Summary
在体外建立双抗 EGFR-使用 tki 药物治疗和癌症细胞中大都会使用 tki 药物治疗方法。此方法是用于开发陈列尽管大都会放大 EGFR-使用 tki 药物治疗治疗疾病进展的 EGFR 突变，患者的治疗方法。它也可以修改为针对其他分子的抑制剂。
Abstract
耐药是在癌症治疗中的一项重大挑战。耐药株在体外生成是发现新的机制，以克服这一挑战的必要条件。在这里，一种建立双电阻对表皮生长因子受体 (EGFR) 的 2 步剂量升级方法-酪氨酸激酶抑制剂 （使用 tki 药物治疗）、 吉非替尼和大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752，描述。这种方法基于简单逐步剂量递增抑制剂诱导的获得性抗性细胞系。产生耐药株的备用方法涉及细胞暴露于高浓度抑制剂中的一步。逐步的剂量递增方法具有更高的成功诱导可能性获得性抗性比这种方法。激活 EGFR 突变是响应与 EGFR-使用 tki 药物治疗，治疗的生物标志物应用的一线治疗非小细胞肺癌 (NSCLC)，那怀有这些突变。然而，尽管作出有效反应的报告，EGFR-使用 tki 药物治疗使用是有限因为肿瘤不可避免地获得耐药性。EGFR-使用 tki 药物治疗抵抗背后的主要机制包括看门人网站、 在 EGFR 外显子 20 T790M 和大都会旁路信号二次突变。因此，为这一问题的潜在解决方案将结合 EGFR-使用 tki 药物治疗和大都会-使用 tki 药物治疗。这个综合的治疗已被证明是有效的体外研究模型。获得性吉非替尼耐通过 MET 放大而成立的逐步剂量递增的吉非替尼治疗 12 个月，命名为 PC 9MET1000 细胞株在先前的研究中生成。进一步探讨获得性的 MET-使用 tki 药物治疗和 EGFR-使用 tki 药物治疗的机制抵抗，大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752，管理，给这些细胞逐步剂量递增吉非替尼在为 12 个月。本议定书也成功地适用于组合疗法建立获得性的耐药其他抑制剂分子的数目。
Introduction
致癌性突变中表皮生长因子受体 (EGFR) 发现在非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的一个子集，重要预测生物标记物此疾病1，2。这些最常用激活 EGFR 突变发生作为帧中删除在 19 号外显子 (delE746-A750) 或替换亮氨酸与精氨酸的外显子 (存在 L858R) 21 号 858 密码在 EGFR 酪氨酸激酶域3，4点突变。窝藏 EGFR 突变的非小细胞肺癌患者的临床有效治疗是治疗 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 （测出）。然而，这种疗法被受到限制抗 EGFR 测出吉非替尼和埃罗替尼等必然采集。最常见的获得性耐药发生，通过二次 T790M 突变基因外显子 20 的 EGFR，大约 60%的患者获得 EGFR-使用 tki 药物治疗 （吉非替尼或厄洛替尼） 电阻检测到。其他伴 EGFR 测出获得性耐药的分子机制并激活的旁路信号引起的大都会放大，转型小细胞肺癌，与上皮-间充质转变5，6。受体肝细胞生长因子，由 MET 基因，编码是 dysregulatedin 许多肿瘤，据报是重要的一个候选靶向疗法7，8。
战略，以克服 EGFR 测出获得性的耐药正进行临床评价。临床前和临床研究表明，第三代 EGFR 抑制剂如 osimertinib 是 T790M 突变9患者有效。此外，可通过联合治疗 EGFR 和大都会测出6，10抑制 EGFR 突变癌症与大都会放大的增长。评估患者的大都会和 EGFR 抑制剂组合与获得性耐药吉非替尼和埃罗替尼的临床试验正在进行现在是11。
研究对化疗药物产生获得性耐药的分子机制，最初响应抑制剂的细胞系是与这些抑制剂继续治疗。两种方法可用来建立获得性的耐药细胞系。一是逐步的剂量递增，和另一种是接触浓度高。逐步升级方法已被更常用，因为它具有很高的成功率。单元格第一次接触低浓度的抑制剂，近十分之一的半-极大抑制浓度 (IC50) 值，和浓度然后逐渐增加，由 10-30%直到达到靶浓度。高质量浓度暴露法涉及细胞暴露于最后一剂到培养基中，是超过 IC50值，所以几乎彻底杀死亲本细胞抑制剂。此高质量浓度暴露方法具有更低成功率比逐步升级方法。
在以往的研究中，EGFR-使用 tki 药物治疗与 MET-使用 tki 药物治疗联合的治疗被证明是有效的体外系统。获得性的耐药 EFGR-使用 tki 药物治疗，吉非替尼通过逐步升级为 12 个月，MET-放大，成立，因此，吉非替尼耐药细胞线称为 PC 9MET1000 生成的12。
该协议是两步剂量升级程序获得双抗 EGFR-使用 tki 药物治疗，吉非替尼和大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752 的 EGFR 突变的非小细胞肺癌 PC 9 细胞 (图 1)。这种方法建立获得性耐药细胞系中是相对较容易执行，成功率高。描述的协议可以修改为其他分子靶向药物的细胞毒性药物以及抑制剂的应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.建立吉非替尼耐药细胞
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 溴 (MTT) 法测定确定初始吉非替尼治疗浓度。
- 细胞生长介质中的 PC-9 (rpmi-1640 培养基用 10%胎牛血清、 1%抗生素 (青霉素： 100ml U 和链霉素： 100 微克/毫升))，在一个 5%CO2的孵化器在 37 ° c。
- 调整单元格到 1.0 × 105细胞/毫升使用自动化的单元反击 （见材料表） 和种子 50 µ L 的这在每口井的 96 孔板使用培养基;最后浓度的细胞应该是 5.0 × 103细胞/井。
- 孵育板一夜之间在 37 ° c。
- 添加不同浓度的吉非替尼 （在 2 X 终浓度) 50 µ L: 0 0.002 0.006、 0.02、 0.06、 0.2、 0.6、 2，6，、 20 µ M 到这些井这种每年最终卷好是 100 μ L。
- 孵育板为 72 h 在 37 ° c。
- 添加染料溶液 15 µ L （见表的材料） （使用最后 13%浓度的染料溶液），每口井和孵育 4 h 在 37 ° c。
- 添加 100 μ L 的增溶作用/停止解决方案 （见表的材料） 为溶解并结合产生的染料溶液 （见表的材料），每年得很好，和孵化它一夜之间在 37 ° c。
- 测量的光学密度在 570 毫微米 (OD570) 使用酶标仪申领 IC50值通过生成细胞增殖曲线。
- 使用统计软件 （见表的材料），以图形方式显示数据，并计算 IC50值 (图 2)。
- 准备 6-12 复制和重复实验至少三次。
- 连续逐步剂量-升级的吉非替尼治疗的 PC-9 细胞。
- PC-9 细胞培养 （在分合流条件 1 毫升） p100 菜用 10 毫升的生长介质在 5%CO2孵化器在 37 ° c。
- 添加到 p100 菜吉非替尼的 IC50值的十分之一。
- 当培养基中的细胞成为分合流时，添加 10 毫升的新鲜培养基使用 1 毫升吸管 10-30%浓度较高的吉非替尼在相同的培养条件下细胞 1-2 毫升。
- 吉非替尼浓度逐步增加 10-30%与每个分裂，直到它到达 1 µ M;这可能需要大约 6-12 个月。
注意： 当吉非替尼的浓度达到 IC50值时，细胞增殖变得要慢得多，和因此，2-4 毫升的细胞可能会添加到 10 毫升的新鲜培养基浓度较高的吉非替尼;减少的吉非替尼治疗浓度的增加可能会解决问题。此外，它将理想储存在-80 ° C，剩余的单元格并重新使用它们在以前的浓度。由于 PC-9 细胞悬浮液中，它是不必要胰蛋白酶用于传代;然而，在过程中吉非替尼治疗浓度的增加，细胞可附加到培养皿的底部。在这种情况下，细胞刮刀可以用于分离的贴壁细胞。 - 生长介质与 1 µ M 的吉非替尼吉非替尼耐药的 PC-9 细胞培养。
- 执行 mtt 法检测以确认吉非替尼耐细胞13;这些吉非替尼耐药细胞被命名为 PC 9MET1000 （指定为 MET1000 细胞），因为他们表现出增加的蛋白质和 RNA 水平的大都会 （图 3A、图 4A、 B）。
2.建立双电阻对吉非替尼和 PHA665752
- 确定 PHA665752 mtt 法检测的初始浓度。
- MET1000 培养细胞在 p100 菜用 10 毫升的生长介质和 1 µ M 吉非替尼治疗中 5%CO2孵化器在 37 ° c。
- 到 96 孔板在 5.0 × 103细胞/井与 50 µ L 的生长介质在每口井的种子细胞。调整终浓度为细胞到 1.0 × 105细胞/毫升使用自动化的单元反击 （见表的材料）。
- 孵育板一夜之间在 37 ° c。
- 添加 50 µ L 的 PHA665752，大都会-使用 tki 药物治疗 （在 2 X 最终浓度)，对不同浓度的细胞： 0 0.002 0.006、 0.02、 0.06、 0.2、 0.6、 2，6，、 20 µ M，包括 2 µ M 吉非替尼治疗 （在 2 X 最终浓度）;在每口井的最终数量应该是 100 μ L。
- 孵育板为 72 h 在 37 ° c。
- 添加染料溶液 15 µ L （见表的材料），以每个好，并孵育 4 h 在 37 ° c。
- 为溶解并结合产生的染料溶液添加 100 μ L 的增溶作用停止解决方案 （见表的材料），每个都很好，并再一次孵化一夜之间在 37 ° c。
- 测量的光学密度在 570 毫微米 (OD570) 使用酶标仪申领 IC50值通过生成细胞增殖曲线。
- 使用统计软件 （见表的材料），以图形方式显示数据，并计算 IC50值的 PHA665752 在吉非替尼 (图 3B)。
- 准备 6-12 复制和重复实验至少三次。
- 建立双电阻在 MET1000 细胞对吉非替尼和 PHA665752。
- 在 p100 菜用 10 毫升生长的培养基，细胞培养 MET1000 及 1 µ M 吉非替尼治疗中 5%CO2孵化器在 37 ° c。
- 添加到生长介质中，吉非替尼具有相同的文化条件 1 µ M PHA665752 IC50值的十分之一。
- 逐步增加，PHA665752 浓度由 10-30%，每个分裂直到它到达 1 µ M。这可能需要大约 6-12 个月。
注意： 当 PHA665752 的浓度达到 IC50值时，细胞增殖变得要慢得多，和因此，2-4 毫升的细胞可能使用添加至 10 毫升新鲜生长的培养基 1 毫升吸管浓度较高的 PHA665752;减少的 PHA665752 浓度的增加可能会解决问题。此外，它将理想储存在-80 ° C，剩余的单元格并重新使用它们在以前的浓度。这是没有必要使用胰蛋白酶传代;然而，在 PHA665752 浓度的增加，过程中的细胞可能会附加到培养皿的底部。在这种情况下，细胞刮刀可以用来分离细胞。 - 最后，文化 PC 9 细胞耐药吉非替尼和 PHA665752 在生长培养基与 1 µ M 每个吉非替尼和 PHA665752 在一个 5%CO2的孵化器在 37 ° c。
- 执行 mtt 法检测以确认细胞是双耐药吉非替尼和 PHA66575213，而且他们是不敏感的 PHA665752 在吉非替尼;这些双电阻细胞被命名为 PC 9 博士 （指定为博士细胞） (图 5)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这手稿 》 中提出了议定书 》 概述如图 1，包括对吉非替尼和 PHA665752 的抗性双感应 PC 9 单元格中通过 2 步剂量升级过程所示。图 2显示了细胞增殖的家长 PC 9 随着浓度的增加吉非替尼的跌幅。这表明，PC-9 细胞变得敏感对吉非替尼剂量升级过程完成之后。图 3显示 PC 9MET1000 细胞表现出电阻对吉非替尼，但对大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752，在吉非替尼敏感。吉非替尼，显示他们对吉非替尼敏感浓度较高，抑制了 PC-9 细胞增殖。然而，PC 9MET1000 细胞没有显示减少的扩散甚至在高浓度的吉非替尼表示，他们已经对获得性抗性吉非替尼。当 PC 9MET100 细胞随浓度的 PHA665752 中存在为 72 h 吉非替尼治疗时，其扩散，如 mtt 法检测，显著下降。也是温和跌幅吉非替尼没有 PC 9MET1000 细胞的增殖。因此，吉非替尼和 PHA665752 的组合会比 PHA665752 单独治疗更有效地抑制细胞增殖。
图 4显示大都会 （蛋白质和 RNA） 扩增的的水平在 PC 9MET1000 和 PC 9 博士细胞;没有获得性的突变 EGFR 和大都会中存在。因此，旁路信号出现强烈建议作为一个 EGFR-使用 tki 药物治疗和 （或） 大都会-使用 tki 药物治疗获得性耐药的原因。图 5显示 PC 9 博士细胞的抗到 PHA665752 在 1 µ M 的吉非替尼，mtt 法检测。虽然 PC 9MET1000 细胞的增殖，抑制 PHA665752 与吉非替尼治疗，PC 9 博士细胞存活的处理，表明他们双耐药吉非替尼和 PHA665752。因此，通过 2 步剂量升级程序，PC-9 细胞获得性抗性对吉非替尼和 PC 9MET1000 细胞对获得性抗性 PHA665752 在 1 µ M 的吉非替尼。图 6显示锚固独立和扩散的 MET1000 博士细胞在软琼脂中的 PHA665752 和吉非替尼的存在与否。PC 9MET1000 和 PC 9 博士细胞生长的观察软琼脂，指示这些株能生长在 2D 和 3D 系统。因此，耐药株克服了不能够成长在二维系统的限制。此外，PC 9 博士细胞，但不是 PC 9MET1000 细胞，可以生长在琼脂与吉非替尼和 PHA665752 1 µ M。这一结果表明 PC 9 博士细胞耐药吉非替尼和 PHA665752，并可以在 3D 文化体制下以及生长。通过集落形成法或体内移植14应签既定的耐药株的致瘤性属性。
图 1： 架构生成双电阻： PC 9 博士从 PC-9 细胞细胞。
图为生成双抗从 PC-9 细胞无性系的 2 步剂量升级程序。请点击这里查看此图的大版本。
图 2: EGFR-使用 tki 药物治疗吉非替尼抑制细胞增殖的 PC-9。
PC-9 细胞接种到 96 孔板在 5 × 103细胞/井与 50 µ L 的生长介质在每口井，一夜之间，预培养，然后用吉非替尼在 72 小时浓度的指示。Mtt 和酶标仪测定 OD570 。IC50值是 0.048 ± 0.01 µ M.数据如下所示平均 ± 扫描电镜对 6 口井。请点击这里查看此图的大版本。
图 3: PC 9MET1000 细胞表现出电阻对吉非替尼，但在 1 µ M PHA665752 吉非替尼治疗抑制其增殖。
(A) PC-9 和 MET1000 细胞接种到 96 孔板在 5 × 103细胞/井与 50 µ L 的生长介质，预孵育一夜之间，然后处理吉非替尼在 72 h.浓度的指示，每年 (B) MET1000 细胞接种到 96 孔板在 5 × 103细胞/井与生长的培养基在每口井 50 µ L前, 一夜之间，孵化，然后治疗 PHA665752 表明浓度在 1 µ M 的吉非替尼为 72 h 的存在与否。Mtt 和酶标仪测定 OD570 。吉非替尼在 IC50值为 0.014 ± 0.01 微米，而，吉非替尼没有不坚定的。数据显示为平均 ± 扫描电镜对 6 口井。请点击这里查看此图的大版本。
图 4: MET 放大观察在 PC 9MET1000 和 PC 9 博士细胞中 EGFR 和大都会没有获得性突变。
(A) 表达采用免疫印迹分析磷大都会和总大都会水平进行测定。Β-肌动蛋白用作加载控件。(B) mRNA 成绩单从 PC 9、 PC-9MET1000 和 PC 9 博士细胞进行量化使用实时 RT-PCR 和归一化与 GAPDH。相对于 PC 9 值数据给出了当 ± SEM 的意思是 (n = 8)。统计意义估计使用双尾学生t-检验和p < 0.05 被认为有统计学意义。*， p < 0.05，与 PC 9 值进行比较。(C) 外显子 19-21 的 EGFR 基因和 Met 基因外的显子 14-21 从基因组 DNA pcr 扩增。PCR 产物然后进行纯化和分析。请点击这里查看此图的大版本。
图 5: PC 9 博士细胞是到 PHA665752 在 1 µ M 的吉非替尼耐药。
DR 细胞接种到 96 孔板在 5 × 103细胞/井与 50 µ L 的生长介质在每口井，预孵育一夜之间，然后用 PHA665752 表明浓度在 1 µ M 的吉非替尼为 72 小时。Mtt 和酶标仪测定 OD570 。数据显示为平均 ± 扫描电镜对 6 口井。请点击这里查看此图的大版本。
图 6:锚固独立细胞增殖的 PC 9MET1000 和 PC 9 博士在软琼脂中的 PHA665752 和吉非替尼的存在与否上。
细胞 (1 × 104) 重新悬浮在 10%胎牛血清接种到 6 孔板在预涂 0.6%软琼脂，琼脂 0.3%。第二天，细胞治疗吉非替尼 (1 µ M) 和 PHA665752 (1 µ M)，然后培养了 14-21 天。1 h.0.005%结晶紫染色殖民地请点击这里查看此图的大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的协议可以用于获得双抗性使用 2 步剂量递增法体外癌细胞中建立。许多研究论文报道，PC-9 细胞抗药性 EGFR-使用 tki 药物治疗 （吉非替尼或厄洛替尼） 通过 T790M EGFR 突变15，16。然而，我们没有检测到 T790M 突变基因外显子 20 的我们的 PC 9MET1000 细胞通过直接测序法 (图 4)。此外，大都会放大观察作为信号转导通路的旁路。因此，PC 9MET1000 细胞是极为罕见的。我们先前报道肺腺癌的 PC-9 细胞窝藏 EGFR 外显子 19 15 bp 删除开发吉非替尼耐与大都会放大后 12 个月，直到剂量达到 1 µ M （命名为 PC 9MET1000 细胞）17进行了连续的逐步剂量递增。这种细胞系是对吉非替尼在大都会使用 tki 药物治疗敏感。为了确定阻力对 EGFR-和大都会-测出，背后的机制连续逐步剂量升级方法来诱导对大都会-使用 tki 药物治疗、 PHA665752 和 EGFR-使用 tki 药物治疗，吉非替尼在 PC 9MET1000 细胞12双抗性。这种方法依赖于要研究进展之外吉非替尼治疗的疾病进行临床试验的结果。在大都会放大 EGFR-使用 tki 药物治疗-电阻，单 MET 抑制剂不会明显抑制细胞增殖。因为受体下游信号转导分子分离 （EGFR-ERK1/2 和大都会 AKT），联合的抑制 EGFR 和大都会将需要。在另一个肺腺癌细胞系，HCC827，也怀有 EGFR 突变，EGFR-使用 tki 药物治疗抵抗了通过 MET 放大。苏达等人报道 HCC827 细胞暴露于厄洛替尼在大都会-使用 tki 药物治疗和 EGFR-使用 tki 药物治疗18MET-使用 tki 药物治疗 PHA665752 开发抗浓度增加。此外，正在进行临床试验研究个案的大都会放大与 EGFR 耐使用 tki 药物治疗。因此，探讨 EGFR-使用 tki 药物治疗处理后获得大都会-使用 tki 药物治疗抗性的机制，它是需要诱导双电阻 MET 抑制剂和 EGFR 抑制剂。
议定书 》 这里描述涉及逐步剂量-升级的大都会-使用 tki 药物治疗，PHA665752，在 1 µ M 的吉非替尼。逐步的剂量递增方法是最可靠和最常用的方法18，19。在本议定书中最关键的一步获得 IC50值的抑制剂。如果此值不准确地确定，细胞将不能在所有生长在培养皿中。因此，如果细胞增长开始放缓，减少抑制剂浓度的增加可能会解决这个问题。此外，如果细胞开始死亡，它将理想来存储剩余的单元格在-80 ° C，再利用它们在以前的浓度。
一种建立在细胞系中的电阻的备用方法是高浓度接触方法，其中细胞暴露于靶浓度的抑制剂，直接和细胞是直到幸存的耐药细胞开始增殖。虽然这种方法是更多的临床相关的它有较低的成功率，因为目标浓度的抑制剂，最初给药，可能会立即杀死父母的所有单元格。有趣的是，有报告说，通过这两种方法获得的耐药株表现出不同的细胞特性19，20。
建立抵抗另一种方法是体内在电阻法的细胞悬液 (1.0 × 106-2.0 × 107) 注入小鼠，侧面和当肿瘤达到 200 毫米3卷，老鼠们都遭受连续抑制剂治疗。肿瘤反应完全，然后复发期间维持治疗是收获，剁碎，用胰蛋白酶消化和筛选，然后播种到培养皿上。这种方法，虽然有点复杂，可有效地在抗体抵抗的情况下。然而，当显示体内系统阻力转移到体外系统，有时细胞肿瘤未能成长二维培养系统。因此，三维培养系统等基底膜矩阵应为使用的21。
所有三种方法都需要较长的时间来执行，逐步的剂量递增方法是最经济。它也是最适宜的方法对清楚地了解和研究获得抑制剂抵抗的过程。此外，其他两种方法的成功率是显著低于逐步剂量升级方法。
一旦建立了阻力，就必须测试这些细胞的致瘤性效力。为此目的 (图 6) 经常采用集落形成试验或体内移植。这些方法可能克服使用二维培养系统的缺点。
这些方法的主要局限性是细胞与获得性耐药往往并不能反映人类肿瘤细胞中的阻力。因此，通过体外模型的研究发现的机制应通过反复试验在活检标本在人体组织样本中确认。此外，虽然这些协议可用于检查背后获得性耐药肿瘤细胞发育过程中的机制，有可能获得的抗性诱导肿瘤微环境的变化。这是另一个严重的限制，调查这些协议中只有癌细胞的疗效。它将更好地从人体组织银行，可用于许多研究者用纸巾。
议定书 》 在这里提出了一种可以修改为建立以及其他分子抑制剂的抗性。因此，这种方法是有可能用于开发治疗的工具，以便在将来控制癌症。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者有没有利益冲突的披露。
Acknowledgments
我们感谢他们提出深思熟虑的意见和有益的建议，分子肿瘤研究所和 Editage 提供的援助与英语语言编辑成员。这项工作是为私立大学 （2012年-2016 年） 从教育部、 文化、 体育、 科学和技术的日本战略研究基金会支持由文部科学省支持程序。钱 Ohmori 收到勃林格殷格翰 （殷格翰，德国） 资金 （2015年-2016 年） 的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
