Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige techniek voor het kwantificeren van de thermodynamische parameters bestuur biomoleculaire vouwen en bindende interacties. Deze informatie is cruciaal in het ontwerp van nieuwe farmaceutische stoffen. Er zijn echter vele farmaceutisch relevante liganden chemisch onstabiele bij de hoge temperaturen gebruikt in DSC analyses. Dus is bindende interacties te meten uitdagend omdat de concentraties van liganden en thermisch-geconverteerde producten voortdurend binnen de calorimeter-cel veranderen. Hier presenteren we een protocol met behulp van thermolabile liganden en DSC voor het snel verkrijgen thermodynamische en kinetische gegevens op de vouwing, bindende en ligand conversie processen. We hebben onze methode toegepast op de aptamer van DNA MN4 dat zich aan de thermolabile ligand cocaïne bindt. Met behulp van een nieuwe globale montage analyse die goed is voor thermolabile ligand conversie, de complete set van vouwen en bindende parameters worden verkregen van een paar van DSC experimenten. Bovendien laten we zien dat de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie met slechts één aanvullende DSC dataset kan worden verkregen. De richtsnoeren voor het identificeren en analyseren van gegevens uit verschillende ingewikkelder scenario’s worden gepresenteerd, met inbegrip van onomkeerbare bundeling van de Biomolecuul, langzame vouwing, langzame bindende en snelle uitputting van de thermolabile ligand.
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige methode om quantitating biomoleculaire bindende en opvouwbare interacties1,–2,3. De sterke punten van DSC omvatten haar capaciteit te verhelderen bindend en vouwen van mechanismen en opleveren van het desbetreffende thermodynamische parameters2,3. Bovendien, DSC kan worden uitgevoerd in de oplossing in de buurt van de fysiologische omstandigheden en vereist geen etikettering van de Biomolecuul of ligand, bijvoorbeeldmet fluorophores, spin-etiketten of nucleaire isotopen4. Het instrument scant in temperatuur, het meten van de hoeveelheid warmte die nodig is om te denatureren van de Biomolecuul in de aanwezigheid en de afwezigheid van ligand. De resulterende thermograms worden gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters betreffende de ligand bindend en vouwen van processen. De door de DSC- of andere thermodynamische technieken verstrekte informatie is cruciaal voor het begeleiden van het ontwerp van drugs gericht op biomoleculen1,5,6,7,8. Echter de herhaalde scannen naar hoge temperaturen (~ 60-100 ° C) problematisch kan zijn. Bijvoorbeeld, veel farmaceutisch belangrijke stoffen ondergaan omlegging of ontleding bij langdurige blootstelling aan hoge temperaturen9,10,11, dat wil zeggen, ze zijn thermolabile. Behandeling van bindende interacties door DSC meestal meebrengt dat meerdere voorwaartse en omgekeerde scans om na te gaan van de reproduceerbaarheid van het thermogram voor thermodynamische analyses12. Thermische conversie van een eerste ligand naar een secundaire vorm met gewijzigde bindende eigenschappen leidt tot uitgesproken verschillen in de vorm en positie van opeenvolgende thermograms, aangezien de concentratie van de oorspronkelijke ligand met elke scan terwijl afneemt de thermische conversie producten ophopen. Deze datasets zijn niet vatbaar voor traditionele analyses.
Onlangs hebben we een globale montage methode voor thermolabile ligand DSC datasets dat de opbrengst van de complete set van thermodynamische parameters betreffende de Biomoleculaire vouwen en bindende interacties van een enkele ligand-gebonden experiment waarnaar wordt verwezen naar de vereiste thermogram voor de gratis Biomolecuul4. De analyse vermindert de experimentele tijd en monster vereist door ~ 10-fold in vergelijking met standaard DSC benaderingen. We hebben goed voor ligand thermische conversie door de veronderstelling dat dit gebeurt tijdens het gedeelte van de hoge temperatuur van elke scan waar de thermogram niet afhankelijk ligand concentratie. Daarom is de ligand concentratie een constante in het gedeelte van het thermogram die wordt gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters. We laten bovendien zien hoe de constant voor ligand thermische conversie kan worden verkregen door het uitvoeren van één aanvullende experiment met een langere equilibratietijd hoge temperatuur. Voor systemen waar ligand thermische conversie minder afhankelijk van de temperatuur is (dat wil zeggen, zich merkbaar bij alle temperaturen), de analyse kan worden gewijzigd als u wilt opnemen van variabele ligand concentraties. Hier laten wij zien deze procedure voor de aptamer van DNA MN4 in aanwezigheid van de cocaïne thermolabile ligand, die snel worden omgezet in benzoylecgonine bij hoge temperaturen (> 60 ° C). Kinine wordt gebruikt als een negatieve controle voor ligand thermolability omdat het geen conversie bij deze experimentele temperaturen ondergaan en ook aan MN4 bindt. We beschrijven de overname van thermolabile ligand DSC datasets en hun analyse opbrengst thermodynamische en kinetische parameters van de vouwing, bindende en ligand conversie processen.
Wijzigingen en probleemoplossing
De details van de analyse van de wereldwijde montage gebruikt in Figuur 1 en Figuur 2 zijn eerder4beschreven. We schetsen hier, praktische aspecten van het uitvoeren en analyseren van DSC bindende experimenten met thermolabile liganden. Merk op dat een basislijn DSC verkregen voor de thermolabile ligand alleen wordt afgetrokken van het ligand + Biomolecuul datase…
The authors have nothing to disclose.
R. W. H. V werd gesteund door het McGill Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) Training Program in Bionanomachines. A. K. M. en P. E. J. werden ondersteund door NSERC subsidies 327028-09 (A. K. M) en 238562 (P. E. J.).
Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
Contrad-70 | VWR | 89233-152 |