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Biochemistry

Saggio per la fosforilazione e l'associazione dei microtubuli con localizzazione della proteina Tau in cellule di cancro del colon-retto

Published: October 10, 2017 doi: 10.3791/55932
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

Summary

Questo manoscritto descrive protocolli standard per la misurazione iperfosforilazione di tau, associazione tau ai microtubuli e la localizzazione intracellulare Tau dopo trattamenti farmacologici di misura. Questi protocolli possono essere utilizzati in modo ripetitivo per lo screening di farmaci o altri composti che ottenere tau iperfosforilazione o dei microtubuli associazione.

Abstract

Il tau proteina microtubule-collegata è una proteina di un neurone che si localizza principalmente negli assoni. Generalmente il tau è essenziale per il normale funzionamento neuronale perché è coinvolto nella stabilizzazione e microtubuli. Oltre a neuroni, tau è espresso in umano del seno, prostata, gastrica, del colon-retto e cancri del pancreas dove Mostra struttura quasi simile ed esercita funzioni simili come il tau neuronale. La quantità di tau e sua fosforilazione può modificare la sua funzione come stabilizzatore dei microtubuli e portare allo sviluppo di filamenti elicoidali accoppiati in diversi processi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer. Determinazione dello stato di fosforilazione di tau e le sue caratteristiche di microtubule-leganti è importante. Inoltre, esaminando la localizzazione intracellulare di tau è importante in diverse malattie. Questo manoscritto particolari protocolli standard per la misurazione di fosforilazione di tau e associazione tau i microtubuli in cellule di cancro colorettale con o senza curcumina e trattamento di LiCl. Questi trattamenti possono essere utilizzati per interrompere lo sviluppo e la proliferazione della cellula tumorale. Localizzazione intracellulare di tau è esaminati mediante immunoistochimica e microscopia confocale durante l'utilizzo di basse quantità di anticorpi. Queste analisi possono essere utilizzate ripetutamente per lo screening di composti che influenzano l'iperfosforilazione di tau o associazione dei microtubuli. Approcci terapeutici utilizzati per differenti Taupatie o relativi agenti anticancro potenzialmente possono essere caratterizzati tramite questi protocolli.

Introduction

Tau è stata originariamente identificata come una proteina microtubule-collegata di termo-stabile che è stato co-purificata con tubulina1. Tau è espresso esclusivamente in più alti eucarioti2,3,4. La funzione principale di tau è quello di controllare microtubule Assemblea1,5,6. Contribuisce anche alla polimerizzazione dei microtubuli7, trasporto assonale8, cambiamenti nel diametro assonale9, formazione di neuroma polarità e neurodegenerazione10. Tau funge anche da un'impalcatura di proteine per controllare alcune vie di segnalazione. Gli studi del cervello di ratto suggeriscono che tau è neurone-specifico e che localizza principalmente in assoni11. Perché tau è essenziale per la polimerizzazione dei microtubuli e sviluppo neuronale, tau è stata supposta per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di axonal nel sistema nervoso centrale; Questa ipotesi è stato successivamente verificato da esperimenti in vitro e in vivo . Oltre ai neuroni, tau è espresso in cellule non neuronali differenti, compreso fegato, rene e muscolo cellule12,13. Tau è espresso anche in umano del seno, della prostata, del colon-retto, gastrica e cancro del pancreas cella linee e tessuti14,15,16,17,18, 19. tau si trova anche nella miosite come twisted tubulofilaments in corpi di inclusione20.

Tau può trasportare parecchie modifiche post-traduzionali. Di tutte le modifiche post-traduzionali, fosforilazione è il più comune. Fosforilazione di tau aumento diminuisce la sua affinità per i microtubuli, infine destabilizzare il citoscheletro. Siti di fosforilazione di ottantacinque sono stati descritti nella proteina tau isolato dai tessuti di cervello umano del morbo di Alzheimer. Di questi siti, 53% costituiscono serina, treonina 41% e solo 6% tirosina residui21,22,23. La fosforilazione di Tau influisce sulla sua localizzazione, funzione, associazione, solubilità e della sua suscettibilità ad altre modificazioni post-traduzionali. Anche la fosforilazione di tau a oltre la misura normale (o completamente saturo con gruppi fosfato) è conosciuto come iperfosforilazione che replica le caratteristiche strutturali e funzionali del morbo di Alzheimer24. Tau mantiene il corretto funzionamento dei microtubuli assonali e assicura il normale funzionamento neuronale in condizioni fisiologiche. Tuttavia, tau iperfosforilata non riesce a mantenere un'associazione ben organizzata dei microtubuli, causando la perdita di un neurone a causa di disassemblaggio dei microtubuli. Sono necessari per tau corretto funzionamento normali livelli di fosforilazione di tau, ma tau non riesce a funzionare normalmente se il livello di fosforilazione caratteristico è alterato e se è hyperphosphorylated25. Nel morbo di Alzheimer e di alcuni altri disordini neurodegenerative relativi all'età, tau diventa hyperphosphorylated e forma i filamenti elicoidali accoppiati e grovigli neurofibrillary26,27. Così, i metodi per determinare la fosforilazione di tau e associazione dei microtubuli sono importanti.

Cancro colorettale, un cancro di invecchiamento-collegato, è che il terzo più frequentemente diagnosticato cancro e il terzo cancro prominente di causa di morte per uomini e donne28. Il cancro colorettale è uno dei cancri più principali causa di morte nel mondo occidentale29. Perché sia cancro colorettale e morbo di Alzheimer sono associate con l'invecchiamento e sia capita soprattutto nei paesi sviluppati, dove le persone godono simili abitudini alimentari, le due malattie possono in qualche modo essere correlate. Inoltre, le cellule tumorali tau-positivi e negativi tau rispondono in modo diverso agli agenti chemioterapeutici, ad es., paclitaxel16.

La curcumina è uno dei principali derivati di Curcuma longa, la curcuma spezia indiana30. Per secoli, popolazioni sud asiatiche hanno consumato curcuma nella loro dieta su base giornaliera. La curcumina è usata per trattare diverse patologie, compreso cancro colorettale, morbo di Alzheimer, diabete, fibrosi cistica, malattie infiammatorie intestinali, artrite, iperlipidemia, aterosclerosi e malattia cardiaca ischemica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. al litio può anche uccidere le cellule tumorali del colon-retto o prevenire la loro proliferazione39. Litio può essere utilizzato anche per il trattamento del morbo di Alzheimer40 come si diminuisce l'aggregazione di tau e impedisce la sua iperfosforilazione come osservato in un topo transgenico modello41,42,43, 44.

Questo manoscritto si propone di: 1) misurare la tau totale e livelli di espressione di phospho-tau in cellule trattate; 2) descrivere un'analisi della fosfatasi per misurare la fosforilazione di tau complessiva; 3) esaminare microtubule-leganti di tau; e 4) localizzare tau mediante microscopia confocale in linee cellulari di cancro colorettale trattate con curcumina o LiCl. I risultati rivelano che il trattamento delle cellule con la curcumina, che è un agente chemioterapeutico apparentemente buono per tumore del colon, e trattamento con LiCl può ridurre l'espressione di entrambi tau totale e fosforilato tau in linee cellulari di cancro colorettale. Questi trattamenti possono anche causare la traslocazione nucleare di tau. Tuttavia, inaspettatamente, la curcumina non riesce a migliorare associazione di tau i microtubuli.

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Protocol

1. preparazione dei reagenti

  1. aggiungere 10 µ l di soluzione di fluoruro phenylmethylsulfonyl di (1 mM), 10 µ l (1 x da deposito x 100) di soluzione cocktail dell'inibitore di proteasi e 10 µ l (1 x da deposito x 100) di fosfatasi il soluzione cocktail inibitore a 1 mL di tampone di dosaggio (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 per preparare il tampone di lisi completa RIPA.
  2. Preparare 10 x buffer buffer (PEM) generale tubulina.
    1. Aggiungi 800mm (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acido, 10 mM (95,1 mg) glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetico acido, 10 mM (51 mg) MgCl 2 e 1,25 M (3 mL di 10 M) NaOH in un tubo da 50 mL , mescolare con 15 mL di acqua distillata e sciogliere utilizzando un vortice. Controllare il pH (dovrebbe essere 6,9). Se pH > 6.9, scartare il buffer e rifare un sacco di fresco.
      Nota: NaOH dovrebbe essere inferiore a 1,25 M per garantire che il pH non overshoot 6,9. Non è consigliabile utilizzare HCl per regolazione pH > 6.9.
    2. Aggiungi NaOH goccia a goccia fino a quando il pH è 6.9. Aggiungere acqua distillata per fare fino a 25 mL di buffer di 10 X PEM. Infine, applicare un filtro tramite una siringa e un filtro per siringa 0,2 µm. Dividere questo buffer in aliquote in provette da 1,5 mL e conservare a 4 ° C.
  3. Preparare 5 x tampone del campione con agente riducente e tintura.
    1. Mix 300 µ l (60 mM) di 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) di glicerolo al 50%, 1 mL (2%) di 10% sodio dodecil solfato (SDS) e 1,2 mL di acqua distillata per compensare 5 mL di SDS sample buffer 5x. Conservare a − 20 ° C.
      Nota: Poiché il glicerolo è viscoso, misura 1,25 mL glicerolo è difficile. Un mL di glicerolo al 100% pesa 1,26 g. Così, pesare 1,575 g di glicerolo al 100% (che equivale a 1,25 mL del 100% o 2,5 mL di glicerolo al 50%) in un 15 mL tubo prima; mescolare bene con gli altri componenti.

2. Cultura, trattamento con curcumina o trattamento LiCl e l'esame dell'espressione della proteina delle cellule

  1. Aggiungi ~ 1 x 10 6 HCT 116 celle in 100 mm piatti di coltura del tessuto contenente la Media essenziale minimo (MEM) completati con 10% fetale bovino siero (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina. Dopo un giorno di coltura, le cellule raggiungerà la confluenza di 60-70%.
    Nota: Il numero di piatti necessari dipende dal numero di trattamenti descritti di seguito.
  2. Quando le cellule raggiungono ~ 65% confluenza (approssimata utilizzando la microscopia), rimuovere il mezzo MEM completati e aggiungere MEM privo di siero con 5 µM 10 µM e 30 µM curcumina o 25 mM, 50 mM e 100 mM LiCl. Incubare a 37 ° C per 24 h in atmosfera umidificata contenente 5% CO 2.
  3. 24 h dopo il trattamento, lavare le cellule con soluzione di 1 mL ghiacciata tampone fosfato (PBS) e raschiare le celle utilizzando un raschietto di cella. Trasferimento le cellule raschiate in 1,5 mL provette da centrifuga e centrifugare per 4 min a 1.800 x g a 4 ° C per ottenere il pellet cellulare.
  4. Lisare le cellule sospendendo il pellet in 100 µ l di buffer RIPA completo a 4 ° C per 20 minuti mentre toccando regolarmente i tubi. Sottoporre brevemente agli ultrasuoni campioni.
  5. Centrifugare gli omogeneati delle cellule in una centrifuga da banco a 22.570 x g per 20 min a 4 ° C. trasferire i surnatanti in altre provette usando una pipetta.
  6. Misurare la concentrazione di proteina nei surnatanti del saggio di Bradford 45 usando i kit commerciali di analisi della proteina.
    7. Buffer di gel-caricamento di
  7. preparare campioni di concentrazione nella proteina uguale (10 µ g proteine/13 µ l di campione) dei lisati cellulari con 4 X SDS. Preparate 4 x buffer di gel-caricamento SDS fresco contenente 400 mM dithiothreitol (DTT).
    Nota: In questa fase, campioni possono essere conservati a − 20 ° C, se necessario.
  8. Incubare i campioni su un blocco di calore a 100 ° C per 5 min, mescolano i campioni utilizzando un vortice e aspettare per raffreddarli per ~ 10-15 min.
  9. Montare un sistema di elettroforesi.
    1. Carico 10 µ g proteine (13 µ l di campione) per bene su un gel di SDS-poliacrilammide del 10% per elettroforesi (SDS-PAGE). Caricare la scala di peso molecolare sul gel a una sola corsia.
      Nota: Elettroforesi all'avvio, la scala di proteina risolverà in fasce della proteina di peso molecolare apparente. Utilizzare queste bande per stimare il peso molecolare delle bande proteiche sconosciuto.
    2. Dopo aver caricato i campioni, collegare gli elettrodi positivi e negativi del sistema elettroforesi a una fonte di alimentazione per mantenere una tensione costante. Inizialmente, iniziare a 70 V per 20 min a spostare i campioni di proteine dal gel d'impilamento in gel di risoluzione. Quindi, aumentare la tensione a 125 V per circa 70-120 min fino a campioni e scaletta della proteina raggiunge la fine del gel.
    3. Dopo il completamento dell'elettroforesi, il gel di trasferimento ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) utilizzando un sistema di electroblotting bagnato. Trasferimento per ~ 100 min a 100 V. blocco della membrana in tampone bloccante 4% albumina di siero bovino (BSA) per 90 min a temperatura ambiente di circa 25 ° C.
  10. Contrassegnare il blot tagliandolo sul lato con la scala di peso molecolare. Utilizzare un foglio di plastica trasparente e un cutter affilato per tagliare la macchia. Preparare le soluzioni primarie-anticorpo (anti-tau al 1:5, 000; anti-phospho-tau al 1:4, 000) e incubare la macchia in questa soluzione a 4 ° C durante la notte.
  11. Dopo incubazione overnight, lavare la macchia per 7 min quattro volte in soluzione tampone fosfato salino-Tween-20 (PBST).
  12. Preparare le soluzioni pertinenti di secondaria-anticorpo (anti-coniglio di capra o anti-IgG di topo a 1:5, 000) e incubare la macchia in questa soluzione per 90 min a temperatura ambiente di circa 25 ° C. lavare in PBST quattro volte, 7 min ogni.
  13. Sviluppare la macchia usando un kit di chemiluminescenza secondo il produttore ' consigli di s. Coprire la macchia usando un involucro di plastica trasparente. Acquisire immagini da una sistema per chemiluminescenza con relativo software di imaging di chemiluminescenza.

3. Analisi della fosfatasi

  1. trattare i lisati di cellule (dal punto 2.5) con fosfatasi alcalina nel buffer della fosfatasi alcalina.
    1. Per sia il controllo e campioni trattati, preparare 20 µ l campioni contenenti 20 µ g proteina totale. Aggiungere il volume di lisati cellulari che contiene 20 µ g proteine totali, seguita da 2 µ l di tampone di fosfatasi alcalina e 10 µ l fosfatasi alcalina. Aggiungere acqua distillata per compongono 20 µ l.
  2. Incubare i campioni a 37 ° C per 1 h. fermare la reazione aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) ad una concentrazione finale di 50 mM, o aggiungendo orthovanadate del sodio (Na 3 VO 4) ad una concentrazione finale di 10 mM. La reazione può essere fermata anche da riscaldamento a 75 ° C per 5 min.
  3. Prima che finisca l'incubazione dei campioni con fosfatasi, preparare i campioni della stessa concentrazione senza aggiunta di fosfatasi per confronto con campioni trattati con fosfatasi.
  4. Aggiungi il 4 preparata buffer di gel-caricamento SDS X contenente 400 mM DTT.
  5. Incubare i campioni su un blocco di calore a 100 ° C per 5 min, Mix i campioni utilizzando un vortice. Raffreddare a temperatura ambiente per ~ 10-15 min.
  6. Assemblare un sistema di elettroforesi per l'esecuzione di un gel di poliacrilammide di 10% SDS-page.
    1. Carico 10 µ g proteine (13 µ l di campione) per bene su un polyacry di 10%gel di Lilliu. Caricare la scala di peso molecolare.
    2. Dopo il caricamento del campione, collegare gli elettrodi positivi e negativi del sistema elettroforesi a una fonte di alimentazione per mantenere una tensione costante. Inizialmente, iniziare a 70 V per 20 min a spostare i campioni di proteine dal gel d'impilamento in gel di risoluzione. Quindi, aumentare la tensione a 125 V ed eseguire il gel per circa 70-120 min fino a campioni e scaletta della proteina raggiunge la fine del gel.
    3. Dopo il completamento dell'elettroforesi, trasferire il gel su una membrana PVDF utilizzando un sistema di electroblotting bagnato. Trasferimento per ~ 100 min a 100 V.
    4. Mark il blot facendo un piccolo taglio sul lato della scala di peso molecolare. Utilizzare un foglio di plastica trasparente e un cutter affilato per tagliare il blot.
  7. Bloccare la membrana in tampone bloccante di 4% BSA per 90 min a temperatura ambiente.
  8. Incubare la macchia in soluzione primaria-anticorpo (anti-tau al 1:5, 000) a 4 ° C durante la notte. Lavare la macchia in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuno,.
  9. Preparare la soluzione di anticorpo secondario pertinente (capra anti-IgG di topo a 1:5, 000) e incubare la macchia per 90 min a temperatura ambiente. Lavare in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuno,.
  10. Sviluppare la macchia usando un kit di chemiluminescenza secondo il produttore ' consigli di s. Coprire la macchia all'interno di un involucro di plastica trasparente. Acquisire immagini da una sistema per chemiluminescenza con relativo software di imaging di chemiluminescenza.

4. Dosaggio di microtubule-leganti

  1. per il dosaggio di associazione dei microtubuli, ripetere i passaggi da 2.1-2.6.
  2. Preparare 1 X (2 mL) PEM tampone dal buffer di 10 X PEM conservati a 4 ° C aggiungendo 20 µM (40 µ l) paclitaxel e GTP (20 µ l) di 1 mM. Fare il microtubulo (MT) punto da − congelatore 80 ° C e lo stock di lavoro tau di e. coli da − congelatore 20 ° C.
  3. Preparare campioni come da tabella 1.
  4. Incubare a 37 ° C per 30 min. ultracentrifuga a 25 ° C per 60 min a 100.000 x g.
  5. Trasferire 120 µ l di sovranatante contenente non associato tau, per pulire e provette.
  6. Aggiungere 120 µ l (stesso volume come supernatante) di 5 X campione buffer per il pellet contenente associato tau e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione per pulire le provette e mescolare accuratamente.
  7. Misurare la concentrazione di proteina (Vedi punto 2.6).
    Nota: Durante la preparazione dei campioni, utilizzare il volume della soluzione (punto 4.6) per la preparazione dei campioni il pellet e il surnatante.
  8. Preparare campioni di concentrazione nella proteina equivalente e aggiungere preparate 4 x buffer di gel-caricamento SDS contenente DTT (400 mM).
    Nota: I campioni possono essere conservati a − 20 ° C in questa fase.
  9. Ripetere i passaggi da 3.5-3.10.
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esempio nome Microtubule necessari principale proteina necessaria PEM-GTP-PTX
1 2 μl HCT 116-controllo (6.21 μg/μl) 9.66 μl (60 μg) μl 108.34
2 HCT 116-curcumina 10 μM (4.81 μg/μl) 2 μl μl 16.63 (80 μg) 101.37 μl
3 HCT 116-curcumina 20 μM (3,28 μg/μl) 2 μl μl 30.49 (100 μg) μl 87.51
4 HCT 116-LiCl 25mm (5.43 μg/μl) 2 μl μl 18.42 (100 μg) 99.58 μl
5 Escherichia coli tau μl 2 1 μl Tau-352 μl 117
6 MT solo μl 2 X μl 118
120 μl di ogni

tabella 1: preparazione per l'analisi di microtubule-leganti del campione.

5. localizzazione ed espressione di Tau dopo trattamento delle cellule con curcumina

  1. un vetrino coprioggetti utilizzando etanolo al 70% di pulirlo e asciugarlo utilizzando un tessuto di laboratorio. Inserire un singolo vetrino coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra con etichetta 6-pozzetti-coltura del tessuto. Collocare la piastra su una sicurezza biologica armadio e accendere una luce UV per almeno 3 h.
  2. Sottocultura le cellule e loro seme nei pozzetti della piastra 6 pozzetti pertinenti a 2,5 x 10 5 cellule/pozzetto in terreno di coltura consigliata.
  3. Dopo ~ 24 h, esaminare le cellule con un microscopio invertito utilizzando sia il 10 X e 40 X obiettivi per verificare alterazioni morfologiche cellulari. Registrare foto se necessario.
  4. Sciacquare le cellule due volte con PBS. Fissare le cellule in 3,7% formaldeide in un incubatore a 37 ° C al buio.
    Nota: La fissazione di formaldeide a temperatura ambiente funziona bene, troppo. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale per maneggiare formaldeide.
  5. Lavare le cellule in PBS. Difficoltà cellule in metanolo ghiacciato a − 20 ° C per 15 min Permeabilize le cellule di incubarle in 3% BSA e 0,1% Triton X-100 in PBS in ghiaccio per 10 min. lavare le cellule con PBS.
  6. Incubare le cellule in tampone bloccante (3% BSA e 0,1% Tween-20 in soluzione PBS) per 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: Incubazione per 2 ore a 4 ° C funziona bene, anche.
  7. Preparare la soluzione primaria-anticorpo (anti-tau al 1: 200) in 3% BSA e 0,1% Tween-20 in PBS (ad es., 2 µ l tau-13 anticorpo in 0,4 mL di tampone).
  8. Tagliare piccoli pezzi di un PVDF membrana modo che i pezzi si incastrano correttamente all'interno di ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti; in ammollo in acqua per 5 min, posto il taglio PVDF in ciascun pozzetto.
  9. Aggiungere 60 µ l di soluzione di anticorpo primario al taglio pezzi PVDF in ciascun pozzetto. Posizionare i vetrini coprioggetti tale che le cellule possono toccare la soluzione primaria-anticorpo. Incubare per una notte a 4 ° C in una camera buia, umida. Quattro tempi di lavaggio in PBS.
  10. Preparare la soluzione di anticorpo secondario (coniugato con fluoresceina 594 anti-IgG di topo a 1: 400) in 3% BSA e 0,1% Tween-20 in PBS.
  11. Tagliare piccoli pezzi di una membrana PVDF, in modo che i pezzi adattano correttamente all'interno di ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti e metterli a bagno in acqua per 5 min, posto il taglio PVDF in ciascun pozzetto.
  12. Aggiungere 80 µ l della soluzione secondaria-anticorpo per ognuno dei pezzi PVDF in lastra 6 pozzetti. Posizionare il vetrino coprioggetto tale che le cellule possono toccare la soluzione di anticorpo secondario. Incubare i quattro volte in una camera buia, umida a temperatura ambiente per 2 h. lavaggio con PBS.
  13. Mount campioni nel mezzo di montaggio con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e fissare i coprioggetti su vetrini.
    1. Aggiungi una goccia di mezzo di montaggio con DAPI sulle lastre di vetro. Togliere i vetrini coprioggetto da ciascun pozzetto e metterli sulle lastre di vetro contenente il mezzo di montaggio con DAPI. Assicurarsi che la superficie di ogni vetrino coprioggetti contenenti cellule marcate tocca il mounmezzo di Ting su vetrino corrispondente.
    2. Applica smalto tutto intorno ogni vetrino coprioggetto per sigillare e correggerli ermetico sulle lastre di vetro. Se necessario, eseguire questo passaggio due volte.
  14. Incubare per 1,5 h a temperatura ambiente in una camera oscura.
  15. Esaminare i vetrini con un microscopio confocale utilizzando olio di immersione sul coprioggetto in una stanza buia.

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Representative Results

Espressione di totale tau e fosfo-tau è stata esaminata dopo aver trattato le cellule con differenti concentrazioni di curcumina o LiCl (Figura 1). Trattamento delle cellule con le tre diverse concentrazioni di curcumina ha fatto diminuire i livelli di espressione di tau; Tuttavia, phospho-tau espressione aumentata dal trattamento con bassa concentrazione di curcumina ma è diminuito al momento trattando le cellule con alte concentrazioni di curcumina. Anti-phospho-tau (Ser396) è stato utilizzato per il rilevamento di phospho-tau. Livelli di phospho-tau e tau totale diminuiti sul trattamento delle cellule con le tre diverse concentrazioni di LiCl (Figura 1). La ricerca precedente aveva indicato che i livelli di espressione di tau variano in diversi tipi di cancro e ai luoghi differenti dei tipi del cancro stesso. Dati precedenti su cancro colorettale ha mostrato che quel tau è stato espresso in due linee cellulari (HCT 116 e SW480) di cancro colorettale che erano anche fosforilato19. Livelli di phospho-tau in cellule trattate con curcumina µM 5 erano superiori a quelli in cellule non trattate. Livelli di phospho-tau erano superiori totale tau in cellule trattate con la stessa concentrazione di curcumina. Trattamento delle cellule con 10 µM curcumina ha fatto diminuire i livelli di phospho-tau rispetto alle cellule non trattate, ma espressione di phospho-tau era i livelli di espressione di tau ancora più totale. Trattamento delle cellule con 30 µM curcumina abbassata phospho-tau espressione confrontato con phospho-tau in cellule non trattate e tau totale i livelli nelle stesse cellule trattate.

Questo manoscritto stabilito un protocollo semplice per valutare lo stato di fosforilazione di tau da un'analisi della fosfatasi (Figura 2). A seguito di trattamento della curcumina, la fosforilazione di tau complessivo non è cambiato significativamente e fosforilazione di specifici residui amminoacidici era significativa (Figura 1). Nel complesso la fosforilazione di tau è stata interrotta in cellule trattate con LiCl rispetto alle cellule non trattate. Campioni trattati con fosfatasi electrophoresed più veloce di campioni non trattati, verifica che i campioni non trattati erano più hyperphosphorylated di campioni trattati con fosfatasi. Cellule trattate con curcumina ha mostrato quasi gli stessi risultati, che indica che il trattamento di linee cellulari di cancro colorettale non ha ridotto fosforilazione di tau come mostrato nella Figura 1. Fosfatasi-trattati e non trattati campioni electrophoresed a quasi lo stesso intervallo in campioni di cellule trattate con LiCl, che indica che la fosforilazione di tau in queste cellule è stato ridotto (Figura 2). Qui, le alte concentrazioni (20 µM o 30 µM) di campioni di curcumina-trattate sono state prese per confrontare lo stato di fosforilazione generale, come bassa concentrazione trattamento ha mostrato maggiore fosforilazione site-specific ha rivelata dall'anticorpo specifico phospho-tau (S396).

Inoltre, in questo laboratorio, l'analisi di associazione dei microtubuli di campioni delle cellule è stata stabilita con successo usando tau-352 come controllo positivo e solo MT come controllo negativo (Figura 3). Per entrambi la curcumina e trattamento LiCl, microtubule-leganti attività è stata inibita, come dimostrato dall'analisi di associazione dei microtubuli. In questo esperimento, il trattamento della curcumina non ha mostrato microtubule funzionalità di associazione, ma ha inibito il grippaggio simile a quella di precedenti studi46,47, considerando che era efficace inibire la fosforilazione di tau site specific presso maggiore concentrazione. In Figura 1, trattamento della curcumina 10 µM provocato minima espressione di phospho-tau rispetto al controllo ma più alta espressione di tau totale. Tuttavia, capacità di microtubule-leganti del tau di cancro colorettale dopo trattamento della curcumina e bassa concentrazione di LiCl trattamento è stata diminuita nel campione non trattato. La fosforilazione di tau site-specific effetti dei microtubuli associazione e auto-aggregazione48. Fosforilazione di Tau presso regione ricca di prolina ostacolato microtubule-leganti, considerando che la regione C-terminale aumentato queste proprietà, ed entrambe le regioni insieme a regione MT-legante ha diminuito la sua proprietà di associazione di circa il 70% e disordinata la microtubuli48. Alcuni altri fattori, come pure altre site-specific fosforilazione di tau potrebbe essere coinvolti per questa destabilizzazione dei microtubuli di tau di cancro colorettale trattate con curcumina o LiCl.

Un semplice protocollo utilizzando piccole quantità di anticorpi primari e secondari abilitato localizzazione di tau in linee cellulari di cancro colorettale dopo trattamento della curcumina (Figura 4). Risultati hanno mostrato che il tau aveva trasloca nel nucleo dopo trattamento della curcumina, un'individuazione simile a precedenti studi che riferiscono quel tau nucleare è un giocatore chiave nella protezione del DNA neuronale nelle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer di49 ,50.

Figure 1
Figura 1: Tau e fosfo-tau espressione in cellule di cancro del colon-retto seguendo la curcumina o trattamento LiCl. Campioni estratti da cellule di controllo o cellule trattate per 24 h con tre differenti concentrazioni di curcumina (A) e (B) LiCl sono stati risolti su gel di poliacrilammide di 10% SDS-PAGE e sondate con anticorpo anti-tau o anti-phospho-tau. Densitometria analisi i risultati di Western blot sono presentati sul pannello di destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: nel complesso fosforilazione di tau in non trattata o trattata differenzialmente campioni di cellule rilevati dall'analisi della fosfatasi. Corsie dispari Visualizza controllo cella estratti, considerando che anche corsie Visualizza trattamento fosfatasi di curcumina-trattati o trattati con LiCl campioni. Trattamento della fosfatasi fatto la mobilità elettroforetica di tau più veloce di campioni non trattati, che conteneva tau fosforilata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: associazione dei microtubuli di tau in cellule di cancro del colon-retto rilevate dall'analisi del microtubule-leganti. Campioni di cellule HCT 116 controllo, curcumina-trattati, o campioni di cellule LiCl-trattati ed e. coli tau sono state incubate con microtubuli come specificato nel protocollo sezione 4. Gli importi equivalenti del surnatante (S) e le frazioni di pellet (P) sono stati immunoblotted con un anticorpo anti-tau. Corsie di controllo negativo contenente solo MT sono state eseguite per confermare che MT non conteneva alcun associato tau endogeno. Pannello inferiore mostra densitometria analisi di Western Blot di singoli campioni che consente il confronto tra surnatante (non associato tau) e frazioni di pellet (associato tau). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: La localizzazione della proteina Tau esaminata dal mic confocalespettroscopica.
Tau localizzato perifericamente il nucleolo in cellule di cancro del colon-retto. Pannelli a sinistra Visualizza localizzazione tau rilevato usando l'anticorpo monoclonale anti-tau, mentre pannelli mostrano nucleo macchiatura di DAPI. Inoltre vengono illustrati esempi rappresentativi delle cellule trattate mostrando la traslocazione di tau nel nucleo. Cellule di controllo ha mostrato tau principalmente attorno e di fuori dei nuclei, mentre tau in cellule trattate localizzata anche all'interno dei nuclei. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo manoscritto stabilito diverse condizioni procedurale per la rilevazione totale tau e fosforilato tau in cellule di cancro colorettale trattate con curcumina e LiCl. Per valutare lo stato generale di fosforilazione di tau nei campioni della proteina, è stata descritta un'analisi della fosfatasi. Questo test può potenzialmente utilizzabili per esaminare lo stato di fosforilazione di tutta la proteina.

Questa analisi è basata sul principio che fosforilato proteina mosse più lento del suo stato di non-fosforilate. Fosfatasi alcalina e della fosfatasi alcalina buffer vengono utilizzati nel presente protocollo. Dopo aver aggiunto i componenti di analisi i lisati cellulari, i campioni vanno incubati per una durata ottima a una temperatura specifica. Dopo l'incubazione, i campioni dovrebbero essere bolliti nel buffer del campione SDS per arrestare la reazione. In precedenza, diversi protocolli sperimentali sono stati utilizzati per valutare l'associazione di tau i microtubuli. Il dosaggio di microtubule-leganti qui presentato è facile da eseguire mentre inclusi i controlli positivi e negativi per fornire garanzia di qualità utilizzando frazioni surnatante e pellet. Il controllo negativo solo MT è stato utilizzato per verificare che MT non contiene qualsiasi associato tau endogeno. In aggiunta, 352-puro umano tau, un tau microtubule-leganti è stato utilizzato come controllo positivo. È stato usato per separare la frazione di microtubule-leganti (pellet) dalla centrifugazione di ultra-velocità (surnatante) frazione non vincolanti; Questa procedura può essere una limitazione perché tali un'ultracentrifuga è costoso e non è ampiamente disponibile. Inoltre, poiché piccole quantità di campioni sono usati, long, provette per centrifuga sottile con adattatori sono necessari per l'uso nel rotore ultracentrifuga. Anche se è possibile riutilizzare tali tubi, monouso è consigliabile evitare la contaminazione incrociata. Infine, un vantaggio del protocollo tau-localizzazione è che sono necessari solo piccole quantità di anticorpi primari e secondari. Dopo la fissazione, permeabilizzazione e blocco dell'aderente di cellule alle lamelle, una piccola goccia di anticorpo è stata depositata su un piccolo pezzo di PVDF, che fu poi collocato all'interno dei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Le lamelle sono state mantenute tali che l'anticorpo potrebbe accedere alle celle. Utilizzando questo protocollo, la quantità di anticorpi utilizzati possa essere minimizzata.

Alcune precauzioni dovrebbero essere tenute presente per garantire risultati affidabili e quantificabili. In primo luogo, tecniche asettiche rigorose devono essere utilizzati per evitare la contaminazione in colture cellulari ed estratti delle cellule. Il buffer di lisi RIPA completo deve essere preparato fresca. Nell'analisi della fosfatasi, è importante far bollire i campioni per 3 min e SDS-pagina iniziale subito dopo incubazione dei campioni di fosfatasi-trattati e non trattati. Tau-352 dovrebbe essere diviso in piccole aliquote e tenuta su ghiaccio dopo la rimozione dal freezer − 20 ° C e depositati nuovamente dentro il congelatore immediatamente dopo l'uso. Dopo la rimozione dal − 80 ° C, MT scorte dovrebbero essere tenute su ghiaccio se riutilizzato all'interno di 72 h; in caso contrario, tenerli a temperatura ambiente. Il buffer PEM deve essere preparato come un 10x concentrato soluzione perché il buffer 1x deve essere preparata quando vengono aggiunti GTP e paclitaxel.

Funzioni di Tau sono regolate dalla misura della sua fosforilazione. Iperfosforilazione di Tau non si verifica in tau cervello adulto normale simile a tau-352, che è stato usato come controllo positivo nell'analisi della microtubule-leganti. Tuttavia, iperfosforilazione di tau si verifica nelle malattie neurodegenerative. Questo protocollo e risultati successivi dimostrano che linee cellulari di cancro colorettale umano anche trasportano tau fosforilata allo stesso modo che nel cervello del morbo di Alzheimer. Trattamento con curcumina della alto-dose e soprattutto LiCl può minimizzare la fosforilazione di tau. Pertanto, una buona correlazione tra malattie neurodegenerative quali il morbo di Alzheimer ed il cancro colorettale può esistere per quanto riguarda la iperfosforilazione di tau e la curcumina o LiCl può essere utilizzato per il trattamento di cancro colorettale e morbo di Alzheimer. Infine, studiando la fosforilazione di tau e associazione dei microtubuli tau è significativamente rilevante non solo per le malattie neurodegenerative ma anche per alcuni chemioterapici perché agenti che modificano associazione microtubule tau sono studiati in modo dinamico come cancro Therapeutics51. I protocolli presentati qui aiuterà potenzialmente la scoperta e lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici per il trattamento di tumori e diversi Taupatie.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata eseguita come parte del progetto dal titolo "Sviluppo e industrializzazione di alto valore materie prime cosmetiche da microalghe marine", finanziato dal Ministero degli oceani e pesca, Corea e fu sostenuta da una sovvenzione intramurale (2Z04930) da KIST Gangneung Istituto di prodotti naturali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X - 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C

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References

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Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan,… More

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. H. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).

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