Summary
מתוארת שיטה במבחנה להקמת התנגדות כפול של EGFR-TKI ו- MET-TKI בתאים סרטניים. שיטה זו שימושית לפיתוח טיפולים עבור חולים עם EGFR-מוטציות, אשר מוצג התקדמות המחלה למרות הטיפול EGFR-TKI עם MET-הגברה. זה גם יכול להיות שונה עבור מעכבי מיקוד מולקולות אחרות.
Abstract
עמידות לתרופות היא אתגר גדול בטיפול בסרטן. הדור של sublines עמיד במבחנה הכרחי לגילוי מנגנונים חדשניים כדי להתגבר על האתגר הזה. הנה, שיטה 2-צעד המינון להקמת כפול-ההתנגדות קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR)-מעכב טירוזין קינאז (TKI), אירסה, MET TKI, PHA665752, מתואר. שיטה זו מבוססת על פשוט stepwise המינון של מעכבי להשראת רכשה עמידות שורות תאים. השיטה החלופית ליצירת sublines עמיד כרוך חשיפת התאים ריכוזים גבוהים של המדכא בצעד אחד. לשיטה stepwise המינון גבוה יותר לאפשרות של גרימת בהצלחה רכשה התנגדות מאשר בשיטה זו. הפעלת EGFR מוטציות הם סמנים ביולוגיים של תגובה לטיפול עם EGFR-TKI, אשר הוא טיפול השורה הראשונה שימושית עבור סרטן ריאה מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) זה הנמל מוטציות אלה. למרות דיווחים על תגובות אפקטיביות, השימוש של EGFR-TKI זאת, מוגבלת כי גידולים באופן בלתי נמנע לרכוש התנגדות. המנגנונים העיקריים מאחורי ההתנגדות EGFR-TKI כוללים מוטציה משני-האתר שומר הסף, T790M ב אקסון 20 של EGFR ו אות מעקף של המטרופוליטן. לכן, פתרון אפשרי לבעיה זו יהיה שילוב של EGFR-TKI MET-TKI. טיפול משולב זה הוכח כיעיל במודל במחקר במבחנה . אירסה-ההתנגדות רכשה הוקמה באמצעות MET-הגברה מאת stepwise המינון של אירסה ל-12 חודשים, קו תא בשם PC-9MET1000 נוצר במחקר הקודם. להמשיך לחקור את המנגנונים של המטרופוליטן נרכשת-TKI ו- EGFR-TKI ההתנגדות, MET-TKI, PHA665752, היה מנוהל תאים אלה עם stepwise המינון בנוכחות אירסה ל-12 חודשים. פרוטוקול זה גם יושם בהצלחה במשך מספר טיפולים משולבים להקים ההתנגדות רכשה מולקולות אחרות מעכב.
Introduction
מוטציות oncogenic הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) מצויים תת-קבוצה של חולים עם סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC), חשוב סמנים ביולוגיים חזוי של1,זו מחלה2. אלה מפעיל EGFR מוטציות הנפוצות מתרחשות מחיקה במסגרת ב אקסון 19 (delE746-A750) או מוטציה החלפת לאוצין עם ארגינין-codon 858 של אקסון 21 (L858R) ב- EGFR טירוזין קינאז תחום3,4. טיפול עם מעכבי EGFR-טירוזין קינאז (TKIs) הוא טיפול יעיל קלינית בחולים עם NSCLC מחסה EGFR מוטציות. עם זאת, טיפול זה מוגבל על ידי רכישת התנגדות EGFR-TKIs כגון אירסה טרסבה בלתי נמנע. ההתנגדות רכשה הנפוץ ביותר מתרחשת דרך מוטציה T790M משנית ב אקסון 20 של EGFR, אשר זוהה כ- 60% של חולים אשר רכשה EGFR-TKI (אירסה או טרסבה) התנגדות. מנגנונים מולקולריים אחרים הקשורים עם ההתנגדות רכשה EGFR-TKIs הם הפעלה של מעקף איתות הנגרמת על ידי הגברה MET, טרנספורמציה של סרטן ריאות תא-קטן, ואת המעבר אפיתל-אל-mesenchymal5,6. הקולטן עבור הגורם צמיחה hepatocyte, מקודדת על ידי הגן MET, אשר היא dysregulatedin גידולים רבים, דווחה להיות מועמד חשוב עבור ממוקד טיפולים7,8.
אסטרטגיות להתגברות על ההתנגדות רכשה EGFR-TKIs עוברים עכשיו הערכה קלינית. קליניים וקליניים הראו כי מעכבי EGFR דור שלישי כגון osimertinib יעילים בחולים עם מוטציה T790M9. בנוסף, הצמיחה של סרטן EGFR-מוטציה עם הגברה MET יכול להיות מעוכבים על ידי טיפול בשילוב עם EGFR - ו MET-TKIs6,10. ניסויים קליניים להערכת שילוב של מעכבי MET ו- EGFR בחולים עם ההתנגדות רכשה אירסה, טרסבה הן בעיצומן כעת11.
ללמוד את המנגנון המולקולרי של ההתנגדות רכשה סוכנים כימותרפיות, שורות תאים המגיבות בתחילה מעכבי מטופלים באופן רציף עם מעכבי אלה. שתי שיטות זמינות להקים ההתנגדות רכשה תא שורות. אחד הוא המינון stepwise, והשני הוא חשיפה גבוהה-ריכוז. השיטה הסלמה stepwise כבר יותר בשימוש נפוץ, כי יש לו שיעור הצלחה גבוה יותר. התאים נחשפים לראשונה ריכוזים נמוכים של מעכבי, כמעט עשירית ערך הריכוז המעכב חצי-מקסימלי (IC50), ואת הריכוז ואז גדל בהדרגה על ידי 10-30% עד ריכוז המטרה מושגת. שיטת חשיפה גבוהה-ריכוז כרוך חשיפת התאים המנה הסופית של מעכב במדיום תרבות, וזה יותר מהערך50 IC, כך התאים הורים נהרגים כמעט לחלוטין. שיטה זו חשיפה גבוהה-ריכוז יש הרבה קצב נמוך יותר הצלחה מאשר השיטה stepwise הסלמה.
במחקר הקודם, טיפול משולב עם EGFR-TKI MET-TKI הוצגה יעיל במערכת במבחנה . ההתנגדות רכשה EFGR-TKI, אירסה, הוקמה דרך הסלמה stepwise למשך 12 חודשים, יחד עם MET-הגברה, והיה לכן, קו תא עמידים אירסה שנקרא PC-9MET1000 שנוצר12.
פרוטוקול המובאת כאן היא הליך המינון שני שלבים להשגת מוטציה-EGFR NSCLC PC-9 תאים עם התנגדות כפול EGFR-TKI אירסה, MET TKI, PHA665752 (איור 1). שיטה זו להקמת רכשה עמיד בשורות תא יחסית קל לביצוע, עם אחוזי הצלחה גבוהים. ניתן לשנות את הפרוטוקול המתואר ליישום עם מעכבי של אחרים סמים היעד מולקולרית, וכן ציטוטוקסיות סוכנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת תאים עמידים אירסה
- לקבוע את הריכוז אירסה הראשונית על ידי 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) וזמינותו.
- תרבות PC-9 תאים מדיום הגידול (RPMI-1640 בינוני עם 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה (פניצילין: 100 U/mL, סטרפטומיצין: µg 100/mL)), בחממה2 CO 5% ב 37 º C.
- התאם את התאים כדי 1.0 × 105 תאים למ"ל באמצעות תא אוטומטיות מונה (ראה טבלה של חומרים) זרע µL 50 זה ב כל טוב של צלחת 96-ובכן באמצעות מדיום הגידול; הריכוז הסופי של תאים צריך להיות 5.0 × 103 תאים/טוב.
- דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 º C.
- להוסיף 50 µL של אירסה (-2 X ריכוז סופי) בריכוזים שונים: 0 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, 20 מיקרומטר כדי הבארות הללו כה הסופי בכל היטב מתאימה 100 µL.
- דגירה את הצלחת. בשביל 72 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף µL 15 של הפתרון צבען (ראה טבלה של חומרים) כדי מכל קידוח (השימוש הסופי 13% ריכוז של הפתרון צבע), דגירה במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 100 µL של הפתרון solubilization/הפסק (ראה טבלה של חומרים) עבור solubilizing formazan המיוצר על ידי הפתרון צבען (ראה טבלה של חומרים) בכל טוב, דגירה אותו בן לילה ב 37 º C.
- למדוד את הצפיפות האופטית-570 nm (OD570) שימוש בקורא microplate להשגת הערך50 IC על ידי יצירת עיקול התפשטות תאים.
- השתמש תוכנה סטטיסטית (ראה טבלה של חומרים) כדי להציג את הנתונים באופן גרפי, ועל לחשב את הערך50 IC (איור 2).
- להכין 6-12 משכפל וחזור הניסויים לפחות שלוש פעמים.
- רציף stepwise המינון של אירסה לטיפול של PC-9 תאים.
- תרבות PC-9 תאים (1 מ"ל במצב תת confluent) במנות p100 עם 10 מ"ל של מדיום הגידול בתוך חממה2 CO 5% ב 37 º C.
- מוסיפים עשירית של הערך50 IC של אירסה לתוך המנה p100.
- כאשר התאים המדיום תרבות הופכים תת confluent, להוסיף 1-2 מ"ל של תאים 10 מ"ל של מדיום הגידול טריים באמצעות pipet 1-mL עם 10-30% ריכוז גבוה יותר של אירסה ב תרבות באותם התנאים.
- להעלות את ריכוז אירסה בהדרגה על ידי 10-30% עם כל פיצול עד שהוא מגיע 1 מיקרומטר; . זה עלול לקחת כ- 6-12 חודשים.
הערה: כאשר הריכוז של אירסה מגיע לערך50 IC, התפשטות תאים הופכת איטית במידה ניכרת, אז, 2-4 מ"ל של תאים עשויים להתווסף 10 מ"ל של מדיום הגידול טריים עם ריכוז גבוה יותר של אירסה; צמצום העלייה ברמת הריכוז של אירסה יפתור את הבעיה. יתר על כן, זה יהיה אידיאלי כדי לאחסן את התאים הנותרים ב-80 מעלות צלזיוס ולמחזר אותם-ריכוז הקודם. כפי PC-9 תאים ההשעיה, זה מיותר לשימוש טריפסין passaging; עם זאת, במהלך התהליך של הגדלת ריכוז אירסה, התאים רשאי לצרף לתחתית צלחת תרבות. במצב כזה, התא-המגרד יכול לשמש עבור ניתוק של תאים חסיד. - התרבות התאים PC-9 עמידים אירסה במצע הגידול עם 1 מיקרומטר של אירסה.
- לבצע את הבדיקה MTT לאשר אירסה-ההתנגדות של תאים13; אלו תאים עמידים אירסה היו בשם PC-9MET1000 (המיועד כתאים MET1000), כי הם הציגו חלבון מוגברת ורמות ה-RNA של המטרופוליטן (איור 3 א, איור 4A, B).
2. להקים כפול-ההתנגדות אירסה, PHA665752
- לקבוע את הריכוז ההתחלתי של PHA665752 מאת MTT וזמינותו.
- תרבות MET1000 התאים במנות p100 עם 10 מ"ל של מדיום הגידול, אירסה 1 מיקרומטר ב חממה2 CO 5% ב 37 º C.
- זרע התאים לתוך צלחת 96-ובכן × 10 5.03 תאים/טוב עם µL 50 של מדיום הגידול כל היטב. התאם את הריכוז הסופי של התאים 1.0 × 105 תאים למ"ל באמצעות תא אוטומטיות מונה (ראה טבלה של חומרים).
- דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 º C.
- להוסיף 50 µL של PHA665752, MET-TKI (בשעה 2 X ריכוז סופי), תאים ריכוזים שונים: 0 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, 20 מיקרומטר כולל 2 מיקרומטר אירסה (ב 2 X הסופי ריכוז); עוצמת הקול הסופי היטב כל צריך להיות 100 µL.
- דגירה את הצלחת. בשביל 72 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף µL 15 של הפתרון צבען (ראה טבלה של חומרים) כל טוב, ולאחר תקופת דגירה של 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 100 µL solubilization/עצירת פתרון עבור solubilizing formazan המיוצר על ידי הפתרון צבען (ראה טבלה של חומרים) כדי שכל אחד מהם טוב, ואני שוב דגירה בין לילה ב 37 º C.
- למדוד את הצפיפות האופטית-570 nm (OD570) שימוש בקורא microplate להשגת הערך50 IC על ידי יצירת עיקול התפשטות תאים.
- השתמש תוכנה סטטיסטית (ראה טבלה של חומרים) כדי להציג את הנתונים באופן גרפי, ועל לחשב את ערך50 IC של PHA665752 בנוכחות אירסה (איור 3B).
- להכין 6-12 משכפל וחזור הניסויים לפחות שלוש פעמים.
- להקים כפול-ההתנגדות בתאים MET1000 אירסה, PHA665752.
- תרבות MET1000 התאים במנות p100 עם 10 מ"ל של מדיום הגידול, אירסה 1 מיקרומטר ב חממה2 CO 5% ב 37 º C.
- מוסיפים עשירית של הערך50 IC של PHA665752 לתוך מדיום הגידול בנוכחות 1 מיקרומטר של אירסה עם תרבות באותם התנאים.
- להעלות את ריכוז PHA665752 בהדרגה על ידי 10-30% עם כל פיצול עד שהוא מגיע 1 מיקרומטר. . זה עלול לקחת כ- 6-12 חודשים.
הערה: כאשר הריכוז של PHA665752 מגיע לערך50 IC, התפשטות תא הופך איטית במידה ניכרת, ואת כל-כך, 2-4 מ"ל של תאים עשויים להתווסף באמצעות של pipet 1-mL 10 מ של מדיום הגידול טריים עם ריכוז גבוה יותר של PHA665752; צמצום העלייה ברמת הריכוז של PHA665752 עשויה לפתור את הבעיה. יתר על כן, זה יהיה אידיאלי כדי לאחסן את התאים הנותרים ב-80 מעלות צלזיוס ולמחזר אותם-ריכוז הקודם. . זה לא הכרחי לשימוש טריפסין passaging; עם זאת, במהלך העלייה של ריכוז PHA665752, התאים רשאי לצרף לתחתית של המנה תרבות. במצבים כאלה, התא-המגרד יכול לשמש כדי לנתק את התאים. - לבסוף, תרבות PC-9 תאים עמידים בפני אירסה והן PHA665752 במצע הגידול עם 1 מיקרומטר כל אירסה, PHA665752 בתוך חממה2 CO 5% ב 37 º C.
- לבצע את הבדיקה MTT כדי לאשר כי התאים נמצאים כפול-עמיד אירסה, PHA66575213, כי הם אינם רגישים PHA665752 בנוכחות אירסה; תאים אלה כפול-התנגדות היו בשם דוקטור PC-9 (המיועד כתאי ד ר) (איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה כללית של פרוטוקול שהוצגו בכתב יד זה מוצג איור 1כולל את אינדוקציה של כפול-ההתנגדות רכשה אירסה ו- PHA665752 PC-9 תאים לפי נוהל 2-צעד המינון. איור 2 מציג ירידה ההתפשטות של תאים PC-9 הורים כמו ריכוז אירסה בעליות. אפשרות זו מציינת כי התאים PC-9 הפך רגיש אירסה לאחר ההליך המינון בוצעה. איור 3 מראה כי תאים PC-9MET1000 להפגין התנגדות אירסה, אבל רגישים MET-TKI, PHA665752, בנוכחות אירסה. התפשטות תאים PC-9 דוכאה בריכוזים גבוהים של אירסה, המציין כי הם היו רגישים אירסה. עם זאת, תאים PC-9MET1000 לא הראה ירידה התפשטות אפילו בריכוזים גבוהים של אירסה, המציין כי הם רכשה התנגדות אירסה. כאשר תאים PC-9MET100 היו מטופלים עם הגדלת ריכוזי PHA665752 נוכחות או היעדרות של אירסה עבור 72 h, התפשטות שלה, כפי שהיא נמדדת על assay MTT, היה משמעותי ירד. היה שם גם ירידה צנועה ההתפשטות של תאים PC-9MET1000 בהיעדר אירסה. לפיכך, שילוב של אירסה PHA665752 לדכא התפשטות תאים באופן יעיל יותר מאשר הטיפול עם PHA665752 לבד.
איור 4 מראה רמות מוגבר של המטרופוליטן (גם חלבון וגם RNA) בתאים PC-9MET1000 וד ר PC-9; אין מוטציות נרכשות נמצאים EGFR ו- MET. לכן, הופעתה של מעקף איתות מאוד המוצע כגורם ההתנגדות רכשה EGFR-TKI ו/או MET-TKI. איור 5 מראה את ההתנגדות של ד ר PC-9 תאים כדי PHA665752 בנוכחות 1 מיקרומטר של אירסה, כפי שהיא נמדדת וזמינותו MTT. למרות ההתפשטות של תאים PC-9MET1000 היו מעוכבים על ידי טיפול עם אירסה PHA665752, ד ר PC-9 תאים שרדו את הטיפול, המציין כי הם היו כפול-עמיד אירסה, PHA665752. לכן, באמצעות הליך דו-שלבי המינון, PC-9 תאים רכשה התנגדות אירסה, תאים PC-9MET1000 רכשה התנגדות PHA665752 בנוכחות 1 מיקרומטר של אירסה. איור 6 מציג anchorage תלויית התפשטות MET1000 וד ר תאים באגר רך נוכחות או היעדרות של PHA665752, אירסה. הצמיחה של תאים PC-9MET1000 ו- PC-9 ד ר נצפו על אגר רך, המציין כי sublines אלה יכולים לגדול במערכות בשתי 2D and 3D. לפיכך, sublines עמיד היה להתגבר על המגבלה של לא להיות מסוגל לגדול במערכות 2D. יתר על כן, ד ר PC-9 תאים, אך לא תאים PC-9MET1000, יכול לגדול אגר עם 1 מיקרומטר של אירסה, PHA665752. תוצאה זו עולה כי ד ר PC-9 תאים היו עמידים בפני אירסה והן PHA665752, יכול לגדול במערכת התרבות 3D גם כן. המאפיין tumorigenic של sublines עמיד ויצר צריך להיבדק על-ידי assay היווצרות של המושבה או ויוו השתלת14.
איור 1: סכימה של יצירת כפולה-התנגדות: ד ר PC-9 תאים מתאי PC-9.
דיאגרמת ליצירת כפול-עמיד שיבוטים מתאי PC-9 לפי נוהל 2-צעד המינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אירסה EGFR-TKI עכבות ההתפשטות של תאים PC-9.
PC-9 תאים היו נזרע לתוך צלחת 96-ובכן-5 x 103 תאים/טוב עם µL 50 של מדיום הגידול כל היטב, מראש מודגרות בן לילה ולאחר מכן שטופלו אירסה בריכוזים שצוין עבור 72 h. Assay MTT בוצעה, יתר570 נמדדה על ידי קורא microplate. הערך50 IC היה 0.048 ± 0.01 מיקרומטר. נתונים מוצגים זאת אומרת ± SEM 6-וולס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תאים PC-9MET1000 הציג ההתנגדות אירסה, אך הטיפול עם PHA665752 בנוכחות 1 מיקרומטר של אירסה לדכא את ההפצה שלה.
תאים PC-9 (א) ו- MET1000 היו נזרע 96-ובכן לוחות 5 x 103 תאים/טוב עם µL 50 של הצמיחה בינונית בכל אחד, מראש מודגרות בן לילה ולאחר מכן שטופלו אירסה בריכוזים שצוין עבור ה 72 תאים MET1000 (B) היו נזרע לתוך צלחת 96-ובכן-5 x 103 תאים/טוב עם µL 50 של מדיום הגידול היטב כל , מראש מודגרות בן לילה ולאחר מכן מטופלים עם PHA665752 בריכוזים המצוין ב נוכחות או היעדרות של 1 מיקרומטר של אירסה עבור 72 h. Assay MTT בוצעה, יתר570 נמדדה על ידי קורא microplate. הערך50 IC בנוכחות אירסה היה 0.014 ± 0.01 מיקרומטר, בעוד זה בהיעדר אירסה לא נקבע. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± SEM 6-וולס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: MET הגברה נצפתה ב PC-9MET1000 וד ר PC-9 תאים עם אין מוטציות נרכשות EGFR ו MET.
(א) ביטוי רמות זרחן-MET, הכולל MET נקבעו על ידי ניתוח תספיג חלבון. Β-אקטין שימש פקד הטעינה. MRNA (B) תעתיקים מתאי PC-9, PC-9MET1000 PC-9 ד ר היו לכמת מנורמל בזה של GAPDH ושימוש בזמן אמת RT-PCR. הנתונים מוצגים ביחס לערכים PC-9, אומר ± SEM (n = 8). מובהקות סטטיסטית הוערך באמצעות התלמיד דו-זנבית t-בדיקה של p < 0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית. *, p < 0.05, לעומת הערך PC-9. אקסון (ג) 19-21 של הגן EGFR, אקסון 14-21 של הגן Met היו מוגבר של ה-DNA גנומי על ידי ה-PCR. מוצרי ה-PCR היו לאחר מכן מטוהרים, מנותח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ד ר PC-9 תאים עמידים PHA665752 בנוכחות 1 מיקרומטר של אירסה.
ד ר התאים היו נזרע לתוך צלחת 96-ובכן-5 x 103 תאים/טוב עם µL 50 של מדיום הגידול כל היטב, מראש מודגרות בן לילה ולאחר מכן שטופלו PHA665752 בריכוזים המצוין בנוכחות 1 מיקרומטר של אירסה עבור 72 h. Assay MTT בוצעה, יתר570 נמדדה על ידי קורא microplate. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± SEM 6-וולס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: Anchorage תלויית התפשטות של תאים PC-9MET1000 וד ר PC-9 על אגר רך, נוכחות או היעדרות של PHA665752, אירסה.
תאים (1 × 104) מושעה מחדש ב- 0.3% אגר עם 10% FBS היו נזרע לוחות 6-ובכן מצופה מראש עם אגר רך 0.6%. למחרת, תאים שטופלו אירסה (1 מיקרומטר) ו PHA665752 (1 מיקרומטר) ולאחר מכן הדגירה 14-21 ימים. המושבות היו מוכתמים 0.005% קריסטל ויולט עבור ה 1 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש להקמת כפול-ההתנגדות רכשה ב תאים סרטניים באמצעות השיטה של 2-צעד המינון חוץ גופית בתוך. עבודות מחקר רבות דיווחו כי PC-9 תאים פיתחו עמידות (אירסה או טרסבה) EGFR-TKI דרך T790M EGFR מוטציות15,16. עם זאת, אנחנו לא זיהה T790M מוטציות ב אקסון 20 תאים PC-9MET1000 שלנו על ידי רצף ישירה (איור 4C). יתר על כן, הגברה MET נצפתה לפעול כמו מעקף איתות. לפיכך, תאים PC-9MET1000 הם נדירים ביותר. בעבר דיווחנו כי ריאות אדנוקרצינומה PC-9 תאים מחסה מחיקה 15-bp ב אקסון 19 של EGFR פיתחו אירסה-התנגדות עם הגברה MET לאחר המינון stepwise רציפה בוצע במשך 12 חודשים עד המנה 1 מיקרומטר (בשם תאים PC-9MET1000)17. שורת התאים. זה היה רגיש MET-TKI בנוכחות אירסה. על מנת לקבוע את המנגנון מאחורי ההתנגדות ל EGFR - ו MET-TKIs, פותחה שיטה המינון stepwise רציפה לזירוז כפול-ההתנגדות MET-TKI, PHA665752 ו- EGFR-TKI, אירסה, תאים PC-9MET100012. שיטה זו הסתמכה על התוצאות של ניסוי קליני ללמוד את התקדמות המחלה מעבר אירסה לטיפול. במקרה של מוגבר-MET EGFR-TKI-התנגדות, מעכב MET יחיד לא משמעותית לעכב את התפשטות תאים. כי אותות בין הקולטן במורד הזרם מולקולות הם נפרדו (EGFR-ERK1/2, MET-AKT), דיכוי המשולב EGFR ו- MET יהיה צורך. בשורה נוספת ריאות אדנוקרצינומה תא, HCC827, אשר גם בנמלים המוטציה EGFR, עמידות EGFR-TKI פותחה באמצעות הגברה MET. סודה. et al. דיווח כי תאים HCC827 חושפת את הגדלת ריכוזים של טרסבה בנוכחות התנגדות PHA665752 MET-TKI פותח MET-TKI ו- EGFR-TKI18. יתר על כן, מתנהלים ניסויים קליניים כדי לחקור מקרים של MET-הגברה עם EGFR-TKI-התנגדות. לפיכך, לחקור את המנגנון של ההתנגדות רכשה MET-TKI לאחר הטיפול עם EGFR-TKI, זה הכרחי לגרום כפול-ההתנגדות MET מעכבי ו מעכבי EGFR.
הפרוטוקול המתוארים כאן מעורב stepwise המינון של המטרופוליטן TKI, PHA665752, בנוכחות 1 מיקרומטר של אירסה. השיטה stepwise המינון היא האמינה ביותר ו-18,את השיטה הנפוצה ביותר19. השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא קבלת הערך50 IC של המדכא. אם ערך זה לא נקבע במדויק, התאים לא יצליחו לגדול בכלל בצלחת תרבות. לכן, אם הגידול תא מתחילה להאט, צמצום העלייה ברמת הריכוז של החומר המדכא יפתור את הבעיה. יתר על כן, אם התאים מתחילים למות, זה יהיה אידיאלי כדי לאחסן את התאים הנותרים ב-80 מעלות צלזיוס, לעשות שימוש חוזר בהם-ריכוז הקודם.
שיטה חלופית להקמת עמידות שורות תאים שיטת חשיפה גבוהה-ריכוז, שבו התאים חשופים מטרה לריכוז החומר המדכא ישירות, התאים מתורבתים עד התאים עמיד ששרד יתחילו מתרבים. שיטה זו אמנם רלוונטי יותר קלינית, יש שיעור הצלחה נמוכה יותר כי ריכוז החומר המדכא, אשר הוא המתקדם בתחילה, היעד עלול להרוג כל התאים הורים באופן מיידי. מעניין, זה דווח כי sublines עמיד מושגת באמצעות שתי שיטות אלו שהפגינו מאפיינים שונים הסלולר19,20.
שיטה נוספת להקמת מחתרת ויוו ההתנגדות השיטה, שבה השעיה תא (1.0 × 106-2.0 × 107) מוזרק על האגפים של עכברים, כאשר הגידול מגיע נפח של 200 מ מ3, העכברים הם כלפיהן רציפה טיפול עם מעכבי. גידולים להגיב לחלוטין ולאחר מכן יישנו במהלך קיימו טיפול הם שנקטפו, טחון, מתעכל עם טריפסין, לסנן ואז נזרע על תרבות מנות. שיטה זו, אמנם מעט מסובך, ניתן להשתמש באופן יעיל במקרים של נוגדן-התנגדות. עם זאת, כאשר הגידולים להראות התנגדות במערכת ויוו מועברים למערכת במבחנה , התאים לפעמים להיכשל לצמוח מערכות התרבות 2D. לכן, מערכות תלת-ממד תרבות כגון מטריצה קרום המרתף. אמורים להיות בשימוש21
למרות כל שלושת השיטות האלה דורשים זמן רב יחסית לבצע, השיטה stepwise המינון היא האחת החסכונית ביותר. . זה גם השיטה המתאימה ביותר עבור בבירור הבנה ולימוד תהליך רכישת מעכב-התנגדות... בנוסף, שיעור ההצלחה של שתי השיטות האחרות הוא נמוך באופן משמעותי מזה של השיטה stepwise המינון.
ההתנגדות היא הוקמה לאחר, יש צורך לבחון את הפוטנציה tumorigenic של שורות תאים אלה. המושבה מערך בדיקות או השתלות ויוו מועסקים לעיתים קרובות למטרה זו (איור 6). שיטות אלה עלול להתגבר על החיסרון של שימוש במערכות תרבות 2D.
מגבלה משמעותית בשיטות אלה הוא כי תאים עם ההתנגדות רכשה לעיתים קרובות אינן משקפות במדויק את המחתרת של תאים סרטניים אנושיים. לכן, המנגנונים גילה דרך מחקרים במבחנה דגמים צריכים להיות אישר דגימות רקמה אנושית באמצעות בדיקות חוזרות ונשנות דגימות ביופסיה. בנוסף, למרות פרוטוקולים אלה יכול להיות שימושי לבחינת המנגנון מאחורי ההתנגדות רכשה במהלך התפתחות תאים סרטניים, זה אפשרי כי ההתנגדות רכשה היה המושרה על ידי שינויים של microenvironment הגידול. זה רציני הגבלת אחר. לחקור את היעילות של פרוטוקולים אלה בתאי סרטן בלבד. זה יהיה עדיף להשתמש ברקמות מהבנקים רקמה אנושית, אשר זמינים עבור חוקרים רבים.
פרוטוקול המובאת כאן יכול להיות שונה להקמת התנגדות מעכבי מולקולרית אחרים גם כן. לכן שיטה זו שימושית פוטנציאל לפיתוח כלים טיפוליים לשליטה סרטן בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים חברי המכון לאונקולוגיה מולקולרית מתחשב הערות, עצות מועילות, Editage לסיוע שלהם עם עריכה בשפה האנגלית. עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית הנתמכות על-ידי MEXT עבור קרן מחקר אסטרטגי באוניברסיטאות פרטי (2012-2016) מ משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה של יפן. Tohru Ohmori קיבל מימון (2015-2016) המחקר Boehringer-Ingelheim (אוסטריה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
