Mäta Biomolekylär DSC profiler med termolabila ligander till snabbt karakterisera vikning och bindande interaktioner
Summary
Vi presenterar ett protokoll för snabb karakterisering av Biomolekylär vikning och bindande interaktioner med termolabila ligander med differential scanning calorimetry.
Abstract
Differential scanning calorimetry (DSC) är en kraftfull teknik för att kvantifiera termodynamiska parametrar som styr Biomolekylär vikning och bindande interaktioner. Denna information är avgörande för utformningen av nya läkemedelssubstanser. Men är många farmaceutiskt relevanta ligander kemiskt instabila vid de höga temperaturer som används i DSC analyser. Mäta bindande interaktion är således en utmaning eftersom koncentrationerna av ligander och termiskt-konverterade produkter förändras ständigt inom cellen kalorimetern. Här presenterar vi ett protokoll som använder termolabila ligander och DSC för att snabbt få termodynamiska och kinetiska information på vikning, bindande och ligand omvandlingsprocesser. Vi har tillämpat vår metod att den DNA-aptamer MN4 som binder till termolabila ligand kokain. Fullständig uppsättning fällbara och bindande parametrar erhålls från ett par av DSC experiment och med hjälp av en ny global montering analys som står för termolabila ligand konvertering. Vi visar dessutom att konstanten för termolabila ligand konvertering kan erhållas med bara en kompletterande DSC datamängd. Riktlinjer för att identifiera och analysera data från flera mer komplicerade scenarier presenteras, inklusive irreversibel aggregering av biomolecule, långsam vikning, långsam bindande, och snabb utarmning av termolabila liganden.
Introduction
Differential scanning calorimetry (DSC) är en kraftfull metod för quantitating Biomolekylär bindande och fällbara interaktioner1,2,3. Styrkan hos DSC inkluderar dess förmåga att belysa bindande och fällbara mekanismer, och att ge den motsvarande termodynamiska parametrar2,3. Dessutom DSC kan utföras i lösning nära-fysiologiska villkor och kräver inte märkning av biomolecule eller ligand, t.ex., med fluorophores, spin-etiketter eller nukleära isotoper4. Instrumentet skannar i temperatur, mäta mängden värme som krävs för att denaturera biomolecule i närvaro och frånvaro av liganden. De resulterande thermograms används för att extrahera de termodynamiska parametrar som styr liganden bindande och fällbara processer. Uppgifter från DSC eller andra termodynamiska tekniker är avgörande för att vägleda utformningen av droger inriktning biomolekyler1,5,6,7,8. Men upprepad skanning för höga temperaturer (~ 60-100 ° C) kan vara problematiskt. Exempelvis många farmaceutiskt viktiga föreningar genomgå ombildning eller sönderfall vid fortsatt exponering för höga temperaturer9,10,11, dvs, de är termolabila. Undersökningen av bindande interaktioner av DSC normalt kräver flera framåt och bakåt genomsökningar för att kontrollera TERMOGRAM för termodynamiska analyser12reproducerbarhet. Termiska konvertering av en inledande ligand till en sekundär form med förändrad bindande egenskaper leder till uttalad skillnader i form och placering av successiva thermograms, eftersom koncentrationen av inledande liganden minskar med varje skanning medan den samlas termisk konvertering produkter. Dessa datamängder är inte mottaglig för traditionella analyser.
Vi har nyligen utvecklat en global passande metod för termolabila ligand DSC datamängder som ger en fullständig uppsättning termodynamiska parametrar styr Biomolekylär vikningen och bindande interaktioner från ett enda ligand-bundna experiment refereras till den erforderliga TERMOGRAM för gratis biomolecule4. Analysen minskar experimentell tid och provet krävs av ~ 10-faldigt jämfört med DSC standardmetoder. Vi har stått för ligand termisk konvertering av förutsatt att detta sker under hög temperatur-delen av varje skanning där TERMOGRAM inte beror på ligand koncentration. Ligand koncentrationen är därför en konstant inom del av den TERMOGRAM som används för att extrahera termodynamiska parametrar. Vi har dessutom visat hur konstanten för ligand termisk konvertering kan erhållas genom att utföra en kompletterande experiment med hög temperatur Jämviktstiden längre. För system där ligand termisk konvertering är mindre temperatur-anhörigen (dvsförekommer märkbart vid alla temperaturer), analysen kan modifieras för att inkludera variabel ligand koncentrationer. Här visar vi proceduren för de DNA aptamer MN4 i närvaro av termolabila ligand kokain, som snabbt konverterar till benzoylecgonine vid höga temperaturer (> 60 ° C). Kinin används som en negativ kontroll för ligand thermolability eftersom det inte genomgår omvandling vid dessa experimentella temperaturer och binder också till MN4. Vi beskriver förvärvet av termolabila ligand DSC datamängder och deras analys ger termodynamiska och kinetiska parametrar av vikning, bindande och ligand omvandlingsprocesser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifieringar och felsökning
Detaljerna i den globala passande analysen används i figur 1 och figur 2 har tidigare beskrivits4. Här, beskriver vi praktiska aspekter att utföra och analysera DSC bindande experiment med termolabila ligander. Observera att en DSC baslinje erhålls för termolabila liganden ensam subtraheras från liganden + biomolecule datamängd, effektivt avbryta ut värmen s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. W. H. V stöddes av McGill naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet av Kanada (NSERC) utbildningsprogram i Bionanomachines. A. K. M. och P. E. J. stöddes av NSERC bidrag 327028-09 (A. K. M) och 238562 (P. E. J.).
Materials
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
