Vi presenterer en protokoll for rask karakterisering av biomolecular folding og bindende interaksjon med thermolabile ligander bruker differensial skanning calorimetry.
Differensial skanning calorimetry (DSC) er en kraftfull teknikk for kvantifisere termodynamisk parametere biomolecular folding og bindende interaksjoner. Denne informasjonen er kritisk i utformingen av nye farmasøytiske forbindelser. Men er mange pharmaceutically relevante ligander kjemisk ustabil på de høye temperaturene i DSC analyser. Dermed er måle bindende interaksjoner utfordrende fordi konsentrasjonen av ligander og termisk konvertert produkter er i stadig endring i calorimeter cellen. Her presenterer vi en protokoll med thermolabile ligander og DSC for raskt å få termodynamisk og kinetisk informasjon på folding, binding og ligand konverteringsprosesser. Vi har brukt vår metode DNA aptamer MN4 som binder til thermolabile ligand kokain. Bruker en ny global passende analyse som står for thermolabile ligand konvertering, et komplett sett med folding og bindingsparameterne er Hentet fra et par DSC eksperimenter. I tillegg viser vi at rate konstant for thermolabile ligand konvertering kan oppnås med bare en supplerende DSC datasett. Retningslinjene for identifisere og analysere data fra flere mer kompliserte scenarier presenteres, inkludert irreversibel samling av biomolecule, langsom folding, langsom binding og rask uttømming av thermolabile ligand.
Differensial skanning calorimetry (DSC) er en kraftig metode for quantitating biomolecular bindende og folding interaksjoner1,2,3. Styrken av DSC inkluderer dens evne til å belyse bindende og folding mekanismer, og den tilsvarende termodynamisk parametere2,3. Videre DSC kan utføres i løsningen under nær fysiologiske forhold og krever ikke merking av biomolecule eller ligand, f.eksmed fluorophores, spin-etiketter eller kjernefysiske isotoper4. Maskinen skanner i temperatur, måle mengden varme må denature biomolecule i tilstedeværelse og fravær av ligand. De resulterende thermograms brukes til å trekke ut termodynamisk parameterne for ligand binding og folding prosesser. Informasjon fra DSC eller andre termodynamisk teknikker er kritisk til veiledende utformingen av narkotika målretting biomolecules1,5,6,7,8. Men gjentatte skanning til høye temperaturer (~ 60-100 ° C) kan være problematisk. For eksempel mange pharmaceutically viktige forbindelser gjennomgå omorganisering eller nedbryting på vedvarende eksponering for høye temperaturer9,10,11, dvs., de er thermolabile. Undersøkelse av bindende interaksjoner av DSC vanligvis krever flere revers skanner for å verifisere reproduserbarhet av thermogram for termodynamisk analyser12. Termisk konvertering av en innledende ligand til en sekundær form med endrede bindende egenskaper fører til uttales forskjeller i form og stilling av påfølgende thermograms, siden konsentrasjonen av første ligand avtar med hver skanning mens den termisk konvertering produkter samles. Disse datasett er ikke mottakelig for tradisjonelle analyser.
Vi har nylig utviklet en global passende metode for thermolabile ligand DSC datasett som gir komplett sett av termodynamisk parametere for den biomolecular folding og bindende interaksjoner fra ett enkelt ligand binding eksperiment refererte til den nødvendige thermogram for gratis biomolecule4. Analysen reduserer eksperimentelle tid og eksempel kreves av ~ 10-fold sammenlignet med standard DSC tilnærminger. Vi har stått for ligand termisk konvertering av antar dette skjer under høy temperatur delen av hver skanning der thermogram ikke er avhengig av ligand konsentrasjon. Derfor er ligand konsentrasjonen en konstant i delen av thermogram som brukes til å hente termodynamisk parametere. Vi viste i tillegg hvordan rate konstant for ligand termisk konvertering kan oppnås ved å utføre et supplerende eksperiment med høy temperatur balanse lengre. For systemer der ligand termisk konvertering er mindre temperaturen-avhengige (i.e.forekommende merkbart i alle temperaturer), analysen kan endres for å inkludere variable ligand konsentrasjoner. Her viser vi denne prosedyren for DNA aptamer MN4 i nærvær av thermolabile ligand kokain, som hurtig konverterer til benzoylecgonine ved høye temperaturer (> 60 ° C). Kinin brukes som en negativ kontroll for ligand thermolability siden det gjennomgår konvertering på disse eksperimentelle temperaturer og også binder seg til MN4. Vi beskriver oppkjøpet av thermolabile ligand DSC datasett og analyse gir termodynamisk og kinetisk parametere av folding, binding og ligand konverteringsprosesser.
Endringer og feilsøking
Detaljer om globale passende analysen brukes i figur 1 og figur 2 har vært beskrevet tidligere4. Her skissere vi praktiske sider ved utføring og analysere DSC bindende eksperimenter med thermolabile ligander. Merk at en DSC plan oppnådd for thermolabile ligand alene trekkes fra ligand + biomolecule datasett, effektivt avlyser ut heten eller opptatt av termisk konverte…
The authors have nothing to disclose.
R. W. H. V ble støttet av McGill naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada (NSERC) treningsprogrammet i Bionanomachines. A. K. M. og P. E. J. ble støttet av NSERC tilskudd 327028-09 (A. K. M) og 238562 (P. E. J.).
Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
Contrad-70 | VWR | 89233-152 |