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Cancer Research

Établissant double résistance à l’EGFR-TKI et rencontré-TKI dans le poumon adénocarcinome cellules In Vitro avec une procédure d’augmentation de la Dose 2-step

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55967
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Institute of Molecular Oncology, Showa University, 2Center for Biotechnology, Showa University

Summary

On décrit une méthode in vitro pour l’établissement de double résistance à l’EGFR-TKI et un MET-TKI dans les cellules cancéreuses. Cette méthode est utile pour développer des traitements pour les patients présentant des mutations-EGFR, qui montrent la progression de la maladie malgré un traitement EGFR-TKI avec MET-amplification. Il peut également être modifiée pour inhibiteurs ciblant d’autres molécules.

Abstract

La résistance aux médicaments est un défi majeur dans le traitement du cancer. La génération de sous-lignées résistant in vitro est nécessaire pour découvrir de nouveaux mécanismes pour relever ce défi. Ici, une méthode de doses 2 étapes progressives pour établir la double résistance à un récepteur de facteur de croissance épidermique (EGFR)-inhibiteur de tyrosine kinase (TKI), géfitinib et un MET-TKI, PHA665752, est décrite. Cette méthode est basée sur la simple augmentation de la dose progressive des inhibiteurs pour induire acquis une résistance dans des lignées cellulaires. L’autre méthode pour générer des résistantes sous-lignées consiste à exposer les cellules à de fortes concentrations de l’inhibiteur en une seule étape. La méthode d’augmentation progressive de la dose a une plus grande possibilité d’induire avec succès acquis une résistance à cette méthode. Activation d’EGFR mutations sont biomarqueurs d’une réponse au traitement par EGFR-TKI, qui est un traitement de première intention appliqué pour les cancers du poumon non à petites cellules (NSCLC) qui hébergent ces mutations. Cependant, malgré les rapports des réponses efficaces, l’utilisation de l’EGFR-TKI est limitée parce que les tumeurs inévitablement acquièrent la résistance. Les principaux mécanismes derrière la résistance de l’EGFR-TKI comprennent une mutation secondaire sur le site de portier, T790M dans l’exon 20 de l’EGFR et un signal de contournement d’Emu. Ainsi, une solution possible à ce problème serait une combinaison d’EGFR-TKI et MET-TKI. Ce traitement combiné a été montré pour être efficace dans un modèle d’étude in vitro . Géfitinib-résistance acquise a été créée par MET-amplification par augmentation de la dose progressive du géfitinib pendant 12 mois, et une lignée de cellules appelée PC-9MET1000 a été générée dans une étude antérieure. Afin d’étudier les mécanismes de MET-TKI acquis et EGFR-TKI résistance, un MET-TKI, PHA665752, a été administrée à ces cellules avec augmentation de la dose par étapes en présence de géfitinib pendant 12 mois. Ce protocole a également été appliqué avec succès pour un certain nombre de thérapies combinées pour établir une résistance acquise aux autres molécules.

Introduction

Oncogènes mutations dans le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sont trouvent dans un sous-groupe de patients avec un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) et sont des biomarqueurs prédictifs importants de cette maladie1,2. Ces activant les mutations EGFR plus souvent se produisent comme une délétion dans le cadre dans l’exon 19 (delE746-A750) ou une mutation ponctuelle remplacement leucine avec arginine au codon 858 de l’exon 21 (L858R) à l’EGFR tyrosine kinase domaine3,4. Traitement avec des inhibiteurs EGFR tyrosine kinase (inhibiteurs) est une thérapie efficace sur le plan clinique pour les patients atteints de CBNPC hébergeant des mutations EGFR. Toutefois, cette thérapie est limitée par l’inévitable acquisition de résistance aux inhibiteurs EGFR tels que le géfitinib et l’erlotinib. L’acquisition de la résistance la plus courante se fait par une mutation de T790M secondaire dans l’exon 20 de l’EGFR, ce qui a été détectée chez environ 60 % des patients ayant acquis une résistance (géfitinib ou erlotinib) de EGFR-TKI. Autres mécanismes moléculaires associés à une résistance acquise aux inhibiteurs EGFR sont activation de dérivation signalisation causée par une amplification MET, transformation des cancers du poumon à petites cellules et la transition épithéliale-mésenchymateuse5,6. Le récepteur pour le facteur de croissance des hépatocytes, codé par le gène MET, qui est dysregulatedin plusieurs tumeurs, a été rapporté pour être un candidat important pour ciblé les thérapies7,8.

Stratégies pour surmonter la résistance acquise aux inhibiteurs EGFR sont actuellement l’objet d’une évaluation clinique. Études précliniques et cliniques ont montré que les inhibiteurs d’EGFR de troisième génération tels qu’osimertinib sont efficaces pour les patients ayant la mutation de T790M9. En outre, la croissance des cancers EGFR-mutant avec amplification MET peut être inhibée par un traitement combiné avec INHIBITEURS EGFR - et MET6,10. Les essais cliniques évaluant une combinaison des inhibiteurs de la MET et l’EGFR chez les patients avec une résistance acquise aux géfitinib et l’erlotinib sont en cours maintenant11.

Pour étudier le mécanisme moléculaire de la résistance acquise aux agents chimiothérapeutiques, lignées cellulaires initialement aux inhibiteurs sont traitées en continu avec ces inhibiteurs. Deux méthodes sont disponibles pour établir une résistance acquise dans des lignées cellulaires. L’un est augmentation progressive de la dose, et l’autre est forte concentration exposition. La méthode d’escalade par étapes a été plus couramment utilisée, parce qu’il a un taux de réussite plus élevé. Les cellules sont d’abord exposées à de faibles concentrations des inhibiteurs, près d’un dixième de la valeur maximale de concentration inhibitrice (ci50), et la concentration est ensuite graduellement a augmenté de 10 à 30 % jusqu'à ce que la concentration de la cible est atteinte. La méthode forte concentration exposition consiste à exposer les cellules à la dernière dose d’inhibiteur dans le milieu de culture, qui est plus que la valeur50 , alors les cellules parentales sont presque complètement tués. Cette méthode d’exposition forte concentration a beaucoup un plus faible taux de réussite que la méthode d’escalade par étapes.

Dans une étude antérieure, c’est un traitement combiné avec EGFR-TKI et MET-TKI qui s’est avéré efficace dans un système in vitro . La résistance acquise à un EFGR-TKI, gefitinib, a été créée par une escalade progressive pendant 12 mois, ainsi que de MET-amplification, et par conséquent, une lignée de cellules géfitinib résistant appelée PC-9MET1000 a été généré12.

Le protocole présenté ici est une procédure de doses progressives en deux étapes pour l’obtention de muté EGFR NSCLC PC-9 cellules avec une double résistance à l’EGFR-TKI géfitinib et un MET-TKI, PHA665752 (Figure 1). Cette méthode d’établissement acquis résistant dans les lignées cellulaires est relativement facile à réaliser, avec un taux de réussite élevé. Le protocole décrit peut être modifié pour usage avec les inhibiteurs d’autres médicaments de la cible moléculaire et aussi bien des agents cytotoxiques.

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Protocol

1. établir des cellules résistantes au Gefitinib

  1. Déterminer la concentration initiale géfitinib par dosage de bromure (MTT) diphenyltetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-.
    1. PC-9 cellules dans le milieu de culture (milieu RPMI 1640 10 % SVF et 1 % des antibiotiques (pénicilline : 100 U/mL et la streptomycine : 100 µg/mL)), dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.
    2. Ajuster les cellules à 1,0 × 105 cellules/mL en utilisant une cellule automatisée contrer (voir Table des matières) et graine 50 µL de cela dans chaque puits d’une plaque de 96 puits en utilisant le milieu de croissance ; la concentration finale des cellules doit être de 5,0 × 103 cellules par puits.
    3. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C.
    4. Ajouter 50 µL de gefitinib (en 2 X concentration finale) à différentes concentrations : 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0.2, 0.6, 2, 6 et 20 µM à ces puits tels que le volume final de chacun est bien de 100 µL.
    5. Incuber les plaques pendant 72 h à 37 ° C.
    6. Ajouter 15 µL de la solution de colorant (voir Table des matières) dans chaque puits (utilisation finale 13 % concentration de la solution de colorant) et incuber pendant 4 heures à 37 ° C.
    7. Ajouter 100 µL de la solution de solubilisation/stop (voir Table des matières) pour solubiliser le formazan produites par la solution de colorant (voir Table des matières) dans chaque bien et il incuber une nuit à 37 ° C.
    8. Mesurer la densité optique à 570 nm (OD570) en utilisant un lecteur de microplaques pour obtenir la valeur50 en générant une courbe de la prolifération cellulaire.
    9. Utilisez un logiciel de statistique (voir Table des matières) pour afficher les données graphiquement et calculer la valeur50 (Figure 2).
    10. Préparer les 6-12 répétitions et répéter les expériences au moins trois fois.
  2. Continu par étapes-augmentation des doses de gefitinib pour le traitement de la PC-9 cellules.
    1. Cellules de culture de PC-9 (1 mL en état Sub confluente) dans les plats de p100 avec 10 mL de milieu de culture dans un incubateur à2 CO 5 % à 37 ° C.
    2. Ajouter un dixième de la valeur50 de géfitinib dans le plat de p100.
      1. Lorsque les cellules dans le milieu de culture deviennent Sub confluentes, ajouter 1 à 2 mL de cellules à 10 mL de milieu de croissance fraîche à l’aide d’une pipette de 1mL avec une concentration plus élevée de 10 à 30 % de géfitinib dans les mêmes conditions de culture.
    3. Augmenter la concentration de géfitinib progressivement de 10 à 30 % à chaque division, jusqu'à ce qu’il atteigne 1 µM ; Cela peut prendre environ 6 à 12 mois.
      Remarque : Lorsque la concentration de géfitinib atteint la valeur50 , la prolifération des cellules devient considérablement plus lente, et donc, 2 à 4 mL de cellules peuvent être ajouté jusqu'à 10 mL de milieu de croissance fraîche avec une concentration plus élevée de géfitinib ; réduire l’augmentation de la concentration du géfitinib pourrait résoudre le problème. En outre, il serait idéal pour stocker les cellules restantes à-80 ° C et les réutiliser à la concentration de la précédente. Comme PC-9 cellules sont en suspension, il est inutile d’utiliser la trypsine pour passage ; Toutefois, pendant le processus d’augmentation de la concentration de géfitinib, les cellules peuvent s’attacher à la partie inférieure de la boîte de Pétri. Dans une telle situation, un grattoir de cellules peut être utilisé pour détacher les cellules adhérentes.
    4. Cellules de culture le géfitinib résistant PC-9 dans le milieu avec 1 µM du géfitinib.
    5. Effectuer l’analyse de MTT pour confirmer la géfitinib-résistance des cellules13; ces cellules résistantes au gefitinib ont été nommés PC-9MET1000 (désigné comme cellules de MET1000), parce qu’ils ont montré une augmentation des protéines et niveaux d’ARN d’EMU (Figure 3 a, Figure 4 a, B).

2. établir des double-résistance au Gefitinib et PHA665752

  1. Déterminer la concentration initiale de PHA665752 par test MTT.
    1. Cellules de culture de la MET1000 dans les plats de p100 avec 10 mL de milieu de croissance et 1 µM géfitinib dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.
    2. Les cellules des graines dans une plaque à 96 puits à 5,0 × 103 cellules/puits avec 50 µL de milieu de croissance dans chaque puits. Ajuster la concentration finale des cellules à 1,0 × 105 cellules/mL à l’aide d’une cellule automatisée counter (voir Table des matières).
    3. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C.
    4. Ajouter 50 µL de PHA665752, un MET-TKI (en 2 X concentration finale), les cellules en différentes concentrations : 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0.2, 0.6, 2, 6 et 20 µM dont 2 µM gefitinib (à 2 X concentration finale) ; le volume final de chaque puits devrait être de 100 µL.
    5. Incuber les plaques pendant 72 h à 37 ° C.
    6. Ajouter 15 µL de la solution de colorant (voir Table des matières) à chaque puits et incuber pendant 4 h à 37 ° C.
    7. Ajouter 100 µL de la Solution de solubilisation/stop pour solubiliser le formazan produites par la solution de colorant (voir Table des matières) pour chaque bien et à nouveau incuber une nuit à 37 ° C.
    8. Mesurer la densité optique à 570 nm (OD570) en utilisant un lecteur de microplaques pour obtenir la valeur50 en générant une courbe de la prolifération cellulaire.
    9. Utilisez un logiciel de statistique (voir Table des matières) pour afficher les données graphiquement et calculer la valeur de50 IC de PHA665752 en présence de gefitinib (Figure 3 b).
    10. Préparer les 6-12 répétitions et répéter les expériences au moins trois fois.
  2. Établir la double-résistance dans les cellules MET1000 géfitinib et PHA665752.
    1. Des cellules de culture de la MET1000 dans les plats de p100 avec 10 mL de milieu de croissance et 1 µM géfitinib dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.
    2. Ajouter un dixième de la valeur de50 IC de PHA665752 dans le milieu de croissance en présence de 1 µM de géfitinib avec les mêmes conditions de culture.
    3. Augmenter progressivement la concentration PHA665752 de 10 à 30 % avec chaque split jusqu'à ce qu’il atteigne 1 µM. Cela peut prendre environ 6 à 12 mois.
      Remarque : Lorsque la concentration de PHA665752 atteint la valeur50 , la prolifération des cellules devient considérablement plus lente, et donc, 2 à 4 ml de cellules peut être ajoutée à l’aide d’une pipette de 1 mL à 10 mL de milieu de croissance fraîche avec une concentration plus élevée de PHA665752 ; réduire l’augmentation de la concentration de PHA665752 pourrait résoudre le problème. En outre, il serait idéal pour stocker les cellules restantes à-80 ° C et les réutiliser à la concentration de la précédente. Il est inutile d’utiliser la trypsine pour passage ; Cependant, au cours de l’augmentation de la concentration de PHA665752, les cellules peuvent s’attacher à la partie inférieure de la boîte de Petri. Dans de telles situations, un grattoir de cellules peut être utilisé pour détacher les cellules.
    4. Enfin, des cellules de culture le PC-9 résistants à la fois géfitinib et PHA665752 dans le milieu avec 1 µM de géfitinib et PHA665752 dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.
    5. Effectuer l’analyse de MTT pour confirmer que les cellules sont double-résistants au gefitinib et PHA66575213, et qu’ils ne sont pas sensibles à la PHA665752 en présence de géfitinib ; ces cellules dual-résistance ont été nommés PC-9 DR (désigné comme DR cellules) (Figure 5).

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Representative Results

La vue d’ensemble du protocole présenté dans ce manuscrit est montré dans la Figure 1, y compris l’induction de la double-résistance acquise au gefitinib et PHA665752 en PC-9 cellules par une procédure d’augmentation de la dose 2-step. La figure 2 montre une diminution de la prolifération des cellules parentales de PC-9 comme la concentration augmente du géfitinib. Ceci indique que les cellules du PC-9 est devenu sensibles au gefitinib après que la procédure d’augmentation de la dose a été réalisée. La figure 3 montre que les cellules de PC-9MET1000 pièce de résistance au gefitinib, mais sont sensibles à un MET-TKI, PHA665752, en présence du géfitinib. La prolifération de cellules de PC-9 a été supprimée des concentrations plus élevées de gefitinib, indiquant qu’ils étaient sensibles au gefitinib. Cependant, PC-9MET1000 cellules ne montrent pas de diminution de la prolifération même à des concentrations élevées de gefitinib, indiquant qu’ils avaient acquis la résistance au gefitinib. Lorsque le PC-9MET100 cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes de PHA665752 en présence ou en absence de géfitinib pendant 72 h, sa prolifération, telle que mesurée par un test MTT, diminue significativement. Il y avait aussi une diminution modeste de la prolifération des cellules du PC-9MET1000 en l’absence du géfitinib. Ainsi, une combinaison de géfitinib et PHA665752 supprimerait la prolifération cellulaire plus efficacement qu’un traitement avec PHA665752 seul.

La figure 4 montre des niveaux amplifiés d’EMU (les protéines et l’ARN) dans les cellules 9MET1000-PC et PC-9 DR ; aucune mutation acquise n’est présentes dans l’EGFR et MET. Par conséquent, l’émergence de la signalisation de déviation est fortement suggéré comme cause de la résistance acquise à l’EGFR-TKI et/ou MET-TKI. La figure 5 illustre la résistance des cellules du PC-9 DR à PHA665752 en présence de 1 µM de gefitinib, telle que mesurée par un test MTT. Bien que la prolifération des cellules du PC-9MET1000 ont été inhibées par traitement avec géfitinib et PHA665752, PC-9 DR cellules survécurent le traitement, indiquant qu’ils étaient double résistance à géfitinib et PHA665752. Ainsi, grâce à une procédure d’augmentation de la dose 2-step, PC-9 cellules acquis une résistance au gefitinib et PC-9MET1000 cellules acquis une résistance à PHA665752 en présence de 1 µM du géfitinib. Figure 6 montre la prolifération d’ancrage indépendant de MET1000 et DR cellules en gélose molle en présence ou en absence de PHA665752 et le géfitinib. La croissance des cellules 9MET1000-PC et PC-9 DR ont été observées sur l’agar mou, ce qui indique que ces sous-lignées pourraient croître dans les systèmes en 2D ou en 3D. Ainsi, les résistantes sous-lignées avaient surmonté la limitation de ne pas être capables de se multiplier dans les systèmes 2D. En outre, DR PC-9 cellules, mais pas les cellules PC-9MET1000, pourraient se développer dans une gélose avec 1 µM de géfitinib et PHA665752. Ce résultat indique que les cellules de PC-9 DR résistaient à la fois géfitinib et PHA665752 et pourraient se développer dans un système de culture 3D aussi bien. La propriété tumorigène des sous-lignées résistantes établies doit être vérifiée par un test de formation de colonie ou par in vivo transplantation14.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de production double résistance : DR PC-9 cellules de PC-9 cellules.
Schéma pour générer des clones résistants-double de PC-9 cellules par une procédure d’augmentation de la dose 2-step. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : EGFR-TKI géfitinib inhibe la prolifération des cellules du PC-9.
PC-9 cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à 5 x 103 cellules/puits avec 50 µL de milieu de culture dans chaque puits, préalablement incubées pendant la nuit et ensuite traitée avec géfitinib aux concentrations indiquées pendant 72 h. Un test MTT a été réalisé et l' OD570 a été mesurée par un lecteur de microplaques. L’IC50 se chiffrait à 0,048 ± 0,01 µM. les données sont présentées comme la moyenne ± SEM pour 6 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : PC-9MET1000 cellules ont montré la résistance au gefitinib, mais le traitement par PHA665752 en présence de 1 µM de géfitinib supprimée sa prolifération.
(A) PC-9 et MET1000 des cellules ont été ensemencées en plaques 96 puits à 5 x 103 cellules/puits avec 50 µL de croissance moyen dans chaque bien, préalablement incubées pendant la nuit et ensuite traitée avec géfitinib aux concentrations indiquées pendant 72 h. MET1000 (B) les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à 5 x 103 cellules/puits avec 50 µL de milieu de croissance dans chaque puits , préalablement incubées pendant la nuit et ensuite traitée avec PHA665752 aux concentrations indiquées en présence ou en absence de 1 µM de géfitinib pendant 72 h. Un test MTT a été réalisé et l' OD570 a été mesurée par un lecteur de microplaques. L’IC50 en présence de géfitinib se chiffrait à 0,014 ± 0,01 µM, alors que qu’en l’absence du géfitinib n’était pas déterminée. Les données apparaissent comme la moyenne ± SEM pour 6 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Amplification MET a été observée dans les cellules 9MET1000-PC et PC-9 DR avec aucun acquises mutations EGFR et MET.
Expression (A) des niveaux de phosphore-MET et total MET ont été déterminés par l’analyse par Western blot. Β-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement. (B) mRNA transcriptions de cellules PC-9, 9MET1000-PC et PC-9 DR ont été quantifiées à l’aide de RT-PCR en temps réel et normalisées avec celle de GAPDH. Les données sont présentées par rapport aux valeurs de PC-9, comme moyenne ± SEM (n = 8). Signification statistique a été estimée à l’aide de la Student bilatéral t-test et un p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. *, p < 0,05, comparée à la valeur de PC-9. (C) Exon 19-21 du gène EGFR et 14-21 d’exon du gène Met ont été amplifiés de l’ADN génomique par PCR. Produits PCR ont été ensuite purifiés et analysées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : DR PC-9 cellules sont résistantes à la PHA665752 en présence de 1 µM du géfitinib.
DR de cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à 5 x 103 cellules/puits avec 50 µL de milieu de culture dans chaque puits, préalablement incubées pendant la nuit et ensuite traitée avec PHA665752 aux concentrations indiquées en présence de 1 µM de géfitinib pendant 72 h. Un test MTT a été réalisé et l' OD570 a été mesurée par un lecteur de microplaques. Les données apparaissent comme la moyenne ± SEM pour 6 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: prolifération d’ancrage indépendant de cellules 9MET1000-PC et PC-9 DR sur une gélose molle en présence ou en absence de PHA665752 et le géfitinib.
Cellules (1 × 10,4) remis en suspension dans 0.3 % agar avec 10 % de que BF ont été ensemencées en plaques 6 puits revêtus avec 0,6 % d’agar mou. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec le géfitinib (1 µM) et PHA665752 (1 µM) et puis incubé pendant 14 à 21 jours. Colonies ont été colorées avec 0,005 % cristal violet pendant 1 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole décrit ici peut être utilisé pour la mise en place de double-résistance acquise dans les cellules cancéreuses à l’aide d’une augmentation de la dose 2-step méthode in vitro. De nombreux travaux de recherche ont rapporté que PC-9 cellules développé EGFR-TKI (géfitinib ou erlotinib) résistance à T790M EGFR mutations15,16. Cependant, on n’a pas détecté les mutations T790M dans l’exon 20 de nos cellules de PC-9MET1000 par séquençage direct (Figure 4). Par ailleurs, MET l’amplification a été observée à agir comme une voie de signalisation de voie de contournement. Ainsi, les cellules de PC-9MET1000 sont extrêmement rares. Nous avons déjà indiqué que poumon adénocarcinome PC-9 cellules ayant une délétion 15-PB dans l’exon 19 de l’EGFR développé géfitinib-résistance avec amplification MET après que augmentation de la dose progressive continue a été réalisée pendant 12 mois, jusqu'à ce que la dose atteint 1 µM (appelé PC-9MET1000 cellules)17. Cette lignée cellulaire était sensible à un MET-TKI en présence du géfitinib. Afin de déterminer le mécanisme derrière la résistance aux inhibiteurs EGFR et MET, une méthode d’augmentation de la dose progressive continue a été développée pour induire la double résistance à MET-TKI, PHA665752 et EGFR-TKI, gefitinib, PC-9MET1000 cellules12. Cette méthode s’appuie sur les résultats d’un essai clinique pour étudier la progression de la maladie au-delà de traitement du géfitinib. Dans le cas de MET-amplifié EGFR-TKI-résistance, un seul inhibiteur MET n’empêcherait pas significativement la prolifération cellulaire. Parce que la transduction du signal entre le receveur et l’aval des molécules sont séparées (EGFR-ERK1/2 et MET-AKT), la répression combinée d’EGFR et MET seraient nécessaire. Dans une autre lignée cellulaire un adénocarcinome pulmonaire, HCC827, qui abrite également une mutation de l’EGFR, la résistance de l’EGFR-TKI a été développé grâce à l’amplification de la MET. Suda et coll. ont signalé que HCC827 cellules exposées à des concentrations croissantes d’erlotinib en présence de la résistance de MET-TKI PHA665752 développé à MET-TKI et EGFR-TKI18. En outre, les essais cliniques sont en cours pour étudier les cas de MET-amplification avec EGFR-TKI-résistance. Ainsi, pour étudier le mécanisme de résistance MET-TKI acquise après le traitement avec l’EGFR-TKI, il est nécessaire induire la double-résistance aux inhibiteurs de la MET et inhibiteurs de l’EGFR.

Le protocole décrit ici impliqués par étapes-augmentation des doses d’un TKI-MET, PHA665752, en présence de 1 µM du géfitinib. La méthode d’augmentation progressive de la dose est la plus fiable et la méthode la plus couramment utilisée18,19. L’étape la plus critique dans le présent protocole est d’obtenir la valeur50 de l’inhibiteur. Si cette valeur n’est pas déterminée avec précision, les cellules échouera à cultiver du tout dans la boîte de Pétri. Par conséquent, si la croissance cellulaire commence à ralentir, réduire l’augmentation de la concentration de l’inhibiteur pourrait résoudre le problème. En outre, si les cellules commencent à mourir, il serait idéal pour stocker les cellules restantes à-80 ° C, pour les réutiliser à la concentration de la précédente.

Une autre méthode pour établir la résistance dans des lignées cellulaires est la méthode d’exposition forte concentration, dans lequel les cellules sont exposées à la concentration de la cible de l’inhibiteur directement, et les cellules sont cultivées jusqu'à ce que les cellules survivantes résistantes commencent à proliférer. Bien que cette méthode soit plus cliniquement pertinente, il a un taux de réussite plus faible parce que la concentration de la cible de l’inhibiteur, qui est administrée initialement, pourrait tuer toutes les cellules parentales immédiatement. Fait intéressant, il a été signalé que sous-lignées résistantes obtenues par le biais de ces deux méthodes présentent différentes propriétés cellulaires19,20.

Une autre méthode pour établir la résistance est la méthode de résistance in vivo , dans lequel une suspension de cellules (1,0 × 10-62.0 × 107) est injectée dans les flancs de la souris, et lorsque la tumeur atteint un volume de 200 mm3, les souris sont objet de continue un traitement avec des inhibiteurs. Les tumeurs qui répondent complètement et ensuite se reproduisent au cours maintient thérapie sont récoltés, hachées, digestion par la trypsine, puis filtré et ensemencées sur Pétri. Cette méthode, bien que quelque peu compliquée, peut être utilisée efficacement en cas d’anticorps-résistance. Cependant, quand les tumeurs qui montrent la résistance dans le système in vivo sont transférés vers un système in vitro , les cellules parfois ne pas développer des systèmes de culture 2D. Systèmes de culture 3D comme une matrice de la membrane basale devraient donc être utilisé21.

Bien que tous les trois de ces méthodes nécessitent un temps relativement long pour effectuer, la méthode d’augmentation progressive de la dose est le plus économique. C’est aussi la méthode la plus appropriée pour clairement comprendre et étudier le processus d’acquisition de résistance aux inhibiteurs. En outre, le taux de réussite des deux autres méthodes est sensiblement inférieur à celui de la méthode d’augmentation progressive de la dose.

Dès que la résistance est établie, il est nécessaire de tester le tumorigène de ces lignées cellulaires. Tests de formation de colonie ou in vivo de la transplantation est souvent employée à cet effet (Figure 6). Ces méthodes pourraient surmonter l’inconvénient d’utiliser des systèmes de culture 2D.

Une limitation majeure de ces méthodes est que les cellules avec résistance acquise souvent ne reflètent pas la résistance des cellules cancéreuses humaines. Par conséquent, les mécanismes découverts grâce à des études sur des modèles in vitro doivent être confirmées dans les échantillons de tissus humains à travers des essais répétés dans des échantillons de biopsie. En outre, bien que ces protocoles pourraient être utiles pour étudier le mécanisme derrière la résistance acquise lors du développement des cellules tumorales, il est possible que la résistance acquise est induite par des altérations du microenvironnement tumoral. Il s’agit d’une autre limitation sérieuse d’enquêter sur l’efficacité de ces protocoles en seulement les cellules cancéreuses. Il serait préférable d’utiliser des tissus auprès des banques de tissus humains, qui sont disponibles pour de nombreux chercheurs.

Le protocole présenté ici peut être modifié pour l’établissement de résistance aux autres inhibiteurs moléculaires ainsi. Donc, cette méthode peut être utile pour le développement d’outils thérapeutiques pour la lutte contre le cancer dans l’avenir.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions les membres de l’Institut d’oncologie moléculaire pour leurs commentaires judicieux et de bons conseils et Editage pour leur aide avec l’édition de langue anglaise. Ce travail a été soutenu par le programme MEXT-prise en charge pour la Fondation de recherche stratégique dans les universités privées (2012-2016) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon. Tohru Ohmori a reçu (2015-2016) de financement de la recherche de Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Allemagne).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 Wako 189-02025 with L-Glutamine and Phenol Red
CellTiter 96 Promega G4100 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
FBS gibco 26140-079
Pen Strep gibco 15140-163
gefitinib Selleck S1025 stocked 10 mM/EMSO at -20ºC
PHA665752 Selleck S1070 stocked 10 mM/EMSO at -20ºC
96-well plate IWAKI 860-096 flat bottom with lid, low evaporation type
TC10 Automated Cell Counter BIO RAD #1450010
CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Promega G4100 Dye Solution and Solubilization/Stop Solution
Powerscan HT microplate reader BioTek
GraphPad Prism v.5.0 software GraphPad Inc.
PC-9 Riken BioResource Center RCB4455
P100 dish FALCON 353003

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References

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Acquises dans la recherche sur le cancer numéro 126 cancer du poumon dual-résistance EGFR-TKI MET-TKI cellules d’adénocarcinome PC-9 poumon augmentation des doses par étapes
Établissant double résistance à l’EGFR-TKI et rencontré-TKI dans le poumon adénocarcinome cellules <em>In Vitro</em> avec une procédure d’augmentation de la Dose 2-step
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Yamaoka, T., Ohba, M., Arata, S.,… More

Yamaoka, T., Ohba, M., Arata, S., Ohmori, T. Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure. J. Vis. Exp. (126), e55967, doi:10.3791/55967 (2017).

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