को मापने; 2) एक फॉस्फेट परख का वर्णन करने के लिए समग्र ताऊ फास्फारिलीकरण उपाय; ३) तौ के microtubule-बंधन की जांच; और 4) curcumin या LiCl के साथ इलाज कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों में फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा information तौ । परिणाम curcumin के साथ कि कोशिका उपचार पता चलता है, जो पेट के कैंसर के लिए एक माना जाता है अच्छा कीमोथेरेपी एजेंट है, और LiCl के साथ इलाज के दोनों कुल ताऊ और phosphorylated ताऊ कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों में की अभिव्यक्ति को कम कर सकते हैं । ये उपचार ताऊ के न्यूक्लियर translocation का कारण भी बन सकते हैं । हालांकि, अनपेक्षित रूप से, curcumin microtubules करने के लिए ताऊ की बाइंडिंग में सुधार करने के लिए विफल रहता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. रिएजेंट की तैयारी कर रहे हैं

  1. Add 10 & #181; l का (1 mM) phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड सॉल्यूशन, 10 & #181; l (100x स्टॉक से 1x) को छेड़ने वाले अवरोधक कॉकटेल समाधान, और 10 & #181; l (100x स्टॉक से 1x) फॉस्फेट के बाधा कॉकटेल समाधान 1x radioimmunoprecipitation परख के 1 मिलीलीटर (RIPA) बफर पूरा RIPA lysis बफर तैयार करने के लिए ।
  2. तैयार 10x जनरल tubulin बफर (PEM) बफर.
    1. Add ८०० mm (६.०४७४ g) पिपेराजीन-n-n & #39;-बीआईएस-2-ethanesulfonic एसिड, 10 एमएम (९५.१ मिलीग्राम) ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (& #946;-aminoethyl ईथर)-n, n, n & #39;, n & #39;-tetraacetic एसिड, 10 मिमी (५१ मिलीग्राम) MgCl 2 , और १.२५ मीटर (10 मीटर की 3 मिलीलीटर) एक ५०-एमएल ट्यूब में NaOH , 15 मिलीलीटर आसुत जल के साथ मिश्रण है, और एक भंवर का उपयोग करके भंग । पीएच की जांच करें (६.९ होना चाहिए) । यदि pH & #62; ६.९, बफ़र को छोड़ें और ताज़ा बहुत कुछ करें ।
      नोट: NaOH १.२५ मीटर नीचे होना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि पीएच ६.९ overshoot नहीं है । इसे एडजस्ट करने के लिए एचसीएल का इस्तेमाल करने की सलाह नहीं है पीएच & #62; ६.९.
    2. जोड़ें NaOH dropwise जब तक पीएच ६.९ है । आसुत जल जोड़ें 10x PEM बफर के 25 मिलीलीटर तक बनाने के लिए । अंत में, एक सिरिंज और एक ०.२ & #181 का उपयोग कर फ़िल्टर; एम सिरिंज फिल्टर. इस बफर को aliquots में १.५ मिलीलीटर ट्यूबों और स्टोर में 4 & #176; C.
      3. में विभाजित करें
  3. एजेंट को कम करने और डाई के साथ 5x नमूना बफर तैयार.
    1. Mix ३०० & #181; 1 एम Tris-एचसीएल (पीएच ६.८) के एल (६० मिमी), २.५ मिलीलीटर (25%) of ५०% ग्लिसरॉल, 1 मिलीलीटर (2%) of 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), और १.२ मिलीलीटर आसुत पानी 5x एसडीएस नमूना बफर के 5 मिलीलीटर बनाने के लिए । Store at & #8722; 20 & #176; C.
      नोट: क्योंकि ग्लिसरॉल चिपचिपा है, मापने १.२५ मिलीलीटर ग्लिसरॉल मुश्किल है । १००% ग्लिसरॉल का एक मिलीलीटर वजन १.२६ ग्राम है । इस प्रकार, १००% ग्लिसरॉल के १.५७५ g वजन (जो १००% या २.५ मिलीलीटर की १.२५ मिलीलीटर की बराबरी ५०% ग्लिसरॉल) एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पहले; अंय घटकों के साथ अच्छी तरह से मिलाएं ।
< p class = "jove_title" > 2. सेल संस्कृति, Curcumin या LiCl उपचार के साथ उपचार, और प्रोटीन अभिव्यक्ति की परीक्षा

  1. जोड़ें ~ 1 x 10 6 HCT ११६ कोशिकाओं में १०० मिमी ऊतक-संस्कृति न्यूनतम आवश्यक मीडिया (मेम) से युक्त व्यंजन 10% भ्रूण गोजातीय के साथ पूरक सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-streptomycin. संवर्धन के एक दिन के बाद, कोशिकाओं 60-70% संगम तक पहुंच जाएगा ।
    नोट: आवश्यक प्लेटों की संख्या नीचे वर्णित उपचार की संख्या पर निर्भर करता है.
  2. जब कोशिकाओं तक पहुंच ~ ६५% संगम (माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अनुमानित), मेम पूरक मध्यम निकालें और सीरम मुक्त मेम जोड़ के साथ 5 & #181; m, 10 & #181; मी, और 30 & #181; m curcumin या 25 mm, ५० mm, and १०० mm LiCl. पर मशीन ३७ & #176; ग के लिए 24 ज के लिए एक humidified वातावरण युक्त 5% कं 2 .
  3. 24 एच उपचार के बाद, 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ कोशिकाओं को धो लें, और एक सेल खुरचनी का उपयोग कर कोशिकाओं परिमार्जन । १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में स्क्रैप कोशिकाओं स्थानांतरण और 4 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर १,८०० x g पर 4 & #176; C सेल छर्रों प्राप्त करने के लिए.
  4. लाइसे में छर्रों को निलंबित कर कोशिकाओं को १०० & #181; L पर पूरा RIPA बफर का 4 & #176; सी के लिए 20 मिनट जबकि नियमित रूप से ट्यूबों दोहन । नमूनों को संक्षेप में Sonicate ।
  5. एक benchtop केंद्रापसारक पर २२,५७० x g में सेल homogenates 4 पर 20 मिनट के लिए & #176; C. एक supernatants का उपयोग कर अंय लेबल ट्यूबों के लिए पिपेट हस्तांतरण ।
  6. ब्रैडफोर्ड परख द्वारा supernatants में प्रोटीन एकाग्रता उपाय < सुप वर्ग = "xref" > ४५ व्यावसायिक प्रोटीन-परख किटों का प्रयोग.
  7. समान प्रोटीन एकाग्रता के नमूने तैयार करें (10 & #181; g प्रोटीन/13 & #181; L नमूना) 4x एसडीएस जेल-लोडिंग बफर के साथ सेल lysates के. तैयार 4x एसडीएस जेल-लोडिंग बफर ताजा युक्त ४०० mM dithiothreitol (डीटीटी).
    नोट: इस स्तर पर, नमूनों पर संग्रहित किया जा सकता है & #8722; 20 & #176; C यदि आवश्यक हो तो.
  8. एक हीट ब्लॉक पर १०० & #176 पर नमूने 5 मिनट के लिए सी । एक भंवर का उपयोग करके नमूने मिश्रण और उन्हें ~ 10-15 मिनट के लिए शांत करने के लिए प्रतीक्षा करें.
  9. एक ट्रो प्रणाली इकट्ठा ।
    1. लोड 10 & #181; g प्रोटीन (13 & #181; L sample) प्रति कुआं एक 10% एसडीएस-polyacrylamide gel) ट्रो (एसडीएस-PAGE) के लिए । एक लेन के लिए जेल पर आणविक वजन सीढ़ी लोड ।
      नोट: के रूप में ट्रो शुरू होता है, प्रोटीन सीढ़ी स्पष्ट आणविक भार के प्रोटीन बैंड में हल होगा । अज्ञात प्रोटीन बैंड के आणविक भार का अनुमान लगाने के लिए इन बैंड का उपयोग करें ।
    2. नमूने लोड करने के बाद, एक निरंतर वोल्टेज बनाए रखने के लिए एक शक्ति के स्रोत के लिए ट्रो प्रणाली के सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड कनेक्ट. प्रारंभ में, 20 मिनट के लिए ७० वी में शुरू करने के लिए समाधान जेल में स्टैकिंग जेल से प्रोटीन नमूने ले जाने के लिए । फिर, वोल्टेज में वृद्धि १२५ वी करने के लिए लगभग 70-120 मिनट तक नमूने और प्रोटीन सीढ़ी जेल के अंत तक पहुँचने.
    3. ट्रो के पूरा होने के बाद, एक गीले PVDF प्रणाली का उपयोग कर एक polyvinylidene difluoride (electroblotting) झिल्ली को जेल हस्तांतरण । १०० पर ~ १०० मिनट के लिए स्थानांतरण V. Block & #160; 4% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में झिल्ली लगभग 25 & #176 के कमरे के तापमान पर ९० मिनट के लिए बफर अवरुद्ध; C.
  10. ने ब्लाटर को आणविक-वेट की सीढ़ी के साथ साइड पर काट कर निशाना साधा. एक पारदर्शी प्लास्टिक शीट और दाग काटने के लिए एक तेज कटर का प्रयोग करें । प्राथमिक-एंटीबॉडी समाधान तैयार करें (एंटी-ताऊ 1:5000; एंटी phospho-ताऊ 1:4000) और इस समाधान में दाग की मशीन 4 & #176; C रात भर.
  11. के बाद रात में गर्मी, 7 मिनट फॉस्फेट में चार बार के लिए दाग धो-खारा के बीच-20 (PBST) समाधान ।
  12. संबंधित माध्यमिक-एंटीबॉडी समाधान (बकरी विरोधी खरगोश या विरोधी माउस आईजीजी पर 1:5000) तैयार है, और इस समाधान में ९० मिनट के लिए लगभग 25 & #176 के कमरे के तापमान पर दाग की मशीन; C. PBST में चार बार धोने, 7 मिनट प्रत्येक.
  13. निर्माता & #39; s अनुशंसाएँ के अनुसार एक chemiluminescence किट का उपयोग कर ब्लाट विकसित करना. एक पारदर्शी प्लास्टिक लपेटो का उपयोग दाग कवर । किसी chemiluminescence इमेजिंग सिस्टम द्वारा छवियां प्राप्त करना & #160; प्रासंगिक सॉफ्टवेयर के साथ chemiluminescence के लिए.
< p class = "jove_title" > 3. फॉस्फेट परख

  1. का इलाज सेल lysates (२.५ कदम से) alkaline फॉस्फेट बफर में alkaline फॉस्फेट के साथ ।
    1. दोनों नियंत्रण और उपचारित नमूनों के लिए, 20 & #181 तैयार करना; L नमूने युक्त 20 & #181; g कुल प्रोटीन. उस कक्ष lysates का वॉल्यूम जोड़ें जिसमें 20 & #181; g कुल प्रोटीन, जिसके बाद 2 & #181; l क्षार फॉस्फेट बफर और 10 & #181; l क्षार फॉस्फेट. आसुत जल को जोड़ कर 20 & #181; L.
  2. के नमूने पर ३७ & #176; ग के लिए 1 ज. ५० mm के अंतिम एकाग्रता पर ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो, या सोडियम orthovanadate (Na 3 VO 4 ) 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में जोड़कर । यह प्रतिक्रिया ७५ & #176; C 5 min.
    3. पर ताप से भी रोकी जा सकती है फॉस्फेट खत्म के साथ नमूनों की गर्मी से पहले
  3. , फॉस्फेट-इलाज नमूनों के साथ तुलना के लिए फॉस्फेट जोड़ने के बिना एक ही एकाग्रता के नमूने तैयार.
  4. ४०० mM डीटीटी.
    5. युक्त नए सिरे से तैयार 4x एसडीएस जेल-लोडिंग बफर जोड़ें
  5. एक हीट ब्लॉक पर १०० & #176 पर नमूने की मशीन 5 मिनट के लिए सी । एक भंवर का उपयोग कर नमूने मिश्रण । के लिए कमरे के तापमान पर शांत ~ 10-15 min.
  6. एसडीएस द्वारा एक 10% polyacrylamide जेल चलाने के लिए एक ट्रो प्रणाली को इकट्ठा-PAGE.
    1. लोड 10 & #181; छ प्रोटीन (13 & #181; L sample) प्रति कुआं पर एक 10% polyacrylamide जेल । आणविक-भार सीढ़ी लोड ।
    2. नमूना लोड करने के बाद, एक निरंतर वोल्टेज बनाए रखने के लिए एक शक्ति के स्रोत के लिए ट्रो प्रणाली के सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड कनेक्ट. प्रारंभ में, 20 मिनट के लिए ७० वी में शुरू करने के लिए समाधान जेल में स्टैकिंग जेल से प्रोटीन नमूने ले जाने के लिए । फिर, वोल्टेज को बढ़ाने के लिए १२५ V और लगभग 70-120 मिनट के लिए जेल चलाने जब तक नमूने और प्रोटीन सीढ़ी जेल के अंत तक पहुँचने.
      3. ट्रो के पूरा होने के बाद
    3. , एक गीला electroblotting प्रणाली का उपयोग कर एक PVDF झिल्ली पर जेल हस्तांतरण । १०० V.
      4. में ~ १०० मिनट के लिए स्थानांतरण
    4. ने ब्लाटर को आणविक-भार की सीढ़ी पर एक छोटी सी काट बनाकर निशाना साधा. एक पारदर्शी प्लास्टिक शीट और दाग काटने के लिए एक तेज कटर का प्रयोग करें ।
  7. block & #160; झिल्ली & #160; 4% में BSA अवरुद्ध बफर ९० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
  8. में ब्लाटर प्राथमिक-एंटीबॉडी समाधान (विरोधी ताऊ 1:5000) पर 4 & #176; ग रात भर । PBST में दाग चार बार धो लो, 7 मिनट के लिए प्रत्येक.
  9. संबंधित माध्यमिक-एंटीबॉडी समाधान (बकरी विरोधी माउस आईजीजी पर 1:5000) तैयार है, और कमरे के तापमान पर ९० मिनट के लिए दाग की मशीन । PBST में चार बार धो लें, 7 मिनट के लिए प्रत्येक.
  10. निर्माता & #39; s अनुशंसाएँ के अनुसार एक chemiluminescence किट का उपयोग कर ब्लाट विकसित करना. एक पारदर्शी प्लास्टिक लपेटो के भीतर दाग को कवर । प्रासंगिक सॉफ्टवेयर के साथ chemiluminescence के लिए एक chemiluminescence इमेजिंग प्रणाली द्वारा छवियों का अधिग्रहण ।
< p class = "jove_title" > 4. Microtubule-बाध्यकारी परख

  1. Microtubule बाध्यकारी परख के लिए, दोहराएं कदम 2.1-2.6.
  2. की तैयारी 1x (2 मिलि) PEM बफर से 10x PEM बफर 4 & #176; C जोड़कर 20 & #181; M (४० & #181; l) paclitaxel और 1 मिमी (20 & #181; l) GTP. & #8722 से microtubule (एमटी) स्टॉक ले लो; ८० & #176; ग फ्रीजर तथा द ई. कोलाई तौ काम शेयर से & #8722; 20 & #176; ग फ्रीजर.
  3. तालिका 1 .
    4. के अनुसार नमूने तैयार
  4. पर ३७ & #176; ग के लिए 30 min. Ultracentrifuge पर 25 & #176; ग के लिए ६० मिनट पर १००,००० x g .
  5. अंतरण १२० & #181; supernatants के L न असीम तौ युक्त, को स्वच्छ र त्यसपछि ट्यूबों.
  6. Add १२० & #181; L (supernatant के रूप में एक ही मात्रा) 5x नमूना बफर की गोली बंधे ताऊ युक्त करने के लिए और अच्छी तरह से मिश्रण । लेबल ट्यूबों को साफ करने के लिए समाधान स्थानांतरण और अच्छी तरह से मिश्रण ।
  7. उपाय प्रोटीन एकाग्रता (२.६ कदम देखें) ।
    नोट: नमूने तैयार करने के दौरान, दोनों गोली और supernatant नमूने तैयार करने के लिए समाधान (चरण ४.६) की मात्रा का उपयोग करें ।
  8. बराबर प्रोटीन एकाग्रता के नमूने तैयार है और हौसले से तैयार 4x एसडीएस जेल-लोडिंग बफर युक्त डीटीटी (४०० mM) जोड़ें ।
    नोट: नमूने इस स्तर पर & #8722; 20 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  9. दोहराएँ चरण 3.5-3.10.
< तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > नमुना < td colspan = "2" > Name < td colspan = "2" > Microtubule की जरूरत < td colspan = "2" > मुख्य प्रोटीन की जरूरत < td colspan = "2" > PEM-GTP-PTX 1 < td colspan = "2" > HCT ११६-Control (६.२१ & #956; g/& #956; l) < टीडी colspan = "2" > 2 & #956; l < td colspan = "2" > 9.66 & #956; l (६० & #956; छ) < td colspan = "2" > 108.34 & #956; l 2 < td colspan = "2" > HCT ११६-Curcumin 10 & #956; M (४.८१ & #956; g/& #956; l) < td colspan = "2" > 2 & #956; l < टीडी colspan = "2" > 16.63 & #956; l (८० & #956; छ) < टीडी colspan = "2" > 101.37 & #956; l 3 < टीडी colspan = "2" > HCT ११६-Curcumin 20 & #956; म (३.२८ & #956; g/& #956; l) < टीडी colspan = "2" > 2 & #956; l < td colspan = "2" > 30.49 & #956; l (१०० & #956; छ) < टीडी colspan = "2" > 87.51 & #956; l 4 < td colspan = "2" > HCT ११६-LiCl 25 mM (५.४३ & #956; g/& #956; l) < टीडी colspan = "2" > 2 & #956; l < td colspan = "2" > 18.42 & #956; l (१०० & #956; छ) < टीडी colspan = "2" > 99.58 & #956; l 5 < टीडी colspan = "2" > ई. कोलाई तौ < टीडी colspan = "2" > 2 & #956; l < टीडी colspan = "2" > 1 & #956; l ताऊ-३५२ < टीडी colspan = "2" > 117 & #956; l 6 < td colspan = "2" > MT केवल < td colspan = "2" > 2 & #956; l < टीडी colspan = "2" > X < td colspan = "2" > 118 & #956; l < td colspan = "2" > < td colspan = " 2 "> < td colspan =" 2 "> < td colspan =" 2 "> १२० & #956; l येक < p class =" jove_content "फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ =" 1 "> तालिका 1: microtubule-बाइंडिंग परख के लिए नमूना तैयारी ।

< p class = "jove_title" > 5. स्थानीयकरण और ताऊ की अभिव्यक्ति Curcumin के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद

  1. एक coverslip ७०% इथेनॉल का उपयोग कर साफ और यह एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग कर सूखी । एक लेबल 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुआं में एक एकल coverslip डालें । एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट पर प्लेट प्लेस और एक यूवी प्रकाश पर स्विच के लिए कम से
    2. 3 h.
  2. उपसंस्कृति कोशिकाओं और उन्हें प्रासंगिक कुओं में बीज 6-खैर प्लेट पर २.५ x 10 5 कोशिकाओं में अच्छी तरह से अनुशंसित संस्कृति माध्यम.
  3. ~ 24 घंटे के बाद, दोनों 10x और 40X सेलुलर रूपात्मक परिवर्तन के लिए जांच करने के लिए उद्देश्यों का उपयोग करके एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की जांच करें । रिकॉर्ड तस्वीरें अगर जरूरत थी ।
  4. दो बार पंजाबियों का उपयोग कर कोशिकाओं कुल्ला । कोशिकाओं को ठीक करने में ३.७% formaldehyde में एक ३७ & #176; सी मशीनर अंधेरे में.
    नोट: कमरे के तापमान पर formaldehyde द्वारा निर्धारण अच्छी तरह से काम करता है, भी । formaldehyde.
    5. हैंडलिंग जब उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें पंजाबियों में कोशिकाओं को धो
  5. । आइस-कोल्ड मेथनॉल में कोशिकाओं को फिक्स करें & #8722; 20 & #176; ग के लिए 15 min. Permeabilize के लिए उन्हें 3% BSA में और ०.१% ट्राइटन X-पंजाबियों में 10 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन द्वारा कोशिकाओं को धो लें. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोएं ।
  6. बफर अवरुद्ध में कोशिकाओं की मशीन (3% BSA और ०.१% के बीच-पंजाब के समाधान में 20) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
    नोट: 2 ज के लिए मशीन 4 & #176; C अच्छी तरह से काम करता है, भी ।
  7. तैयार करने के लिए प्राथमिक-एंटीबॉडी (विरोधी 1:200 पर ताऊ) 3% BSA में समाधान और ०.१% के बीच-20 में पंजाब ( उदा , 2 & #181; L तौ-13 एंटीबॉडी में ०.४ एमएल बफर).
  8. एक PVDF झिल्ली के छोटे टुकड़े काट ताकि टुकड़े ठीक से 6 के प्रत्येक अच्छी तरह से थाली के भीतर फिट; 5 मिनट के लिए उंहें पानी में भिगो दें । हर कुआं में कट PVDF लगाएं ।
  9. Add ६० & #181; प्रत्येक कुआं में काटे PVDF टुकड़ों को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के एल. coverslips को ऐसे रखें कि कोशिकाएं प्राथमिक-एंटीबॉडी समाधान को छू सकें । रात में एक अंधेरे, आर्द्र कक्ष में 4 & #176; सी पर मशीन । चार बार पंजाबियों में धोयें.
  10. (fluorescein-संयुग्मित ५९४ एंटी-माउस आईजीजी 1:400 पर) 3% BSA और ०.१% के बीच-20 में पंजाब में माध्यमिक-एंटीबॉडी समाधान तैयार करते हैं ।
  11. एक PVDF झिल्ली के छोटे टुकड़ों में कटौती इतनी है कि टुकड़े 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं के भीतर ठीक से फिट है, और उंहें पानी में 5 मिनट के लिए सोख । हर कुआं में कट PVDF लगाएं ।
  12. Add ८० & #181; एल के माध्यमिक-एंटीबॉडी के घोल को 6-खैर प्लेट में PVDF टुकड़ों में से प्रत्येक के लिए । coverslip रखें जैसे कि कक्ष द्वितीयक-एंटीबॉडी समाधान को स्पर्श कर सकते हैं । 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक काले, आर्द्र कक्ष में मशीन चार बार पंजाबियों के साथ धो लें ।
  13. माउंट नमूनों के साथ बढ़ते मध् यम में 4 & #39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और ग् लाइड पर coverslips को ठीक करें ।
    1. कांच स्लाइड पर DAPI के साथ बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें । एक अच्छी तरह से coverslips निकालें और उंहें गिलास DAPI के साथ बढ़ते माध्यम युक्त स्लाइड पर जगह है । सुनिश्चित करें कि सना हुआ कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक coverslip की सतह मौंन को छूता हैइसी कांच स्लाइड पर टिंग माध्यम.
    2. सभी चारों ओर नेल पॉलिश लागू करें प्रत्येक coverslip को सील करें और कांच की स्लाइड्स पर उन्हें वाटरप्रूफ ठीक करें । यदि आवश्यक हो, तो यह चरण दो बार करें ।
  14. एक अंधेरे कक्ष में कमरे के तापमान पर १.५ घंटे के लिए मशीन ।
  15. एक अंधेरे कमरे में coverslip पर विसर्जन तेल का उपयोग करके एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइड की जांच करें ।

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Representative Results

curcumin या LiCl (चित्रा 1) की विभिन्न सांद्रता वाले कक्षों के इलाज के बाद कुल ताऊ और phospho-ताऊ की अभिव्यक्ति की जांच की गई । curcumin कमी ताऊ अभिव्यक्ति स्तर की तीन अलग सांद्रता के साथ कोशिकाओं के उपचार; हालांकि, phospho-ताऊ अभिव्यक्ति curcumin की कम एकाग्रता के साथ इलाज पर वृद्धि हुई है लेकिन उच्च curcumin सांद्रता के साथ कोशिकाओं के इलाज पर कम हुई । phospho-ताऊ का पता लगाने के लिए एंटी phospho-ताऊ (Ser396) का इस्तेमाल किया गया । कुल ताऊ और phospho-ताऊ दोनों के स्तर LiCl की तीन अलग सांद्रता के साथ कोशिकाओं के उपचार पर कमी आई (चित्रा 1) । पिछले शोध से पता चला था कि ताऊ अभिव्यक्ति का स्तर अलग कैंसर के प्रकार में और एक ही कैंसर के प्रकार के विभिंन साइटों पर बदलती हैं । कोलोरेक्टल कैंसर पर पिछले डेटा से पता चला कि ताऊ ने कोलोरेक्टल कैंसर के दो सेल लाइंस (HCT ११६ और SW480) में व्यक्त किए थे जो कि19phosphorylated भी थे. कोशिकाओं में Phospho-ताऊ का स्तर 5 µ मीटर curcumin के साथ इलाज किया कोशिकाओं में उन से अधिक थे । Phospho-ताऊ का स्तर curcumin की ही एकाग्रता के साथ इलाज कोशिकाओं में कुल ताऊ से अधिक थे. 10 µ मीटर curcumin के साथ कोशिकाओं के उपचार की कमी phospho-ताऊ के स्तर की तुलना में अनुपचारित कोशिकाओं पर phospho-ताऊ अभिव्यक्ति अभी भी कुल ताऊ अभिव्यक्ति के स्तर से अधिक था । एक ही इलाज कोशिकाओं में अनुपचारित कोशिकाओं और कुल ताऊ के स्तर में phospho-ताऊ के साथ तुलना में 30 µ एम curcumin के साथ कोशिकाओं के उपचार कम phospho-ताऊ अभिव्यक्ति ।

इस पांडुलिपि को एक फॉस्फेट परख (चित्रा 2) द्वारा ताऊ की फास्फारिलीकरण स्थिति का आकलन करने के लिए एक आसान प्रोटोकॉल की स्थापना की । curcumin उपचार के बाद, कुल मिलाकर ताऊ फास्फारिलीकरण काफी बदल नहीं किया और विशिष्ट एमिनो एसिड अवशेषों पर फास्फारिलीकरण महत्वपूर्ण था (चित्रा 1). कुल मिलाकर ताऊ फास्फारिलीकरण अनुपचारित कोशिकाओं के साथ तुलना में LiCl के साथ इलाज कोशिकाओं में बंद कर दिया गया था. फॉस्फेट-उपचारित नमूनों electrophoresed से अधिक तेजी से अनुपचारित नमूनों की पुष्टि करते हुए कि अनुपचारित नमूनों फॉस्फेट-उपचारित नमूनों की तुलना में अधिक hyperphosphorylated थे. Curcumin-इलाज कोशिकाओं लगभग एक ही परिणाम दिखाई दिया, यह दर्शाता है कि कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों के उपचार ताऊ फास्फारिलीकरण कम नहीं किया के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है । दोनों फॉस्फेट-इलाज और अनुपचारित नमूने LiCl के साथ इलाज कोशिकाओं के नमूनों में लगभग एक ही सीमा पर electrophoresed, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं में ताऊ फास्फारिलीकरण कम (चित्रा 2) था. यहाँ, उच्च सांद्रता (20 µ m या 30 µ m) curcumin-इलाज के नमूनों की समग्र फास्फारिलीकरण स्थिति की तुलना करने के लिए लिया गया था, के रूप में कम एकाग्रता उपचार विशिष्ट फास्फारिलीकरण-ताऊ (phospho) S396 द्वारा पता चला उच्च साइट विशिष्ट एंटीबॉडी दिखाया.

इसके अलावा, इस प्रयोगशाला में, सेल नमूनों की microtubule बाइंडिंग परख सफलतापूर्वक ताऊ-३५२ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और केवल एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मीट्रिक टन का उपयोग कर स्थापित किया गया था (चित्रा 3) । दोनों curcumin और LiCl उपचार के लिए, microtubule बाध्यकारी गतिविधि को बाधित किया गया था, के रूप में microtubule बाध्यकारी परख द्वारा प्रदर्शित । इस प्रयोग में, curcumin उपचार microtubule बाध्यकारी क्षमताओं को दिखाने के लिए नहीं था, लेकिन पिछले अध्ययनों में उस के समान बाइंडिंग बाधित४६,४७, जबकि यह साइट-विशिष्ट ताऊ फास्फारिलीकरण को बाधित करने के लिए प्रभावी था उच्च एकाग्रता । चित्रा 1में, 10 µ एम curcumin उपचार phospho-ताऊ की न्यूनतम अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप नियंत्रण लेकिन कुल ताऊ की तुलना में उच्च अभिव्यक्ति की तुलना में । हालांकि, microtubule-कोलोरेक्टल कैंसर के बंधन क्षमता curcumin उपचार के बाद ताऊ और साथ ही LiCl उपचार के कम एकाग्रता अनुपचारित नमूने में कमी आई थी । साइट-विशिष्ट ताऊ फास्फारिलीकरण इफेक्ट्स microtubule बाइंडिंग और स्व-एकत्रीकरण४८। ताऊ फास्फारिलीकरण पर microtubule---बहुल क्षेत्र में बाधा उत्पन्न करते हैं, जबकि सी-टर्मिनल क्षेत्र में इन गुणों में वृद्धि हुई है, और एमटी-बाइंडिंग क्षेत्र के साथ दोनों क्षेत्रों के बारे में ७०% ने अपनी बाध्यकारी गुणों को कम किया और microtubules४८. कुछ अंय कारकों के साथ ही अंय साइट ताऊ के विशिष्ट फास्फारिलीकरण कोलोरेक्टल कैंसर curcumin या LiCl के साथ इलाज ताऊ के इस microtubule स्थिरीकरण के लिए शामिल हो सकता है ।

प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की छोटी मात्रा का उपयोग कर एक सीधा प्रोटोकॉल curcumin उपचार (चित्रा 4) निम्नलिखित कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों में ताऊ के स्थानीयकरण सक्षम होना चाहिए । परिणाम से पता चला कि ताऊ नाभिक के लिए translocated था curcumin उपचार, एक खोज के समान पहले अध्ययन रिपोर्टिंग कि परमाणु ताऊ एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है neurodegenerative रोगों में ंयूरॉन डीएनए संरक्षण में ऐसे अल्जाइमर रोग के रूप में४९ ,५०.

Figure 1
चित्रा 1: ताऊ और phospho-ताऊ curcumin या LiCl उपचार के बाद कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में अभिव्यक्ति । नियंत्रण कोशिकाओं या कोशिकाओं के तीन अलग सांद्रता (ए) curcumin और (ख) LiCl के साथ 24 एच के लिए इलाज से निकाले गए नमूने एसडीएस-पेज द्वारा 10% polyacrylamide जैल पर हल किया गया था और विरोधी ताऊ या विरोधी phospho-ताऊ एंटीबॉडी के साथ जांच की । पश्चिमी ब्लाटर के नतीजों का Densitometry जोडकर सही पैनल पर प्रस्तुत किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: समग्र फास्फारिलीकरण में ताऊ के अनुपचारित या विभेदक इलाज सेल नमूनों फॉस्फेट परख द्वारा पता लगाया । विषम गलियों नियंत्रण सेल निष्कर्षों को दिखाने के लिए, जबकि भी गलियों curcumin-इलाज या LiCl इलाज के नमूनों के फॉस्फेट उपचार दिखाते हैं । फॉस्फेट उपचार ने ताऊ electrophoretic गतिशीलता को अनुपचारित नमूनों से तेज कर दिया, जिसमें phosphorylated ताऊ शामिल थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Microtubule-बाध्यकारी परख द्वारा पता लगाया कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में ताऊ के Microtubule बंधन । नियंत्रण HCT ११६ कक्ष नमूने, curcumin-इलाज, या LiCl-उपचारित कक्ष नमूने और ई. कोलाई ताऊ प्रोटोकॉल खंड 4 में विस्तृत के रूप में microtubules के साथ मशीन थे । supernatant (ओं) और गोली (पी) भागों के बराबर मात्रा एक विरोधी ताऊ एंटीबॉडी के साथ immunoblotted थे । केवल मीट्रिक टन युक्त नकारात्मक नियंत्रण गलियों कि मीट्रिक टन किसी भी बंधे अंतर्जात ताऊ शामिल नहीं किया था की पुष्टि करने के लिए चला रहे थे । निचले पैनल supernatant (असीम ताऊ) और गोली (बंधे ताऊ) भागों के बीच तुलना को सक्षम करने के व्यक्तिगत नमूनों के पश्चिमी दाग के densitometry विश्लेषण से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ताऊ प्रोटीन स्थानीयकरण फोकल mic द्वारा जांच कीroscopy ।
ताऊ कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में nucleolus के लिए बाह्य रूप से स्थानीयकृत । वाम पैनलों दिखाएं ताऊ स्थानीयकरण विरोधी ताऊ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जबकि मध्य पैनलों दिखाएं नाभिक DAPI द्वारा धुंधला का उपयोग कर पाया । इलाज कोशिकाओं के नाभिक में ताऊ translocation दिखा के प्रतिनिधि उदाहरण भी दिखाया गया है । नियंत्रण कोशिकाओं ताऊ मुख्य रूप से चारों ओर और नाभिक के बाहर दिखाया गया है, जबकि इलाज कोशिकाओं में ताऊ नाभिक के अंदर भी स्थानीयकृत । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस पांडुलिपि curcumin और LiCl के साथ इलाज कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में कुल ताऊ और phosphorylated ताऊ का पता लगाने के लिए अलग प्रक्रियात्मक शर्तों की स्थापना की । प्रोटीन के नमूनों में ताऊ की समग्र फास्फारिलीकरण स्थिति का आंकलन करने के लिए एक फॉस्फेट की परख बताई गई । इस परख संभावित किसी भी प्रोटीन की फास्फारिलीकरण स्थिति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यह परख सिद्धांत है कि phosphorylated प्रोटीन अपने गैर phosphorylated राज्य की तुलना में धीमी चाल पर आधारित है । इस प्रोटोकॉल में क्षारीय फॉस्फेट और क्षारीय फॉस्फेट बफ़र का उपयोग किया जाता है । सेल lysates के लिए परख घटकों को जोड़ने के बाद, नमूने एक विशिष्ट तापमान पर एक विशिष्ट इष्टतम अवधि के लिए किया जाना चाहिए । गर्मी के बाद, नमूने एसडीएस नमूना बफर में उबला हुआ होना चाहिए प्रतिक्रिया को रोकने के लिए । इससे पहले, अलग प्रायोगिक प्रोटोकॉल microtubules के लिए ताऊ के बंधन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हो सकता है । microtubule-बाध्यकारी परख यहां प्रस्तुत जबकि दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित प्रदर्शन करने के लिए आसान है supernatant और गोली अंश का उपयोग गुणवत्ता आश्वासन प्रदान करते हैं । mt-केवल नकारात्मक नियंत्रण mt किसी बाउंड अंतर्जात तौ शामिल नहीं है कि यह सत्यापित करने के लिए उपयोग किया गया था । इसके अलावा, शुद्ध मानव ताऊ-३५२, एक microtubule बंधन ताऊ सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । microtubule-बाइंडिंग भिन्न (गोली) गैर-बाइंडिंग भिन्न (supernatant) अल्ट्रा-गति के लिए उपयोग किया गया था से अलग करने के लिए; इस प्रक्रिया की एक सीमा हो सकती है क्योंकि इस तरह के एक ultracentrifuge महंगा है और व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है । इसके अलावा, क्योंकि नमूनों की कम मात्रा में उपयोग किया जाता है, लंबे, एडेप्टर के साथ पतले केंद्रापसारक ट्यूबों ultracentrifuge रोटर में उपयोग के लिए आवश्यक हैं । हालांकि यह संभव है फिर से ऐसे ट्यूबों का उपयोग करें, एकल उपयोग के लिए पार से बचने के संक्रमण की सलाह दी जाती है । अंत में, ताऊ स्थानीयकरण प्रोटोकॉल का एक लाभ यह है कि केवल छोटी मात्रा में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की जरूरत है । निर्धारण के बाद, permeabilization, और coverslips करने के लिए अनुयाई कोशिकाओं के अवरुद्ध, एंटीबॉडी की एक छोटी सी बूंद PVDF के एक छोटे टुकड़े पर जमा किया गया था, जो फिर एक 6-खैर प्लेट के कुओं के अंदर रखा गया था । coverslips को ऐसे रखा गया था कि एंटीबॉडी कोशिकाओं तक पहुँच सके. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, उपयोग किए गए एंटीबॉडी की मात्रा को कम किया जा सकता है.

विश्वसनीय और quantifiable परिणाम सुनिश्चित करने के लिए कुछ सावधानियां रखनी चाहिए । सबसे पहले, सख्त रोकनेवाला तकनीक कोशिका संस्कृतियों और कोशिका निष्कर्षों में संक्रमण से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । पूर्ण RIPA lysis बफ़र ताज़ा तैयार किया जाना चाहिए । फॉस्फेट परख में, यह महत्वपूर्ण है 3 मिनट के लिए नमूनों को फोड़ा और शुरू एसडीएस-तुरंत फॉस्फेट-इलाज और अनुपचारित नमूनों की गर्मी के बाद पृष्ठ । ताऊ-३५२ छोटे aliquots में विभाजित किया जाना चाहिए और − 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटाने के बाद बर्फ पर रखा और उपयोग के तुरंत बाद फ्रीजर में वापस जमा कर दिया । − ८० ° c से हटाने के बाद, एमटी स्टॉक्स को बर्फ पर रखा जाना चाहिए यदि ७२ h के भीतर पुनर्उपयोग किया जाए; अंयथा, उंहें कमरे के तापमान पर रखें । PEM बफ़र एक 10x केंद्रित समाधान के रूप में तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि 1x बफर नए सिरे से बनाया जब GTP और paclitaxel जोड़े जाते है की जरूरत है ।

ताऊ के कार्य इसके फास्फारिलीकरण की सीमा तक विनियमित होते हैं । ताऊ hyperphosphorylation ताऊ के समान सामान्य वयस्क मस्तिष्क ताऊ-३५२ में घटित नहीं होता, जिसे microtubule-बाध्यकारी परख में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाता था. हालांकि, ताऊ hyperphosphorylation neurodegenerative रोगों में होता है । इस प्रोटोकॉल और बाद में परिणाम प्रदर्शित करता है कि मानव कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों भी phosphorylated ताऊ ले इसी तरह है कि अल्जाइमर रोग दिमाग में । उच्च खुराक curcumin और विशेष रूप से LiCl के साथ उपचार ताऊ फास्फारिलीकरण को कम कर सकते हैं । इस प्रकार, अल्जाइमर रोग के रूप में neurodegenerative रोगों के बीच एक अच्छा संबंध, और कोलोरेक्टल कैंसर में मौजूद हो सकता है ताऊ hyperphosphorylation करने के लिए संबंध है, और curcumin या LiCl दोनों कोलोरेक्टल कैंसर और अल्जाइमर रोग का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्त में, अध्ययनरत ताऊ फास्फारिलीकरण और ताऊ microtubule बंधन न केवल neurodegenerative रोगों के लिए बल्कि कुछ chemotherapeutics के लिए भी प्रासंगिक है क्योंकि एजेंटों कि संशोधित ताऊ microtubule बंधन गतिशील कैंसर के रूप में अध्ययन कर रहे है चिकित्सीय५१। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल संभवतः विभिंन tauopathies और कैंसर के इलाज के लिए नए चिकित्सीय एजेंटों की खोज और विकास में मदद करेगा ।

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Disclosures

लेखकों ने एलान किया कि उनका खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध के भाग के रूप में किया गया था ' शीर्षक परियोजना के विकास और औद्योगिकीकरण के उच्च मूल्य कॉस्मेटिक कच्चे माल से समुद्री शैवाल ', के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित महासागरों और मत्स्य पालन, कोरिया, और एक अंदर अनुदान द्वारा समर्थित था (2Z04930) प्राकृतिक उत्पादों के आइएसटी Gangneung संस्थान से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X - 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C

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References

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जैव रसायन १२८ अंक अल्जाइमर रोग tauopathy फास्फारिलीकरण microtubules curcumin लिथियम क्लोराइड फोकल माइक्रोस्कोपी
फास्फारिलीकरण के लिए परख और कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में ताऊ प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ बाध्यकारी Microtubule
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Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan,… More

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. H. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).

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