Summary
Een in vitro -methode voor de vaststelling van dubbele weerstand tegen een EGFR-TKI en een BMO-TKI in kankercellen wordt beschreven. Deze methode is handig voor het ontwikkelen van behandelingen voor patiënten met EGFR-mutaties, die de progressie van de ziekte ondanks EGFR-TKI behandeling met BMO-amplificatie vertonen. Het kan ook worden gewijzigd voor remmers gericht op andere moleculen.
Abstract
Resistentie is een grote uitdaging in kankertherapie. De generatie van resistente sublijnen in vitro is noodzakelijk voor het ontdekken van nieuwe mechanismen te overwinnen van deze uitdaging. Hier, een 2-step dosis-escalatie-methode voor de vaststelling van dual-weerstand tegen een epidermale groeifactor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI), gefitinib en een BMO-TKI, PHA665752, wordt beschreven. Deze methode is gebaseerd op eenvoudige stapsgewijze dosis-escalatie van remmers voor inducerende verworven resistentie bij cellijnen. De alternatieve methode voor het genereren van resistente sublijnen gaat bloot van de cellen aan hoge concentraties van de Inhibitor van de omwenteling in één stap. De stapsgewijze dosis-escalatie-methode heeft een hogere mogelijkheidom succesvol inducerende verworven weerstand dan deze methode. Activeren van de EGFR zijn mutaties biomarkers voor een reactie op behandeling met EGFR-TKI, dat is een toegepaste eerstelijnsbehandeling voor niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK), die deze mutaties haven. Ondanks berichten van doeltreffend antwoord wordt geformuleerd is het gebruik van EGFR-TKI echter beperkt omdat tumoren onvermijdelijk resistentie verwerven. De belangrijkste mechanismen achter EGFR-TKI weerstand omvatten een secundaire mutatie op de site van de gatekeeper, T790M in exon 20 van EGFR en een signaal van de rondweg van BMO. Dus, zou een mogelijke oplossing voor dit probleem een combinatie van EGFR-TKI en BMO-TKI. Deze gecombineerde behandeling blijkt effectief te zijn in een in vitro studie model. Verworven gefitinib-resistentie opgericht door BMO-amplificatie door stapsgewijze dosis-escalatie van gefitinib voor 12 maanden en een cellijn met de naam PC-9MET1000 werd gemaakt in een eerdere studie. Voor het verder onderzoek naar de mechanismen van verworven BMO-TKI en EGFR-TKI werd weerstand, een BMO-TKI, PHA665752, toegediend aan deze cellen met stapsgewijze dosis-escalatie in aanwezigheid van gefitinib voor 12 maanden. Dit protocol heeft ook met succes toegepast voor een aantal combinatie therapieën om verworven weerstand tegen andere moleculen van de Inhibitor van de omwenteling.
Introduction
Oncogene mutaties in de epidermale groeifactor receptor (EGFR) zijn te vinden in een subset van patiënten met niet-kleincellige longkanker (NKCLK) en zijn belangrijke voorspellende biomarkers voor deze ziekte1,2. Deze meestal het activeren van EGFR mutaties optreden als een in-frame verwijderen in exon 19 (delE746-A750) of een punt-mutatie leucine vervangen door arginine op codon 858 van exon 21 (L858R) in de EGFR tyrosine kinase domein3,4. Behandeling met EGFR-tyrosine kinase remmers (TKIs) is een klinisch effectieve therapie voor patiënten met NKCLK herbergen EGFR mutaties. Deze therapie wordt echter beperkt door de onvermijdelijke overname van weerstand tegen EGFR-TKIs zoals gefitinib en erlotinib. De meest voorkomende verworven resistentie treedt op door een secundaire T790M mutatie in exon 20 van EGFR, die werd ontdekt in ongeveer 60% van de patiënten die EGFR-TKI (gefitinib of erlotinib) weerstand verworven. Andere moleculaire mechanismen die zijn gekoppeld aan de verworven resistentie aan EGFR-TKIs zijn de activering van de rondweg signalering veroorzaakt door BMO amplificatie, transformatie van kleincellige longkankerziekten en epitheliale-naar-mesenchymale overgang5,6. De receptor voor de hepatocyte groeifactor, gecodeerd door het BMO-gen, die is dysregulatedin veel tumoren, is gemeld als een belangrijke kandidaat voor gerichte therapieën7,8.
Strategieën voor het overwinnen van de verworven weerstand tegen EGFR-TKIs ondergaan klinische evaluatie nu. Preklinische en klinische studies hebben aangetoond dat derde generatie EGFR-remmers zoals osimertinib effectief voor patiënten met de T790M mutatie9zijn. Daarnaast kan de groei van kanker van de EGFR-mutant met BMO amplificatie worden geremd door gecombineerde behandeling met EGFR - en BMO-TKIs6,10. Klinische beoordeling van een combinatie van BMO en EGFR-remmers bij patiënten met verworven weerstand tegen gefitinib en erlotinib zijn aan de gang nu11.
Om te studeren het moleculaire mechanisme van verworven weerstand tegen chemotherapeutische agenten, worden cellijnen die aanvankelijk op remmers reageren voortdurend behandeld met deze remmers. Er zijn twee methoden beschikbaar om verworven resistentie in cellijnen. Een stapsgewijze dosis-escalatie is, en anderzijds hoge concentratie blootstelling. De methode van de stapsgewijze escalatie is meer algemeen gebruikt, omdat er een hoger slagingspercentage. De cellen worden eerst blootgesteld aan lage concentraties van de remmers, bijna een tiende van de waarde van de helft-maximale remmende concentratie (IC50), en de concentratie wordt vervolgens geleidelijk verhoogd met 10-30% tot de concentratie van de doelgroep wordt bereikt. Hoge concentratie blootstelling bij deze methode wordt de cellen aan de laatste dosis van de Inhibitor van de omwenteling in het kweekmedium, dat meer dan de waarde van de IC50 , is dus de ouderlijke cellen zijn bijna volledig gedood bloot. Deze hoge-concentratie blootstelling methode heeft veel succes langzamer dan de methode van de stapsgewijze escalatie.
In een eerdere studie, gecombineerde behandeling met EGFR-TKI en BMO-TKI bleek effectief te zijn in een in vitro -systeem. Verworven weerstand tegen een EFGR-TKI, gefitinib, werd opgericht door stapsgewijze escalatie voor 12 maanden, samen met BMO-amplificatie, en dus een gefitinib-resistente cellijn PC-9MET1000 genaamd gegenereerde12was.
Het protocol hier gepresenteerd is een procedure in twee fasen dosis-escalatie voor het verkrijgen van EGFR-gemuteerd NKCLK PC-9 cellen met dubbele weerstand tegen de EGFR-TKI, gefitinib, en een BMO-TKI, PHA665752 (Figuur 1). Deze methode voor de vaststelling van verworven resistentie in cellijnen is relatief gemakkelijk uit te voeren, met een hoog slagingspercentage. Het protocol beschreven kan worden aangepast voor toepassing met remmers van andere moleculaire doel drugs en cytotoxische agenten ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stellen Gefitinib-resistente cellen
- Bepaal de concentratie van de oorspronkelijke gefitinib 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
- Cultuur van PC-9 cellen in groeimedium (RPMI-1640 medium met 10% FBS en 1% antibiotica (penicilline: 100 U/mL en streptomycine: 100 µg/mL)), in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Aanpassen van de cellen te 1.0 × 105 cellen/mL met behulp van een geautomatiseerde cel counter (Zie tabel van materialen) en seed 50 µL van dit in ieder putje van een 96-wells-plaat met behulp van het groeimedium; de uiteindelijke concentratie van cellen moet 5.0 × 103 cellen per putje.
- Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C.
- Voeg 50 µL van gefitinib (bij 2 X eindconcentratie) bij verschillende concentraties: 0, 0.002 0.006, 0.02, 0,06, 0.2, 0,6, 2, 6 en 20 µM aan deze putjes dergelijke dat het eindvolume in elk 100 µL Nou is.
- Incubeer de plaat gedurende 72 uur bij 37 ° C.
- Voeg 15 µL van de kleurstof-oplossing (Zie Tabel van materialen) aan elk putje (gebruik 13% eindconcentratie van de kleurstof oplossing), en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Voeg 100 µL van de solubilisatie/stop-oplossing (Zie Tabel of Materials) voor solubilizing de formazan geproduceerd door de kleurstof-oplossing (Zie Tabel van materialen) in elk goed en het 's nachts Incubeer bij 37 ° C.
- Meten van de extinctie bij 570 nm (OD570) microplate lezer gebruikt voor het verkrijgen van de IC50 waarde door het genereren van een celproliferatie curve.
- Gebruik een statistische software (Zie Tabel van materialen) grafisch weergeven van de gegevens en berekenen de IC50 (Figuur 2).
- Bereiden van 6-12 wordt gerepliceerd en herhaal de experimenten ten minste driemaal.
- Continu stapsgewijze dosis-escalatie van gefitinib voor behandeling van PC-9 cellen.
- Cultuur PC-9 cellen (1 mL in sub confluente voorwaarde) in p100 gerechten met 10 mL groeimedium in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Voeg een tiende van de IC50 waarde van gefitinib in de p100-schotel.
- Wanneer de cellen in het kweekmedium sub confluente geworden, voeg 1-2 mL cellen tot 10 mL verse groeimedium met behulp van een pipet 1mL met 10-30% hogere concentratie van gefitinib in dezelfde cultuur voorwaarden.
- De concentratie gefitinib geleidelijk verhogen met 10-30% met elke split totdat zij 1 µM tot; Dit kan duren ongeveer 6-12 maanden.
Opmerking: Wanneer de concentratie van gefitinib de IC50 waarde bereikt, de celproliferatie wordt aanzienlijk trager, en dus, 2-4 mL van cellen kan worden toegevoegd aan 10 mL van de verse groeimedium met hogere concentratie van gefitinib; vermindering van de toename van de concentratie van gefitinib, wordt het probleem misschien oplossen. Het zou bovendien ideaal voor het opslaan van de resterende cellen bij-80 ° C en hergebruiken in de vorige concentratie. Aangezien PC-9 cellen in suspensie, is het onnodig gebruik van tripsine voor passaging; echter tijdens het proces van toenemende concentratie gefitinib, kunnen de cellen hechten aan de onderkant van de schotel cultuur. In een dergelijke situatie, kan een cel-schraper voor het loskoppelen van de Adherente cellen worden gebruikt. - Cultuur de gefitinib-resistente PC-9 cellen in het groeimedium met 1 µM van gefitinib.
- Uitvoeren van de bepaling van de MTT om te bevestigen de gefitinib-weerstand van de cellen13; Deze gefitinib-resistente cellen werden genoemd PC-9MET1000 (aangewezen als MET1000 cellen), omdat ze tentoongesteld meer eiwitten en RNA niveaus van BMO (figuur 3A, figuur 4A, B).
2. vaststellen van de Dual-weerstand tegen Gefitinib en PHA665752
- Bepaling van de beginconcentratie aan PHA665752 door MTT assay.
- Cultuur de MET1000 cellen in p100 gerechten met 10 mL groeimedium en 1 µM gefitinib in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Het zaad van de cellen in een 96-wells-plaat op 5.0 × 103 cellen per putje met 50 µL van het groeimedium in elk putje. Aanpassen van de uiteindelijke concentratie van de cellen tot en met 1.0 × 105 cellen/mL met behulp van een geautomatiseerde cel counter (Zie Tabel van materialen).
- Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C.
- Voeg 50 µL van PHA665752, een BMO-TKI (bij 2 X eindconcentratie), aan de cellen in verschillende concentraties: 0, 0.002 0.006, 0.02, 0,06, 0.2, 0,6, 2, 6 en 20 µM met inbegrip van 2 µM gefitinib (bij 2 X eindconcentratie); het eindvolume in elk putje moet 100 µL.
- Incubeer de plaat gedurende 72 uur bij 37 ° C.
- Voeg 15 µL van de kleurstof-oplossing (Zie Tabel van materialen) elk goed, en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Toevoegen van 100 µL van de solubilisatie/stop oplossing voor solubilizing de formazan geproduceerd door de kleurstof-oplossing (Zie Tabel van materialen) aan elkaar goed, en opnieuw na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- Meten van de extinctie bij 570 nm (OD570) microplate lezer gebruikt voor het verkrijgen van de IC50 waarde door het genereren van een celproliferatie curve.
- Gebruik een statistische software (Zie Tabel van materialen) grafisch weergeven van de gegevens en berekenen van de waarde van de IC-50 van PHA665752 in aanwezigheid van gefitinib (figuur 3B).
- Bereiden van 6-12 wordt gerepliceerd en herhaal de experimenten ten minste driemaal.
- De dual-resistentie in MET1000 cellen gefitinib en PHA665752 stellen.
- Cultuur de MET1000 cellen in p100 gerechten met 10 mL groeimedium, en 1 µM gefitinib in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Een tiende van de waarde van de IC-50 van PHA665752 in het groeimedium in aanwezigheid van 1 µM van gefitinib met dezelfde cultuur voorwaarden toevoegen.
- De concentratie van PHA665752 geleidelijk met 10-30% toenemen met elke split totdat zij 1 µM tot. Dit kan duren ongeveer 6-12 maanden.
Opmerking: Wanneer de concentratie van PHA665752 de IC50 waarde bereikt, de celproliferatie wordt aanzienlijk langzamer, en dus, 2-4 ml van cellen kan worden toegevoegd met behulp van een pipet 1 mL 10 ml van de verse groeimedium met hogere concentratie van PHA665752; vermindering van de toename van de concentratie van PHA665752, wordt het probleem misschien oplossen. Het zou bovendien ideaal voor het opslaan van de resterende cellen bij-80 ° C en hergebruiken in de vorige concentratie. Het is onnodig om het gebruik van tripsine voor passaging; echter tijdens de toename van de concentratie van de PHA665752, kunnen de cellen hechten aan de onderkant van de schotel cultuur. In dergelijke situaties kan een cel-schraper worden gebruikt om de cellen los te maken. - Ten slotte cultuur de PC-9 cellen resistent tegen zowel gefitinib en PHA665752 in het groeimedium met 1 µM elke gefitinib en PHA665752 in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Uitvoeren van de bepaling van de MTT om te bevestigen dat de cellen dual-resistent zijn tegen gefitinib en PHA66575213, en dat ze niet gevoelig zijn voor PHA665752 in aanwezigheid van gefitinib zijn; Deze dual-weerstand-cellen werden PC-9 DR (aangeduid als DR cellen) genoemd (Figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het overzicht van het protocol gepresenteerd in dit manuscript is afgebeeld in Figuur 1, met inbegrip van de inductie van verworven dual-weerstand tegen gefitinib en PHA665752 in PC-9 cellen door een 2-step dosis-escalatie-procedure. Figuur 2 toont een daling van de proliferatie van ouderlijke PC-9 cellen als de concentratie van gefitinib toeneemt. Dit geeft aan dat de PC-9 cellen gevoelig voor gefitinib werd na de dosis-escalatie-procedure werd uitgevoerd. Figuur 3 toont dat de PC-9MET1000 cellen weerstand tegen gefitinib vertonen, maar gevoelig voor een BMO-TKI, PHA665752, in aanwezigheid van gefitinib zijn. De PC-9 celproliferatie was bij hogere concentraties van gefitinib, die aangeeft dat ze gevoelig zijn voor gefitinib waren onderdrukt. PC-9MET1000 cellen toonde echter geen verminderde proliferatie zelfs bij hoge concentraties van gefitinib, die aangeeft dat zij had verworven weerstand tegen gefitinib. Als PC-9MET100 cellen werden behandeld met toenemende concentraties van PHA665752 in de aanwezigheid of afwezigheid van gefitinib voor 72 h, was de verspreiding, zoals gemeten door een MTT assay, sterk gedaald. Er was ook een bescheiden daling in de proliferatie van PC-9MET1000 cellen in het ontbreken van gefitinib. Dus, zou een combinatie van gefitinib en PHA665752 celproliferatie effectiever dan behandeling met PHA665752 alleen onderdrukken.
Figuur 4 toont versterkte niveaus van BMO (zowel eiwitten en RNA) in PC-9MET1000 en PC-9 DR cellen; geen verworven mutaties zijn aanwezig in de EGFR en BMO. De opkomst van de rondweg signalering is daarom sterk aanbevolen als een oorzaak van de verworven resistentie aan EGFR-TKI en/of BMO-TKI. Figuur 5 toont de weerstand van de cellen van de PC-9 DR PHA665752 in aanwezigheid van 1 µM van gefitinib, zoals gemeten door een MTT-assay. Hoewel de verspreiding van PC-9MET1000 cellen werden geremd door behandeling met gefitinib en PHA665752, overleefde PC-9 DR cellen de behandeling, die aangeeft dat zij dual-resistent gefitinib en PHA665752 waren. Dus, door middel van een procedure van 2-step dosis-escalatie, PC-9 cellen verworven weerstand tegen gefitinib en PC-9MET1000 cellen verworven weerstand tegen PHA665752 in aanwezigheid van 1 µM van gefitinib. Figuur 6 toont de anchorage-onafhankelijke verspreiding van MET1000 en DR cellen in zachte agar in de aanwezigheid of afwezigheid van PHA665752 en gefitinib. De groei van zowel PC-9MET1000 en PC-9 DR cellen werden waargenomen op zachte agar, die aangeeft dat deze sublijnen in zowel 2D als 3D systemen groeien kunnen. Aldus, had de resistente sublijnen overwinnen de beperking van niet zijnde kundig voor groeien in 2D systemen. Bovendien, PC-9 DR cellen, maar niet op PC-9MET1000 cellen, kon groeien in een agar met 1 µM van gefitinib en PHA665752. Dit resultaat geeft aan dat PC-9 DR cellen resistent aan zowel gefitinib en PHA665752 waren, en in een 3D-cultuur-systeem ook groeien kon. De tumorigene eigenschap van de gevestigde resistente sublijnen moet worden gecontroleerd door een kolonie vorming assay of in vivo transplantatie14.
Figuur 1: Schema van het genereren van dual-weerstand: PC-9 DR cellen van PC-9 cellen.
Diagram voor het genereren van dual-resistente klonen van PC-9 cellen door een 2-step dosis-escalatie-procedure. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: EGFR-TKI gefitinib geremd de proliferatie van PC-9 cellen.
PC-9 cellen werden zaadjes in een 96-wells-plaat op 5 x 10,3 cellen per putje met 50 µL van groeimedium in elk putje, pre 's nachts geïncubeerd en vervolgens behandeld met gefitinib bij de aangegeven concentraties gedurende 72 uur. Een MTT-assay werd uitgevoerd en de OD570 werd gemeten door een microplate-lezer. De IC50 waarde was 0.048 ± 0,01 µM. gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM voor 6 putten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: PC-9MET1000 cellen tentoongesteld weerstand tegen gefitinib, maar behandeling met PHA665752 in aanwezigheid van 1 µM van gefitinib onderdrukt zijn proliferatie.
(A) PC-9 en MET1000 cellen werden zaadjes in 96-wells-platen op 5 x 10,3 cellen per putje met 50 µL van groei gemiddeld in elk goed, pre 's nachts geïncubeerd en vervolgens behandeld met gefitinib bij de aangegeven concentraties voor 72 h. (B) MET1000 cellen werden zaadjes in een 96-wells-plaat op 5 x 10,3 cellen per putje met 50 µL van het groeimedium in elk putje , pre 's nachts geïncubeerd en vervolgens behandeld met PHA665752 bij de aangegeven concentraties in de aanwezigheid of afwezigheid van 1 µM van gefitinib gedurende 72 uur. Een MTT-assay werd uitgevoerd en de OD570 werd gemeten door een microplate-lezer. De waarde50 IC in aanwezigheid van gefitinib was 0.014 ± 0,01 µM, terwijl dat bij het uitblijven van gefitinib was niet bepaald. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM voor 6 putten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Versterking van de BMO werd waargenomen in PC-9MET1000 en PC-9 DR cellen met geen verworven mutaties in EGFR en BMO.
(A) expressie niveaus van fosfor-BMO en totale BMO door westelijke vlekkenanalyse werden bepaald. Β-actine werd gebruikt als een besturingselement laden. (B) mRNA afschriften van PC-9, PC-9MET1000, en PC-9 DR cellen werden gekwantificeerd met behulp van de RT-PCR in real time en genormaliseerd met die van GAPDH. Gegevens worden gepresenteerd ten opzichte van PC-9 waarden, zoals bedoel ± SEM (n = 8). Statistische significantie werd geschat aan de hand van de tweezijdige Student t-test en een p < 0.05 werd beschouwd als een statistisch significant. *, p < 0,05, vergeleken met de waarde van de PC-9. (C) Exon 19-21 van de EGFR-gen en exon 14-21 van de BMO-gen werden versterkt uit de genomic DNA door PCR. PCR producten werden vervolgens gezuiverd en geanalyseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: PC-9 DR cellen resistent zijn tegen PHA665752 in aanwezigheid van 1 µM van gefitinib.
DR cellen werden zaadjes in een 96-wells-plaat op 5 x 10,3 cellen per putje met 50 µL van groeimedium in elk putje, pre 's nachts geïncubeerd en vervolgens behandeld met PHA665752 bij de aangegeven concentraties in aanwezigheid van 1 µM van gefitinib gedurende 72 uur. Een MTT-assay werd uitgevoerd en de OD570 werd gemeten door een microplate-lezer. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM voor 6 putten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Anchorage-onafhankelijke proliferatie van PC-9MET1000 en PC-9 DR cellen op zachte agar in de aanwezigheid of afwezigheid van PHA665752 en gefitinib.
Cellen (1 × 104) opnieuw geschorst in 0,3% agar met 10% FBS werden zaadjes in 6-Wells-platen vooraf bedekt met 0,6% zachte agar. De volgende dag, cellen werden behandeld met gefitinib (1 µM) en PHA665752 (1 µM) en vervolgens gedurende 14-21 dagen worden geïncubeerd. Kolonies werden gekleurd met kristalviolet 0.005% voor 1 h. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt voor de oprichting van verworven dual-resistentie in kankercellen met behulp van een methode 2-step dosis-escalatie in vitro. Vele onderzoeksdocumenten hebben gemeld dat PC-9 cellen EGFR-TKI (gefitinib of erlotinib) weerstand door T790M EGFR mutaties15,16ontwikkeld. We hebben echter niet T790M mutaties detecteren in exon 20 van onze cellen PC-9MET1000 door directe het rangschikken (figuur 4C). Bovendien, MET versterking werd waargenomen op te treden als een bypass signalering traject. PC-9MET1000 cellen zijn dus uiterst zeldzaam. Eerder meldden wij dat Long adenocarcinoom PC-9 cellen herbergen een schrapping van de 15-bp in exon 19 van EGFR gefitinib-weerstand met BMO versterking ontwikkeld na continu stapsgewijze dosis-escalatie werd uitgevoerd voor 12 maanden de dosis tot 1 µM (benoemde cellen van de PC-9MET1000)-17. Deze cellijn was gevoelig voor een BMO-TKI in aanwezigheid van gefitinib. Om te bepalen van het mechanisme is erachter weerstand aan EGFR - en BMO-TKIs, werd een continue stapsgewijze dosis-escalatie-methode ontwikkeld om het induceren van dual-weerstand tegen BMO-TKI, PHA665752 en EGFR-TKI, gefitinib, in12cellen PC-9MET1000. Deze methode gebaseerd op de resultaten van een klinische proef te bestuderen van de progressie van de ziekte dan gefitinib behandeling. In het geval van BMO-versterkte EGFR-TKI-weerstand, een enkele BMO-remmer zou niet in staat de celproliferatie aanzienlijk te remmen. Omdat het signaaltransductie tussen de receptor en de "downstream" moleculen zijn gescheiden (EGFR-ERK1/2 en BMO-AKT), de gecombineerde onderdrukking van EGFR en BMO nodig zou zijn. In een andere Long adenocarcinoom cellijn, werd HCC827, die ook havens een EGFR mutatie, EGFR-TKI weerstand ontwikkeld door BMO versterking. Suda et al. rapporteerde dat de HCC827 cellen blootgesteld aan toenemende concentraties van erlotinib in aanwezigheid van BMO-TKI PHA665752 ontwikkeld weerstand tegen BMO-TKI en EGFR-TKI18. Bovendien, klinische proeven worden uitgevoerd om te bestuderen van gevallen van BMO-versterking met EGFR-TKI-weerstand. Dus, om te onderzoeken het mechanisme van verworven resistentie van de BMO-TKI na behandeling met EGFR-TKI, het noodzakelijk is voor een dual-weerstand tegen BMO-remmers en EGFR-remmers.
Het protocol beschreven hier betrokken stapsgewijze dosis-escalatie van een BMO-TKI, PHA665752, in aanwezigheid van 1 µM van gefitinib. De methode van de stapsgewijze dosis-escalatie is de meest betrouwbare en de meest gebruikte methode18,19. De meest kritische stap in dit protocol is het verkrijgen van de IC50 waarde van de Inhibitor van de omwenteling. Als deze waarde is niet nauwkeurig bepaald, mislukt de cellen om te groeien helemaal in de cultuur-schotel. Daarom, als de celgroei begint te vertragen, de toename van de concentratie van de Inhibitor van de omwenteling verminderen het probleem misschien oplossen. Bovendien, als de cellen sterven beginnen, het zou ideaal zijn voor het opslaan van de resterende cellen bij-80 ° C, om te hergebruiken in de vorige concentratie.
Een alternatieve methode voor de vaststelling van de weerstand in cellijnen is de hoge concentratie blootstelling methode, waarin de cellen worden blootgesteld aan de concentratie van de doelgroep van de Inhibitor van de omwenteling direct, en de cellen worden gekweekt tot de overlevende resistente cellen prolifererende beginnen. Hoewel deze methode meer klinisch relevant is, heeft een lagere slagingspercentage omdat de concentratie van de doelgroep van de Inhibitor van de omwenteling, die in eerste instantie wordt beheerd, kan onmiddellijk alle ouderlijke cellen doden. Interessant, werd er gemeld dat resistente sublijnen verkregen door middel van deze twee methoden verschillende cellulaire eigenschappen19,20 vertonen.
Een andere methode voor de vaststelling van de weerstand is de in vivo resistentie methode, waarin een celsuspensie (1.0 × 106-2.0 × 107) wordt geïnjecteerd in de flanken van de muizen, en wanneer de tumor een volume van 200 mm3 bereikt, de muizen zijn onderworpen aan continue behandeling met inhibitoren. Tumoren die volledig reageren en vervolgens terugkeren tijdens onderhouden therapie zijn geoogst, gehakt, verteerd met trypsine, gefilterd en ontpit op cultuur gerechten. Deze methode, kan hoewel enigszins ingewikkeld, effectief worden gebruikt in gevallen van antilichaam-resistentie. Echter wanneer de tumoren die aantonen dat resistentie bij het in-vivo -systeem worden overgebracht naar een in vitro systeem, de cellen soms niet groeien 2D cultuur systemen. Daarom moet de 3D cultuur systemen zoals een kelder membraan matrix gebruikte21.
Hoewel alle drie van deze methoden een relatief lang om uit te voeren vereist, is de methode van de stapsgewijze dosis-escalatie de zuinigste. Het is ook de meest geschikte methode voor duidelijk begrip en het bestuderen van het proces van het verwerven van de Inhibitor van de omwenteling-weerstand. Het slagingspercentage van de andere twee methoden is bovendien aanzienlijk lager dan die van de methode van de stapsgewijze dosis-escalatie.
Zodra het verzet is gevestigd, is het nodig om te testen de tumorigene potentie van deze cellijnen. Kolonie vorming proeven of in vivo transplantaties zijn vaak werkzaam voor dit doel (Figuur 6). Deze methoden kunnen het nadeel van het gebruik van 2D cultuur systemen overwonnen.
Een belangrijke beperking van deze methoden is dat cellen met verworven resistentie vaak niet nauwkeurig met de resistentie bij menselijke kankercellen overeen komen. Daarom moeten de mechanismen ontdekt door studies in in vitro modellen in menselijk weefselmonsters worden bevestigd door herhaalde tests in biopsie monsters. Bovendien, hoewel deze protocollen nuttig voor de behandeling van het mechanisme is erachter verworven resistentie tijdens de ontwikkeling van tumorcellen zou kunnen zijn, is het mogelijk dat de verworven resistentie werd veroorzaakt door veranderingen van de communicatie van de tumor. Dit is een andere ernstige beperking van het onderzoek naar de werkzaamheid van deze protocollen in alleen kankercellen. Het zou beter zijn te gebruiken van weefsels van menselijke weefselbanken, die beschikbaar voor veel onderzoekers zijn.
Het protocol hier gepresenteerd kan worden gewijzigd voor de vaststelling van de weerstand tegen andere moleculaire remmers ook. Daarom is deze methode nuttig kunnen zijn voor de ontwikkeling van therapeutische instrumenten om te bepalen in de toekomst kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Wij danken de leden van het Instituut voor moleculaire oncologie voor hun doordachte opmerkingen en nuttig advies, en Editage voor hun hulp bij het bewerken van de Engelse taal. Dit werk werd gesteund door het MEXT-ondersteunde programma voor de strategische Research Foundation aan particuliere universiteiten (2012-2016) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan. Tohru Ohmori ontvangen onderzoek (2015-2016) financiering van Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Duitsland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
