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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

एक 2-कदम खुराक-वृद्धि प्रक्रिया के साथ फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं में इन विट्रो में EGFR-TKI और TKI से मुलाकात के लिए दोहरी प्रतिरोध की स्थापना

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55967
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Institute of Molecular Oncology, Showa University, 2Center for Biotechnology, Showa University

Summary

एक EGFR-TKI और कैंसर की कोशिकाओं में एक मौसम TKI के लिए दोहरी प्रतिरोध की स्थापना के लिए एक इन विट्रो में विधि बताई गई है। इस विधि जो मिले-प्रवर्धन के साथ EGFR-TKI इलाज के बावजूद रोग प्रगति को दर्शाते EGFR-परिवर्तन, के साथ रोगियों के लिए उपचार विकसित करने के लिए उपयोगी है। यह भी अन्य अणुओं को लक्षित inhibitors के लिए संशोधित किया जा सकता।

Abstract

दवा प्रतिरोध कैंसर थेरेपी में एक बड़ी चुनौती है। प्रतिरोधी sublines में इन विट्रो का उत्पादन इस चुनौती पर काबू पाने के लिए उपन्यास तंत्र की खोज के लिए आवश्यक है। यहाँ, एक epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) के लिए डुएल-प्रतिरोध की स्थापना के लिए एक 2-कदम खुराक-वृद्धि विधि-tyrosine kinase अवरोध करनेवाला (TKI), gefitinib, और एक मिले-TKI, PHA665752, वर्णित है। यह विधि सरल पर आधारित है stepwise खुराक-वृद्धि के लिए उत्प्रेरण inhibitors के सेल लाइनों में प्रतिरोध हासिल कर ली। एक चरण में अवरोध करनेवाला के उच्च सांद्रता के लिए कक्षों को उजागर प्रतिरोधी sublines पैदा करने के लिए वैकल्पिक विधि शामिल है। Stepwise खुराक-वृद्धि विधि एक उच्च है सफलतापूर्वक उत्प्रेरण की संभावना इस विधि से प्रतिरोध हासिल कर ली। EGFR सक्रिय उत्परिवर्तनों biomarkers EGFR-TKI, के साथ उपचार के लिए एक प्रतिक्रिया के है जो कि इन उत्परिवर्तनों बंदरगाह गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) के लिए एक व्यावहारिक पहली पंक्ति उपचार है। क्योंकि ट्यूमर अनिवार्य रूप से प्रतिरोध प्राप्त हालांकि, प्रभावी जवाब की रिपोर्ट के बावजूद, EGFR-TKI का उपयोग सीमित है। द्वारपाल साइट, T790M EGFR के 20 exon में, और एक बाईपास संकेत मिले की एक द्वितीयक उत्परिवर्तन EGFR-TKI प्रतिरोध के पीछे प्रमुख तंत्र शामिल हैं। इस प्रकार, इस समस्या के लिए एक संभावित समाधान EGFR-TKI और मौसम-TKI का एक संयोजन किया जाएगा। इस संयुक्त उपचार एक इन विट्रो में अध्ययन के मॉडल में प्रभावी होना दिखाया गया है। अधिग्रहीत gefitinib-प्रतिरोध stepwise खुराक-वृद्धि द्वारा gefitinib का मौसम-प्रवर्धन के माध्यम से 12 महीनों के लिए स्थापित किया गया था, और PC-9MET1000 नामक एक सेल लाइन एक पिछले अध्ययन में तैयार की गई थी। आगे अधिग्रहीत मिले-TKI और EGFR-TKI की व्यवस्था की जांच करने के लिए प्रतिरोध, एक मिले-TKI, PHA665752, gefitinib की उपस्थिति में stepwise खुराक-वृद्धि के साथ इन कोशिकाओं को 12 महीने के लिए दिलाई गई। इस प्रोटोकॉल भी सफलतापूर्वक अधिग्रहण प्रतिरोध अन्य अवरोध करनेवाला अणुओं को स्थापित करने के लिए संयोजन चिकित्सा की एक संख्या के लिए लागू किया गया है।

Introduction

Oncogenic उत्परिवर्तनों epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) में गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) के साथ रोगियों के एक सबसेट में पाए जाते हैं और इस रोग1,2का महत्वपूर्ण भविष्य कहनेवाला biomarkers कर रहे हैं। इन सबसे अधिक EGFR उत्परिवर्तनों को सक्रिय करने या एक फ्रेम में विलोपन (delE746-A750) exon 19 में एक बिंदु उत्परिवर्तन leucine EGFR tyrosine kinase डोमेन3,4में exon 21 (L858R) के codon 858 पर arginine के साथ की जगह के रूप में हो सकती। EGFR-tyrosine kinase inhibitors की (TKIs) के साथ उपचार EGFR उत्परिवर्तनों शरण NSCLC के साथ रोगियों के लिए एक चिकित्सकीय प्रभावी चिकित्सा है। हालांकि, इस चिकित्सा के अनिवार्य अधिग्रहण EGFR-TKIs करने के लिए प्रतिरोध जैसे gefitinib और erlotinib के द्वारा सीमित है। सबसे आम अधिग्रहण प्रतिरोध EGFR, जो रोगियों को EGFR-TKI (gefitinib या erlotinib) प्रतिरोध हासिल कर ली जो की लगभग 60% में पाया गया की exon 20 में एक द्वितीयक T790M उत्परिवर्तन के माध्यम से होती है। EGFR-TKIs के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के साथ जुड़े अन्य आणविक तंत्र मिले प्रवर्धन, छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर, और उपकला-के लिए-mesenchymal संक्रमण5,6के परिवर्तन के कारण बाईपास संकेतन का सक्रियण कर रहे हैं। रिसेप्टर hepatocyte वृद्धि कारक, मौसम जीन द्वारा इनकोडिंग के लिए जो dysregulatedin कई ट्यूमर है, के लिए एक महत्वपूर्ण उम्मीदवार लक्षित चिकित्सा7,8जा करने के लिए रिपोर्ट किया गया है।

EGFR-TKIs के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए रणनीति अब नैदानिक मूल्यांकन के दौर से गुजर रहे हैं। पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि तीसरी पीढ़ी EGFR इनहीबिटर्स जैसे osimertinib T790M उत्परिवर्तन9के साथ रोगियों के लिए प्रभावी रहे हैं। इसके अलावा, EGFR और मिले TKIs6,10के साथ संयुक्त उपचार द्वारा मिले प्रवर्धन के साथ EGFR-उत्परिवर्ती कैंसर के विकास हिचकते हो कर सकते हैं। नैदानिक परीक्षण अधिग्रहण प्रतिरोध करने के लिए gefitinib और erlotinib के साथ रोगियों में मिले और EGFR inhibitors का एक संयोजन का आकलन चल अब11हैं।

एजेंटों के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, सेल लाइनों है कि शुरू में प्रतिक्रिया करने के लिए inhibitors लगातार इन inhibitors के साथ इलाज कर रहे हैं। दो विधियाँ अधिग्रहण प्रतिरोध सेल लाइनों में स्थापित करने के लिए उपलब्ध हैं। एक stepwise खुराक-वृद्धि है, और अन्य उच्च एकाग्रता जोखिम है। क्योंकि यह एक उच्च सफलता दर है stepwise वृद्धि विधि और अधिक सामान्यतः, इस्तेमाल किया गया है। कोशिकाओं पहले inhibitors की तरह, लगभग आधे-अधिक से अधिक निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50) मूल्य का दसवां अंश के कम सांद्रता को उजागर कर रहे हैं और जब तक लक्ष्य की एकाग्रता हासिल है एकाग्रता फिर धीरे-धीरे 10-30% की वृद्धि हुई है। उन कक्षों में संस्कृति मध्यम, जो आईसी50 मान से अधिक है, तो माता-पिता की कोशिकाओं को लगभग पूरी तरह से मार कर रहे हैं अवरोध करनेवाला की अंतिम खुराक के लिए उजागर उच्च एकाग्रता जोखिम विधि शामिल है। इस उच्च एकाग्रता जोखिम विधि बहुत कम सफलता दर stepwise वृद्धि विधि से है।

एक पिछले अध्ययन में, संयुक्त उपचार EGFR-TKI और मौसम-TKI के साथ एक इन विट्रो में सिस्टम में प्रभावी होना दिखाया गया था। अधिग्रहण प्रतिरोध करने के लिए एक EFGR-TKI, gefitinib, मौसम-प्रवर्धन, के साथ 12 महीनों के लिए stepwise वृद्धि के माध्यम से स्थापित किया गया था और इस प्रकार, जनरेट किए गए12एक gefitinib-प्रतिरोधी कोशिका लाइन PC-9MET1000 कहा जाता था।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल EGFR-mutated NSCLC PC-9 कक्षों को EGFR-TKI, gefitinib, और एक मिले-TKI, PHA665752 दोहरी प्रतिरोध के साथ प्राप्त करने के लिए एक द्वि-चरणीय खुराक-वृद्धि प्रक्रिया है (चित्र 1)। इस विधि का अधिग्रहण की स्थापना के लिए प्रतिरोधी सेल लाइनों में, एक उच्च सफलता दर के साथ करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। वर्णित प्रोटोकॉल inhibitors के साथ अन्य आणविक लक्ष्य दवाओं और साइटोटोक्सिक एजेंट रूप में अच्छी तरह के आवेदन के लिए संशोधित किया जा सकता।

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Protocol

1. Gefitinib-प्रतिरोधी कोशिकाओं की स्थापना

  1. प्रारंभिक gefitinib एकाग्रता 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) परख द्वारा निर्धारित करें।
    1. संस्कृति विकास माध्यम में PC-9 कक्षों (10% FBS और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ RPMI-1640 मध्यम (पेनिसिलिन: 100 U/एमएल और streptomycin: 100 µ g/mL)), एक 5% CO2 इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर में
    2. 1.0 × 105 कोशिकाओं/एमएल एक स्वचालित सेल काउंटर ( सामग्री की तालिकादेखें) और इस के 50 µL में हर तरह से विकास के माध्यम का उपयोग कर एक 96-अच्छी तरह से थाली के बीज का उपयोग करने के लिए कक्षों को समायोजित; कक्षों की अंतिम एकाग्रता 5.0 × 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से किया जाना चाहिए।
    3. 37 ° c. पर रात भर प्लेट सेते हैं
    4. 50 µL gefitinib (पर अंतिम एकाग्रता X 2) के विभिन्न सांद्रता पर जोड़ें: 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, और इस तरह इन कुओं के लिए 20 सुक्ष्ममापी है कि अंतिम खंड में से प्रत्येक में अच्छी तरह से 100 µL.
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए प्लेट सेते हैं
    6. 15 µL डाई समाधान जोड़ें ( तालिका की सामग्रीदेखें) प्रत्येक (उपयोग अंतिम 13% की एकाग्रता डाई समाधान), अच्छी तरह से और 37 ° c. पर 4 ज के लिए सेते हैं
    7. Solubilization/स्टॉप समाधान के 100 µL जोड़ ( तालिका की सामग्रीदेखें) formazan के solubilizing के लिए डाई समाधान द्वारा उत्पादित के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) में से प्रत्येक में अच्छी तरह से, और इसे रात भर में 37 ° c. सेते हैं
    8. 570 ऑप्टिकल घनत्व को मापने एनएम (आयुध डिपो570) एक microplate रीडर का उपयोग करके एक सेल-प्रसार अवस्था उत्पन्न करके आईसी50 मान प्राप्त करने के लिए।
    9. एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (रेखांकन भी डेटा प्रदर्शित करें, और आईसी50 मान (चित्रा 2) की गणना करने के लिए देखें तालिका की सामग्री)।
    10. 6-12 replicates तैयार है और प्रयोग कम से कम तीन बार दोहराएँ।
  2. सतत stepwise खुराक-वृद्धि PC-9 कोशिकाओं के उपचार के लिए gefitinib की।
    1. 37 ° c. पर एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में विकास के माध्यम से 10 मिलीलीटर के साथ p100 व्यंजन में संस्कृति PC-9 कक्षों (उप confluent हालत में 1 मिलीलीटर)
    2. आईसी50 मान gefitinib के का दसवां p100 डिश में जोड़ें।
      1. उन कक्षों में संस्कृति मध्यम उप confluent हो जाते हैं, कोशिकाओं के 1-2 मिलीलीटर ताजा विकास 10-30% एक ही संस्कृति की स्थिति में gefitinib के उच्च एकाग्रता के साथ एक 1-एमएल pipet का उपयोग कर के माध्यम से 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. Gefitinib एकाग्रता उत्तरोत्तर वृद्धि प्रत्येक विभाजन के साथ 10-30% द्वारा जब तक यह 1 माइक्रोन तक पहुँच; यह लगभग 6-12 महीने लग सकते हैं।
      नोट: जब आईसी50 मान gefitinib की एकाग्रता पहुँचता है, सेल प्रसार काफी धीमी हो जाती है, और यह तो, कोशिकाओं के 2-4 मिलीलीटर ताजा विकास के माध्यम से 10 मिलीलीटर gefitinib के उच्च एकाग्रता के साथ जोड़ा जा सकता है; gefitinib की एकाग्रता में वृद्धि को कम करने की समस्या को हल हो सकता है। इसके अलावा, यह-80 ° C पर शेष कोशिकाओं की दुकान, और उन पर पिछले एकाग्रता का पुन: उपयोग करने के लिए आदर्श होगा। PC-9 कक्षों में निलंबन के रूप में, यह trypsin के लिए passaging का उपयोग करने के लिए अनावश्यक है; हालांकि, gefitinib एकाग्रता बढ़ाने की प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं संस्कृति डिश के तल को अटैच कर सकते हैं। ऐसी स्थिति में, एक कक्ष-खुरचनी के अनुयायी कोशिकाओं के लिए अलग किया जा सकता।
    4. Gefitinib-प्रतिरोधी PC-9 कोशिकाओं में वृद्धि मध्यम 1 माइक्रोन gefitinib के साथ संस्कृति।
    5. Gefitinib-प्रतिरोध कोशिकाओं13की पुष्टि करने के लिए MTT परख करने; क्योंकि वे वृद्धि हुई प्रोटीन और मौसम (3A आंकड़ा, आंकड़ा 4A, बी) के आरएनए स्तर प्रदर्शित किया इन gefitinib-प्रतिरोधी कोशिकाओं (MET1000 कक्षों के रूप में नामित), PC-9MET1000 नामित किया गया।

2. दोहरी-Gefitinib और PHA665752 के प्रतिरोध की स्थापना

  1. PHA665752 के प्रारंभिक एकाग्रता MTT परख द्वारा निर्धारित करें।
    1. संस्कृति MET1000 कोशिकाओं में वृद्धि मध्यम और 37 ° c. पर एक 5% CO2 मशीन में 1 माइक्रोन gefitinib के 10 मिलीलीटर के साथ p100 व्यंजन
    2. कक्षों में एक 96-अच्छी तरह से थाली पर 5.0 × 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 50 µL में हर तरह से विकास के माध्यम के साथ बीज। समायोजित करने के लिए 1.0 × 10 कक्षों की अंतिम एकाग्रता5 कोशिकाओं/एमएल एक स्वचालित सेल का उपयोग काउंटर ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. 37 ° c. पर रात भर प्लेट सेते हैं
    4. 50 µL PHA665752, एक मिले-TKI पर (2 X अंतिम एकाग्रता), विभिन्न सांद्रता में कोशिकाओं के लिए की जोड़ें: 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, और 20 सुक्ष्ममापी सहित 2 सुक्ष्ममापी gefitinib (पर 2 X अंतिम एकाग्रता); अंतिम खंड में हर तरह से 100 µL होना चाहिए।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए प्लेट सेते हैं
    6. 15 µL डाई समाधान जोड़ें (एक अच्छी तरह से, और 37 ° c. पर 4 ज के लिए सेते हैं करने के लिए देखें तालिका की सामग्री)
    7. 100 µL solubilization/स्टॉप समाधान की formazan के solubilizing के लिए डाई समाधान द्वारा उत्पादित के लिए जोड़ें (एक अच्छी तरह से, और फिर से 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं करने के लिए देखें तालिका की सामग्री)
    8. 570 ऑप्टिकल घनत्व को मापने एनएम (आयुध डिपो570) एक microplate रीडर का उपयोग करके एक सेल-प्रसार अवस्था उत्पन्न करके आईसी50 मान प्राप्त करने के लिए।
    9. एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (रेखांकन भी डेटा प्रदर्शित करें, और PHA665752 के आईसी50 मान gefitinib (चित्र 3 ख) की उपस्थिति की गणना करने के लिए देखें तालिका की सामग्री)।
    10. 6-12 replicates तैयार है और प्रयोग कम से कम तीन बार दोहराएँ।
  2. MET1000 gefitinib और PHA665752 कोशिकाओं में दोहरी-प्रतिरोध की स्थापना।
    1. विकास के माध्यम से 10 मिलीलीटर के साथ p100 व्यंजन में संस्कृति MET1000 कोशिकाओं, और 37 ° c. पर एक 5% CO2 मशीन में 1 माइक्रोन gefitinib
    2. दसवां आईसी50 के मूल्य का PHA665752 की उपस्थिति में एक ही संस्कृति शर्तों के साथ gefitinib के 1 माइक्रोन विकास माध्यम में जोड़ें।
    3. PHA665752 एकाग्रता उत्तरोत्तर वृद्धि प्रत्येक विभाजन के साथ 10-30% द्वारा जब तक यह 1 माइक्रोन तक पहुँच। यह लगभग 6-12 महीने लग सकते हैं।
      नोट: जब आईसी50 मान PHA665752 की एकाग्रता पहुँचता है, सेल प्रसार काफी धीमी हो जाती है, और यह तो, कोशिकाओं के 2-4 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर ताजा विकास के माध्यम से करने के लिए एक 1-एमएल pipet PHA665752 के उच्च एकाग्रता के साथ का उपयोग कर जोड़ा जा सकता है; PHA665752 की एकाग्रता में वृद्धि को कम करने की समस्या को हल हो सकता है। इसके अलावा, यह-80 ° C पर शेष कोशिकाओं की दुकान, और उन पर पिछले एकाग्रता का पुन: उपयोग करने के लिए आदर्श होगा। यह trypsin के लिए passaging का उपयोग करने के लिए अनावश्यक है; हालांकि, PHA665752 एकाग्रता की वृद्धि के दौरान, कोशिकाओं संस्कृति डिश के तल को अटैच कर सकते हैं। ऐसी स्थितियों में, एक कक्ष-खुरचनी कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
    4. अंत में, संस्कृति PC-9 कोशिकाओं में वृद्धि मध्यम 1 माइक्रोन प्रत्येक gefitinib और PHA665752 का 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में साथ gefitinib और PHA665752 दोनों के लिए प्रतिरोधी
    5. कोशिकाओं डुएल-gefitinib और PHA66575213करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं कि, और वे gefitinib की उपस्थिति में PHA665752 करने के लिए संवेदनशील नहीं हैं कि पुष्टि करने के लिए MTT परख करने; इन डुएल-प्रतिरोध कोशिकाओं PC-9 (DR कक्षों के रूप में नामित) DR नाम थे (चित्र 5)।

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Representative Results

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत की गई प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1PC-9 कक्षों में एक खुराक-वृद्धि 2-चरण प्रक्रिया द्वारा अधिग्रहीत डुएल-gefitinib और PHA665752 के प्रतिरोध के प्रेरण सहित, में दिखाया गया है। चित्रा 2 की एकाग्रता gefitinib बढ़ जाती है के रूप में अभिभावक PC-9 कोशिकाओं के प्रसार में कमी से पता चलता है। यह इंगित करता है कि की खुराक-वृद्धि प्रक्रिया किया गया था के बाद PC-9 कक्षों gefitinib करने के लिए संवेदनशील बने। चित्र 3 से पता चलता है कि पीसी-9MET1000 कक्षों gefitinib करने के लिए प्रतिरोध प्रदर्शन, लेकिन एक मिले-TKI करने के लिए, PHA665752, gefitinib की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील हैं। PC-9 सेल प्रसार gefitinib का संकेत है कि वे करने के लिए gefitinib संवेदनशील थे, की उच्च सांद्रता में दबा दिया गया था। हालांकि, पीसी-9MET1000 कोशिकाओं कम प्रसार gefitinib का संकेत है कि वे gefitinib के लिए प्रतिरोध प्राप्त कर ली थी, की उच्च सांद्रता में भी नहीं दिखा था। जब पीसी-9MET100 कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति के 72 घंटे के लिए gefitinib में PHA665752 की सांद्रता में वृद्धि के साथ इलाज किया गया, इसके प्रसार, एक MTT परख द्वारा मापा के रूप में काफी कमी आई थी। Gefitinib के अभाव में PC-9MET1000 कोशिकाओं के प्रसार में एक मामूली कमी भी थी। इस प्रकार, gefitinib और PHA665752 का एक संयोजन सेल प्रसार और अधिक प्रभावी ढंग से उपचार के साथ अकेले PHA665752 दमन होगा।

चित्रा 4 प्रवर्धित स्तर मौसम (दोनों प्रोटीन और शाही सेना) के PC-9MET1000 और पीसी-9 डॉ कक्षों में दिखाता है; कोई अधिग्रहण उत्परिवर्तनों EGFR और मौसम में मौजूद हैं। इसलिए, बाईपास संकेतन के उद्भव अत्यधिक EGFR-TKI और मौसम-TKI के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध का एक कारण के रूप में सुझाव दिया है। चित्रा 5 PC-9 DR कोशिकाओं का प्रतिरोध करने के लिए PHA665752 gefitinib, के 1 माइक्रोन की उपस्थिति में एक MTT परख द्वारा मापा के रूप में दिखाता है। PC-9MET1000 कोशिकाओं के प्रसार हिचकते थे हालांकि gefitinib और PHA665752 के साथ उपचार द्वारा, PC-9 DR कोशिकाओं उपचार यह दर्शाता है कि वे दोहरे gefitinib और PHA665752 करने के लिए प्रतिरोधी रहे थे, बच गया। इस प्रकार, एक 2-कदम खुराक-वृद्धि प्रक्रिया के माध्यम से PC-9 कक्षों gefitinib करने के लिए प्रतिरोध प्राप्त कर लिया और PC-9MET1000 कक्ष 1 माइक्रोन gefitinib की उपस्थिति में PHA665752 करने के लिए प्रतिरोध प्राप्त कर लिया। आंकड़ा 6 लंगरवानी-स्वतंत्र प्रसार MET1000 और डॉ के कक्षों में शीतल अग्रवाल की उपस्थिति या अनुपस्थिति PHA665752 और gefitinib में दिखाता है। PC-9MET1000 और पीसी-9 डॉ कोशिकाओं के विकास शीतल अग्रवाल का संकेत है कि इन sublines में दोनों 2D और 3 डी प्रणाली बढ़ सकता है, पर मनाया गया। इस प्रकार, प्रतिरोधी sublines में 2D सिस्टम का विकास करने में सक्षम नहीं किया जा रहा की सीमा पर काबू पाने था। इसके अलावा, PC-9 DR कोशिकाओं, लेकिन नहीं पीसी-9MET1000 कक्ष, 1 माइक्रोन gefitinib और PHA665752 के साथ एक अग्रवाल में बढ़ सकता है। इस परिणाम को इंगित करता है कि PC-9 DR कोशिकाओं gefitinib और PHA665752 दोनों के लिए प्रतिरोधी रहे थे, और एक 3 डी संस्कृति सिस्टम में रूचि बढ़ेगी। Tumorigenic संपत्ति की स्थापना की प्रतिरोधी sublines के एक कॉलोनी गठन परख या vivo में ट्रांसप्लांटेशन14द्वारा जाँच की जानी चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: दोहरे-प्रतिरोध पैदा करने की स्कीमा: PC-9 DR PC-9 कोशिकाओं से कोशिकाओं।
दोहरी-प्रतिरोधी पैदा करने के लिए आरेख एक खुराक-वृद्धि 2-चरण प्रक्रिया द्वारा PC-9 कोशिकाओं से क्लोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: PC-9 कोशिकाओं के प्रसार EGFR-TKI gefitinib हिचकते हैं।
PC-9 कोशिकाओं कोशिकाओं/अच्छी तरह से हर तरह से, रात भर पूर्व incubated, और उसके बाद 72 घंटे के लिए इंगित सांद्रता पर gefitinib के साथ इलाज में विकास के माध्यम से 50 µL के साथ 5 x 103 में एक 96-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त थे। एक MTT परख की गई थी और आयुध डिपो570 एक microplate रीडर द्वारा मापा गया था। 0.048 आईसी50 मान था ± 0.01 माइक्रोन. डेटा रहे हैं के रूप में दिखाया 6 कुओं के लिए मतलब ± SEM. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: PC-9MET1000 कक्षों gefitinib करने के लिए प्रतिरोध का प्रदर्शन किया, लेकिन इसके प्रसार 1 माइक्रोन की उपस्थिति में PHA665752 के साथ उपचार gefitinib के दबा दिया।
(A) PC-9 और MET1000 कोशिकाओं कोशिकाओं/अच्छी तरह से विकास के 50 µL के साथ 5 x 103 पर 96-अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता प्राप्त थे एक अच्छी तरह से, रात भर पूर्व incubated, और उसके बाद gefitinib 72 एच के लिए इंगित सांद्रता के साथ इलाज किया में मध्यम (B) MET1000 कोशिकाओं कोशिकाओं/अच्छी तरह से 50 µL में हर तरह से विकास के माध्यम के साथ 5 x 103 में एक 96-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त थे , रात भर पूर्व incubated, और उसके बाद PHA665752 के साथ संकेत सांद्रता पर 72 घंटे के लिए gefitinib के 1 माइक्रोन के अभाव या उपस्थिति में इलाज किया। एक MTT परख की गई थी और आयुध डिपो570 एक microplate रीडर द्वारा मापा गया था। कि gefitinib के अभाव में निर्धारित नहीं किया गया था, जबकि 0.014 ± 0.01 माइक्रोन, आईसी50 मान gefitinib की उपस्थिति में किया गया था। डेटा 6 कुओं के लिए मतलब ± SEM के रूप में दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मौसम प्रवर्धन PC-9MET1000 और पीसी-9 डॉ कक्षों में कोई अधिग्रहण में उत्परिवर्तनों EGFR और मौसम के साथ मनाया गया।
(A) अभिव्यक्ति भास्वर-मौसम और कुल मौसम के स्तर वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा निर्धारित थे। Β-actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। (B) mRNA PC-9, PC-9MET1000, और PC-9 डॉ कोशिकाओं से टेप वास्तविक समय आरटी-पीसीआर का उपयोग और के साथ कि GAPDH के सामान्यीकृत मात्रा निर्धारित थे। डेटा मानों के सापेक्ष PC-9, ± SEM मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (n = 8)। सांख्यिकीय महत्व का द्वि-पुच्छ विद्यार्थी टीका उपयोग कर अनुमान था-परीक्षण, और एक p < 0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था। *, पी < 0.05, PC-9 मान के साथ तुलना में। (C) Exon 19-21 EGFR जीन की और से मिले जीन की exon 14-21 से जीनोमिक डीएनए पीसीआर द्वारा प्रवर्धित थे। पीसीआर उत्पादों फिर शुद्ध और विश्लेषण किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: PC-9 DR कक्षों PHA665752 करने के लिए प्रतिरोधी gefitinib का 1 माइक्रोन की उपस्थिति में हैं।
DR कोशिकाओं कोशिकाओं/अच्छी तरह से विकास के माध्यम हर तरह से, रात भर पूर्व incubated, और फिर PHA665752 के साथ 1 माइक्रोन की उपस्थिति इंगित सांद्रता 72 घंटे के लिए gefitinib के इलाज में की 50 µL के साथ 5 x 103 में एक 96-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त थे। एक MTT परख की गई थी और आयुध डिपो570 एक microplate रीडर द्वारा मापा गया था। डेटा 6 कुओं के लिए मतलब ± SEM के रूप में दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: PHA665752 और gefitinib के अभाव या उपस्थिति में शीतल अग्रवाल पर पीसी-9MET1000 और पीसी-9 डॉ कक्षों के Anchorage-स्वतंत्र प्रसार.
कक्षों (1 × 104) 0.3% अग्रवाल 10% FBS 6-अच्छी तरह से 0.6% के साथ नरम अग्रवाल पूर्व लेपित प्लेटों में वरीयता प्राप्त थे साथ में फिर से निलंबित कर दिया। अगले दिन, कोशिकाओं (1 माइक्रोन) gefitinib के साथ उपचार किया गया और PHA665752 (1 माइक्रोन) और फिर 14-21 दिनों के लिए incubated. कालोनियों 0.005% 1 एच. के लिए क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग रहे थे कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ वर्णित इस प्रोटोकॉल की स्थापना एक 2-कदम खुराक-वृद्धि विधि में इन विट्रोका उपयोग कैंसर कोशिकाओं में अधिग्रहीत डुएल-प्रतिरोध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। कई शोध पत्र में बताया है कि PC-9 कक्षों EGFR-TKI (gefitinib या erlotinib) T790M EGFR म्यूटेशन15,16के माध्यम से प्रतिरोध विकसित। हालांकि, हम T790M उत्परिवर्तनों हमारे पीसी-9MET1000 कक्षों की exon 20 में प्रत्यक्ष अनुक्रमण (आंकड़ा 4C) द्वारा किया था पता नहीं लगा। इसके अलावा, मौसम प्रवर्धन एक बाईपास मार्ग संकेतन के रूप में कार्य करने के लिए मनाया था। इस प्रकार, PC-9MET1000 कोशिकाओं को अत्यंत दुर्लभ हैं। हम पहले की सूचना दी कि सतत stepwise खुराक-वृद्धि 12 तक खुराक 1 माइक्रोन (PC-9MET1000 कक्षों को नाम दिया)17तक पहुँच गया महीनों के लिए किया गया था के बाद फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता PC-9 कक्षों EGFR के 15-बीपी हटाने exon 19 में शरण मिले प्रवर्धन के साथ gefitinib-प्रतिरोध विकसित। यह सेल लाइन gefitinib की उपस्थिति में एक मौसम TKI के प्रति संवेदनशील था। इस व्यवस्था के प्रतिरोध को EGFR - और मिले-TKIs, पीछे निर्धारित करने के लिए एक सतत stepwise खुराक-वृद्धि विधि डुएल-प्रतिरोध मिले-TKI, PHA665752, और EGFR-TKI, gefitinib, पीसी-9MET1000 कोशिकाओं12में करने के लिए प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया था। इस विधि से परे gefitinib उपचार रोग की प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक नैदानिक परीक्षण के परिणाम पर भरोसा किया। मिले-प्रवर्धित EGFR-TKI-प्रतिरोध के मामले में, एक एकल मिले अवरोध करनेवाला काफी सेल के प्रसार को रोकना होगा नहीं। क्योंकि सिग्नल transduction रिसेप्टर और बहाव के बीच अलग (EGFR-ERK1/2 और मौसम-लगातार) अणुओं रहे हैं, संयुक्त दमन EGFR और मौसम की आवश्यकता होगी। में एक और फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता सेल लाइन, HCC827, जो भी एक EGFR उत्परिवर्तन, EGFR-TKI प्रतिरोध बंदरगाहों मिले प्रवर्धन के माध्यम से विकसित किया गया था। Suda एट अल. HCC827 कक्ष erlotinib की उपस्थिति में मिले-TKI विकसित PHA665752 प्रतिरोध करने के लिए मिले-TKI और EGFR-TKI18की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए उजागर की सूचना दी। इसके अलावा, मौसम-प्रवर्धन EGFR-TKI-प्रतिरोध के साथ के मामलों का अध्ययन करने के लिए नैदानिक परीक्षण आयोजित किया जा रहा हैं। इस प्रकार, EGFR-TKI के साथ उपचार के बाद अधिग्रहीत मिले-TKI प्रतिरोध की व्यवस्था की जांच करने के लिए, दोहरी-मौसम inhibitors और EGFR inhibitors के प्रतिरोध के लिए प्रेरित करने के लिए आवश्यक है।

प्रोटोकॉल शामिल stepwise खुराक-की वृद्धि एक मिले-TKI, PHA665752, gefitinib की 1 माइक्रोन की उपस्थिति में यहाँ वर्णित है। Stepwise खुराक-वृद्धि विधि सबसे अधिक विश्वसनीय और सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि18,19है। इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम अवरोध करनेवाला के आईसी50 मान प्राप्त है। यदि यह मान सही निर्धारित नहीं है, कक्षों पर सभी संस्कृति डिश में विकसित करने के लिए विफल हो जाएगा। सेल के विकास को धीमा करने के लिए शुरू होता है, इसलिए, अवरोध करनेवाला की एकाग्रता में वृद्धि को कम करने समस्या का समाधान हो सकता है। कोशिकाओं के मरने शुरू, तो इसके अलावा, यह उन्हें पिछले एकाग्रता में पुन: उपयोग करने के लिए शेष कोशिकाओं-80 ° C, पर संग्रहीत करने के लिए आदर्श होगा।

सेल लाइनों में प्रतिरोध की स्थापना के लिए एक वैकल्पिक तरीका है उच्च एकाग्रता जोखिम विधि जिसमें कोशिकाओं अवरोध करनेवाला का लक्ष्य एकाग्रता के लिए सीधे, उजागर कर रहे हैं, और जब तक जीवित प्रतिरोधी कोशिकाओं proliferating शुरू कक्षों सभ्य हैं। हालांकि इस पद्धति अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक है, लक्ष्य की एकाग्रता अवरोध करनेवाला है, जो शुरू में administrated है, के सभी अभिभावक कक्ष तुरंत मार सकता है, क्योंकि यह एक कम सफलता दर है। दिलचस्प है, यह बताया गया है कि इन दो तरीकों के माध्यम से प्राप्त प्रतिरोधी sublines विभिन्न सेलुलर गुण19,20प्रदर्शन।

प्रतिरोध की स्थापना के लिए किसी अन्य विधि है जो में एक सेल सस्पेंशन (1.0 × 106-2.0 × 107) चूहों, flanks में इंजेक्शन है vivo में प्रतिरोध विधि, और ट्यूमर 200 मिमी3की एक मात्रा तक पहुँच जाता, जब चूहों inhibitors के साथ करने के लिए निरंतर आधीन उपचार कर रहे हैं। ट्यूमर है कि पूरी तरह से प्रतिक्रिया, और उसके बाद पुनरावृत्ति के दौरान चिकित्सा पचा रहे हैं काटा, कीमा बनाया हुआ, trypsin के साथ, और तब फ़िल्टर किए गए और संस्कृति व्यंजन पर वरीयता प्राप्त बनाए रखा। इस विधि, हालांकि कुछ हद तक जटिल है, प्रभावी रूप से एंटीबॉडी-प्रतिरोध के मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता। हालांकि, जब ट्यूमर है कि प्रतिरोध में vivo प्रणाली में एक इन विट्रो में सिस्टम, कभी कभी उन कक्षों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं दिखाएँ 2D संस्कृति सिस्टम विकसित करने के लिए विफल। इसलिए, एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जैसे 3D संस्कृति सिस्टम इस्तेमाल किया21होना चाहिए।

हालांकि इन तरीकों के सभी तीन करने के लिए एक अपेक्षाकृत लंबा समय की आवश्यकता, stepwise खुराक-वृद्धि विधि सबसे किफायती है। यह भी स्पष्ट रूप से समझ और अवरोध करनेवाला-प्रतिरोध प्राप्त करने की प्रक्रिया का अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त विधि है। इसके अलावा, अन्य दो विधियाँ की सफलता की दर stepwise खुराक-वृद्धि विधि की तुलना में काफी कम है।

एक बार प्रतिरोध स्थापित किया है, यह इन सेल लाइनों की tumorigenic शक्ति का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है। बार-बार कॉलोनी गठन परीक्षण या vivo में ट्रांसफ़्यूज़न (चित्र 6) इस उद्देश्य के लिए कार्यरत हैं। इन विधियों 2D संस्कृति सिस्टम का उपयोग कर के नुकसान को दूर हो सकता है।

कक्षों के साथ अधिग्रहण प्रतिरोध अक्सर सही मानव कैंसर कोशिकाओं में प्रतिरोध को प्रतिबिंबित नहीं करते कि इन विधियों में से एक प्रमुख सीमा है। इसलिए, इन विट्रो में मॉडल में अध्ययन के माध्यम से की खोज की तंत्र मानव ऊतक नमूनों में बायोप्सी नमूने में दोहराया परीक्षण के माध्यम से पुष्टि की जानी चाहिए। हालांकि इन प्रोटोकॉल ट्यूमर कोशिकाओं के विकास के दौरान अधिग्रहण प्रतिरोध के पीछे व्यवस्था की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है, इसके अलावा, यह अधिग्रहण प्रतिरोध ट्यूमर microenvironment के परिवर्तन द्वारा प्रेरित किया गया था कि संभव है। यह केवल कैंसर की कोशिकाओं में इन प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता की जांच का एक और गंभीर सीमा है। यह मानव ऊतक बैंकों, जो कई शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं से ऊतकों का उपयोग करने के लिए बेहतर होगा।

यहाँ प्रस्तुत की गई प्रोटोकॉल के प्रतिरोध के रूप में अच्छी तरह से अन्य आणविक inhibitors की स्थापना के लिए संशोधित किया जा सकता। इसलिए, यह विधि भविष्य में कैंसर को नियंत्रित करने के लिए चिकित्सकीय उपकरण विकसित करने के लिए संभावित रूप से उपयोगी है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई विरोध की दिलचस्पी नहीं है।

Acknowledgments

हम अपने विचारशील टिप्पणी और उपयोगी सलाह के लिए आणविक ऑन्कोलॉजी के संस्थान, और अंग्रेजी भाषा संपादन के साथ उनकी सहायता के लिए Editage के सदस्यों को धन्यवाद। यह काम शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी के जापान से निजी विश्वविद्यालयों (2012-2016) में रणनीतिक अनुसंधान फाउंडेशन के लिए MEXT-समर्थित प्रोग्राम के द्वारा समर्थित किया गया। Tohru Ohmori Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, जर्मनी) से अनुसंधान (2015-2016) धन प्राप्त किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 Wako 189-02025 with L-Glutamine and Phenol Red
CellTiter 96 Promega G4100 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
FBS gibco 26140-079
Pen Strep gibco 15140-163
gefitinib Selleck S1025 stocked 10 mM/EMSO at -20ºC
PHA665752 Selleck S1070 stocked 10 mM/EMSO at -20ºC
96-well plate IWAKI 860-096 flat bottom with lid, low evaporation type
TC10 Automated Cell Counter BIO RAD #1450010
CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Promega G4100 Dye Solution and Solubilization/Stop Solution
Powerscan HT microplate reader BioTek
GraphPad Prism v.5.0 software GraphPad Inc.
PC-9 Riken BioResource Center RCB4455
P100 dish FALCON 353003

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References

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कैंसर अनुसंधान समस्या 126 फेफड़ों के कैंसर दोहरी-प्रतिरोध EGFR-TKI मिले-TKI फेफड़ों PC-9 ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं stepwise खुराक वृद्धि हासिल कर ली
एक 2-कदम खुराक-वृद्धि प्रक्रिया के साथ फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं <em>में इन विट्रो</em> में EGFR-TKI और TKI से मुलाकात के लिए दोहरी प्रतिरोध की स्थापना
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Yamaoka, T., Ohba, M., Arata, S., Ohmori, T. Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure. J. Vis. Exp. (126), e55967, doi:10.3791/55967 (2017).

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