Summary

Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Published: November 21, 2017
doi:

Summary

Мы представляем собой протокол для быстрого характеристика биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия с термолабильных лигандов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.

Abstract

Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) – это мощный метод для количественной оценки термодинамических параметров, регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия. Эта информация имеет решающее значение в разработке новых фармацевтических соединений. Однако многие фармацевтически соответствующих лигандов являются химически неустойчивыми при высоких температурах, используемых в ДСК анализов. Таким образом измерения привязки взаимодействия сложным, потому что концентраций лигандов и термически преобразованы продукции постоянно меняются в ячейке калориметра. Здесь мы представляем протокол, с помощью термолабильных лигандов и ДСК для быстрого получения термодинамические и кинетические информации о складывания, привязки и лигандом процессов преобразования. Мы применили метод к ДНК aptamer MN4, которая связывает термолабильных лигандом кокаина. С помощью новой глобальной установки анализа, который приходится термолабильных лигандом преобразования, полный набор складывания и привязки параметров получаются из пару DSC экспериментов. Кроме того мы показываем, что константа скорости термолабильных лигандом преобразования могут быть получены с только один дополнительный набор DSC. Представлены руководящие принципы выявления и анализа данных из нескольких более сложных сценариев, включая необратимой агрегации биомолекулы, медленно складывающиеся, медленно привязки, и быстрое истощение запасов термолабильных лиганда.

Introduction

Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)-это мощный метод для quantitating биомолекулярных привязки и складной взаимодействия1,2,3. Сильные ДСК включают способность для уточнения привязки и складные механизмы и давать соответствующие термодинамических параметров2,3. Кроме того DSC может быть выполнена в растворе рядом физиологических условиях и не требует маркировки биомолекулы или лиганд, например, с флуорофоров, спин этикетки или ядерные изотопы4. Инструмент сканирует температуры, измерять количество тепла, необходимое чтобы денатурировать биомолекулы в присутствии и отсутствии лиганда. Результате термограммы используются для извлечения термодинамических параметров, управляющих лигандом привязки и складывающиеся процессов. Информацию, представленную ДСК или других термодинамических методов имеет решающее значение для руководства дизайн наркотиков ориентации биомолекул1,5,6,,78. Однако повторное сканирование для высоких температур (~ 60-100 ° C) может быть проблематичным. Например многие фармацевтически важных соединений проходят перегруппировки или разложение после устойчивого воздействия высокой температуры9,10,11, т.е., они термолабильных. Экспертиза привязки взаимодействия, DSC, обычно требует несколько вперед и обратного сканирования для проверки воспроизводимости термограммы термодинамический анализ12. Термический первоначального лигандом для вторичной формой с характеристиками измененной привязки приводит к заметными различиями в форму и положение последовательных термограммы, так как концентрация первоначального лигандом уменьшается с каждой проверки во время Термический продуктов накапливаются. Эти наборы данных не поддаются традиционным анализом.

Мы недавно разработали метод глобальные установки для термолабильных лигандом DSC наборов данных, что дает полный набор термодинамических параметров регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия от одного лиганд прыгните эксперимент, связанный с требуемой термограммы для свободного биомолекулы4. Анализ уменьшает время экспериментальных и образец требует ~ 10 раз по сравнению с стандартным DSC подходов. Мы составили для лигандом термический, предполагая, что это происходит во время высокой температуры часть каждого сканирования, где термограммы не зависит от концентрации лиганда. Таким образом концентрация лиганд — константа, в части термограммы, который используется для извлечения термодинамических параметров. Дополнительно мы продемонстрировали, как константа скорости лигандом термический можно получить, выполнив один дополнительный эксперимент с более длительный период уравновешивания высокой температуры. Для систем, где лигандом термический менее зависит от температуры (т.е., в значительной степени происходит при всех температурах), анализ может быть изменен для включения переменной лигандом концентрации. Здесь мы показываем эту процедуру для ДНК aptamer MN4 присутствии термолабильных лигандом кокаина, который быстро преобразует бензилэкгоин при высоких температурах (> 60 ° C). Хинин используется как отрицательный контроль для лигандом thermolability, поскольку она не претерпела преобразования при этих температурах экспериментально и также связывает MN4. Мы описываем приобретение термолабильных лигандом DSC наборов данных и их анализа, уступая термодинамические и кинетические параметры складывания, привязки и лигандом процессов преобразования.

Protocol

1. Пробоподготовка Очищайте желаемого биомолекулы13.Примечание: Этот протокол использует приобретенные кокаина связывания ДНК aptamer MN4 после обмена против 2 М NaCl, три раза после трех раундов деионизованной воды с помощью центробежного фильтра с мембраной отсечения мо…

Representative Results

Репрезентативных данных для термолабильных лигандом DSC показаны на рисунке 1. Положение и высоту термолабильных пик лиганд прыгните последовательно сдвигает вниз к что несвязанных биомолекулы как обедненный термолабильных лиганда с каждого сканиров…

Discussion

Модификации и устранение неполадок

Данные анализа глобальной установки, используемых в Рисунок 1 и 2 были описаны ранее4. Здесь мы приводим практические аспекты выполнения и анализа ДСК привязки эксперименты с термол…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R. W. H. V был поддержан МакГилл естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) программа обучения в Bionanomachines. А. к. м. и P. E. J. были поддержаны Сенти грантов 327028-09 (A. K. М) и 238562 (P. E. J.).

Materials

Sodium chloride Chem Impex #00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71502
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9763
Deioinized water for molecular biology Millipore H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters VWR CA28145-477
3 kDa centrifugal filters Millipore UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff Spectrum Laboratories 131048
Silicon tubing VWR 89068-474
Plastic DSC flange caps TA Instruments 6111
DNA aptamer MN4 Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine Sigma Aldrich C008
Quinine Sigma Aldrich 22620
NanoDSC-III microcalorimeter TA Instruments http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70 VWR 89233-152

References

  1. Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
  2. Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
  3. Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
  4. Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
  5. Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
  6. Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
  7. Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
  8. Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
  9. Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
  10. Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
  11. Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
  12. Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  13. Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  14. Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
  15. Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
  16. Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
  17. Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
  18. Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
  19. Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
  20. Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).

Play Video

Cite This Article
Harkness V, R. W., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. J. Vis. Exp. (129), e55959, doi:10.3791/55959 (2017).

View Video