אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.
דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא טכניקה חזקה לכימות תנועת תרמודינמי פרמטרים הנוגעים למערכות ביולוגיות קיפול ואינטראקציות מחייב. מידע זה חיוני בעיצוב של תרכובות פרמצבטיות חדש. אולם, רבים ליגנדים הרלוונטיים הם הם לא יציב מבחינה כימית בטמפרטורות גבוהות בשימוש DSC ניתוחים. לפיכך, מדידת אינטראקציות מחייב הוא מאתגר כי הריכוזים של ליגנדים ומוצרים המרה תרמית משתנים ללא הרף בתוך התא קלורימטר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות ליגנדים thermolabile ו DSC להשגת במהירות מידע תרמודינמי קינטי קיפול, האיגוד, לבין ליגנד תהליכי ההמרה. אנחנו החלת שיטת שלנו aptamer ה-DNA MN4 המאגד הקוקאין ליגנד thermolabile. באמצעות ניתוח כללי התאמה חדשים that חשבונות for ליגנד thermolabile ההמרה, הערכה המלאה של קיפול ופרמטרים איגוד מתקבלים מן זוג ניסויים DSC. בנוסף, נראה כי ניתן להשיג את קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile עם dataset DSC משלים אחד בלבד. ההנחיות לזיהוי וניתוח נתונים של מספר תרחישים יותר מסובך מוצגים, כולל צבירת בלתי הפיך של biomolecule, קיפול איטי, איגוד איטי, דלדול מהירה ליגנד thermolabile.
דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא שיטה חזקה עבור איגוד למערכות ביולוגיות quantitating ומתקפלים אינטראקציות1,2,3. נקודות החוזק של DSC כוללים את יכולתו להבהיר מחייב וקיפול מנגנונים, תשואה של2,המקביל פרמטרים תרמודינמי3. יתר על כן, DSC יכול להתבצע בפתרון בתנאים ליד-פיזיולוגיים, לא דורשת תיוג של biomolecule או ליגנד, למשל, עם fluorophores, ספין-תוויות או גרעינית איזוטופים4. המכשיר סורק בטמפרטורה, מודדים את כמות החום הדרושה כדי denature את biomolecule, הנוכחות ואת היעדר ליגנד. Thermograms שנוצר משמשים כדי לחלץ את הפרמטרים תרמודינמי המסדירים את ליגנד מחייב וקיפול תהליכים. המידע שנמסר על ידי DSC או בטכניקות אחרות תרמודינמי חיוני המנחה את העיצוב של שהתרופות המתוות מולקולות1,5,6,7,8. עם זאת, סריקה חוזרת ונשנית לטמפרטורות גבוהות (~ 60-100 ° C) יכול להיות בעייתי. לדוגמה, תרכובות הם חשובים רבים עוברים סידור או ריקבון על חשיפה מתמשכת בטמפרטורות גבוהות9,10,11, קרי, הם thermolabile. בחינה של איגוד אינטראקציות על ידי DSC בדרך כלל דורש מספר סריקות ואחורה כדי לאמת את הפארמצבטית של תמוגרפיה ניתוח תרמודינמי12. המרה תרמי של ליגנד הראשונית בטופס משני עם איגוד שינו מאפיינים מוביל בולטת הבדלים הצורה והמיקום של thermograms רצופות, מאז ריכוז ליגנד הראשונית יורדת עם כל סריקה בזמן ההמרה התרמית מוצרים לצבור. אלה נתונים (datasets) נתונות לא ניתוח מסורתי.
לאחרונה פיתחנו שיטת המדידה הכללית datasets ליגנד thermolabile DSC המניבה את הערכה המלאה של פרמטרים תרמודינמי המסדירים את הקיפולים למערכות ביולוגיות ואיגוד אינטראקציות של ניסוי מאוגד-ליגנד אחד הפניה תמוגרפיה כנדרש עבור חינם biomolecule4. הניתוח מקטין את זמן הניסוי ואת מדגם הנדרש על-ידי ~ 10-fold בהשוואה הגישות DSC סטנדרטי. יש לנו פיתרון ליגנד ההמרה התרמית שייטול את זה קורה במהלך החלק בטמפרטורה גבוהה של כל סריקה איפה תמוגרפיה אינו תלוי בריכוז ליגנד. לכן, ריכוז ליגנד הוא קבוע בתוך החלק של תמוגרפיה המשמש כדי לחלץ תרמודינמי פרמטרים. בנוסף להדגים איך קצב קבוע לגיור תרמי ליגנד יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע ניסוי משלים אחד עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה. עבור מערכות ההמרה התרמית ליגנד איפה פחות תלוית טמפרטורה (קרי, המתרחשים ניכרת בטמפרטורות כל), הניתוח יכול להיות שונה כדי לכלול ריכוזים ליגנד משתנה. כאן אנחנו מוכיחים את הליך זה עבור aptamer DNA MN4 בנוכחות הקוקאין ליגנד thermolabile, אשר ממירה במהירות benzoylecgonine בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C). כינין משמש פקד שלילי ליגנד thermolability כיוון שהוא אינו עובר המרה בטמפרטורות אלה ניסיוני נקשר גם MN4. אנו מתארים הרכישה של ליגנד thermolabile DSC datasets וניתוח שלהם מניב פרמטרים תרמודינמי, קינטי של קיפול, איגוד, ליגנד תהליכי ההמרה.
שינויים ופתרון בעיות
הפרטים של הניתוח התאמה העולמית בשימוש איור 1 , איור 2 היה שתואר לעיל4. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ההיבטים המעשיים של ביצוע וניתוח DSC מחייב בין ניסויים ליגנדים thermolabile. שימו לב כי תוכנית בסיסית DSC להשיג עבור ?…
The authors have nothing to disclose.
V ח וו ר נתמכה על ידי מדעי הטבע מקגיל תוכנית אימונים הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ב- Bionanomachines. א ק מ ופי אי ג’יי נתמכו על ידי מענקים NSERC 327028-09 (א ק ז), 238562 (פי אי ג’יי).
Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
Contrad-70 | VWR | 89233-152 |