Summary
يتم وصف أسلوب في المختبر لإنشاء المقاومة المزدوج EGFR-TKI و MET TKI في الخلايا السرطانية. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتطوير علاجات لمرضى EGFR-الطفرات، الذين يظهرون تطور المرض رغم العلاج EGFR TKI مع MET-التضخيم. فإنه يمكن أيضا تعديل لمثبطات استهداف الجزيئات الأخرى.
Abstract
مقاومة المخدرات يشكل تحديا رئيسيا في علاج السرطان. جيل سوبلينيس مقاومة في المختبر اللازمة لاكتشاف آليات مبتكرة للتغلب على هذا التحدي. هنا، وأسلوب تصعيد جرعة 2-خطوة لإنشاء المقاومة المزدوجة لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)-تيروزين كيناز المانع (TKI) وجيفيتينيب MET TKI، PHA665752، هو وصف. يستند هذا الأسلوب إلى بسيطة تصعيد الجرعة التدريجي من مثبطات لحفز اكتسبت المقاومة في خطوط الخلايا. أسلوب بديل لتوليد سوبلينيس مقاومة ينطوي على تعريض الخلايا لتركيزات عالية من المانع في خطوة واحدة. يحتوي الأسلوب على تصعيد الجرعة تدريجي أعلى إمكانية نجاح حمل اكتسبت مقاومة من هذا الأسلوب. تفعيل EGFR الطفرات هي المؤشرات الحيوية لاستجابة للعلاج مع EGFR-TKI، الذي هو علاج الخط الأول تطبيقية لسرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) التي تأوي هذه الطفرات. على الرغم من تقارير استجابات الفعالة، استخدام EGFR TKI غير محدودة نظراً لأن الأورام حتما اكتساب المقاومة. وتشمل الآليات الرئيسية وراء المقاومة EGFR TKI طفرة ثانوية في موقع برنامج حماية البوابة، T790M في إكسون 20 من EGFR، وإشارة تجاوز تابعين. وهكذا، حل محتمل لهذه المسألة سيكون مزيجاً من EGFR TKI و MET TKI. هذا العلاج مجتمعة قد ثبت أن تكون فعالة في نموذج دراسة في المختبر . أنشئت المقاومة جيفيتينيب المكتسبة من خلال التضخيم MET بتصعيد الجرعة تدريجي من جيفيتينيب لمدة 12 شهرا، وتم إنشاء خط خلية المسماة PC-9MET1000 في دراسة سابقة. لمواصلة التحقيق آليات TKI MET المكتسبة و EGFR TKI تدار المقاومة، MET-TKI، PHA665752، لهذه الخلايا مع تصعيد الجرعة تدريجي حضور جيفيتينيب لمدة 12 شهرا. هذا البروتوكول كما طبقت بنجاح لعدد من العلاجات المركبة إنشاء المقاومة المكتسبة لجزيئات مثبطات أخرى.
Introduction
النمطان الطفرات في مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) وتوجد في مجموعة فرعية من المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) وهي المؤشرات الحيوية التنبؤية هامة من هذا المرض1،2. تحدث هذه تفعيل EGFR الطفرات الأكثر شيوعاً كحذف في الإطار في إكسون 19 في (delE746-A750) أو طفرة نقطة استبدال لوسين ارجينين في كودون 858 من إكسون 21 (L858R) في EGFR تيروزين كيناز المجال3،4. المعالجة بمثبطات كيناز تيروزين EGFR (تكيس) علاج فعال سريرياً لمرضى NSCLC إيواء الطفرات EGFR. ومع ذلك، يقتصر هذا العلاج لا مفر منه اكتساب المقاومة تكيس EGFR مثل جيفيتينيب وارلوتينيب. أن المقاومة المكتسبة الأكثر شيوعاً يحدث عن طريق طفرة T790M ثانوية في إكسون 20 من EGFR، التي تم الكشف عنها في حوالي 60% مرضى الذين اكتسبوا المقاومة EGFR TKI (جيفيتينيب أو ارلوتينيب). الآليات الجزيئية الأخرى المرتبطة بالمقاومة المكتسبة تكيس EGFR يتم تفعيل الالتفافية مما يشير إلى سبب التضخيم MET، التحول من سرطان الرئة الخلية الصغيرة، والمرحلة الانتقالية الظهارية للوسيطة5،6. المستقبلات لعامل النمو تتمثل، مرمزة بواسطة الجينات MET، الذي هو ديسريجولاتالدين العديد من الأورام، وقد أبلغ عن أن يكون مرشح مهم لاستهداف العلاجات7،8.
استراتيجيات للتغلب على المقاومة المكتسبة تكيس EGFR يجري الآن تقييم السريرية. الدراسات السريرية والسريرية أظهرت أن مثبطات EGFR الجيل الثالث مثل أوسيميرتينيب فعالاً بالنسبة للمرضى الذين يعانون من الطفرة T790M9. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحول دون نمو السرطانات EGFR-المسخ مع التضخيم MET بالجمع بين العلاج مع تكيس EGFR ويلتقي6،10. التجارب السريرية تقييم تركيبة من مثبطات MET و EGFR في المرضى مع المقاومة المكتسبة إلى جيفيتينيب وارلوتينيب جارية الآن11.
لدراسة الآلية الجزيئية للمقاومة المكتسبة لوكلاء العلاج الكيميائي، وخطوط الخلايا التي تستجيب في البداية لمثبطات تعامل بشكل مستمر مع هذه الموانع. تتوفر طريقتين إنشاء المقاومة المكتسبة في خطوط الخلايا. واحد تصعيد الجرعة تدريجي، والآخر هو التعرض لتركيزات عالية. أسلوب تصعيد تدريجي وقد تم أكثر شيوعاً، لأنه يحتوي على معدل نجاح أعلى. أولاً تتعرض الخلايا بتركيزات منخفضة من مثبطات، حوالي عشر قيمة النصف الأعلى تركيز المثبطة (IC50)، والتركيز ثم يتم تدريجيا زيادة بنسبة 10-30% حتى يتم تحقيق تركيز الهدف. يتضمن أسلوب التعرض لتركيزات عالية من تعريض الخلايا للجرعة النهائية من مثبط على المديين المتوسط والثقافة، التي أكثر من قيمة50 IC، حيث قتل الخلايا الأبوية تماما تقريبا. يحتوي هذا الأسلوب التعرض لتركيزات عالية من معدل نجاح أقل كثيرا من أسلوب التصعيد التدريجي.
في دراسة سابقة، كان سيظهر العلاج مجتمعة مع EGFR TKI ويلتقي TKI أن تكون فعالة في نظام في المختبر . المقاومة المكتسبة لافجر-TKI، جيفيتينيب، أنشئ من خلال تصعيد تدريجي لمدة 12 شهرا، جنبا إلى جنب مع MET-التضخيم، وهكذا، كان خط خلية جيفيتينيب مقاوم يسمى PC-9MET1000 الذي تم إنشاؤه12.
البروتوكول المعروضة هنا إجراء تصعيد جرعة خطوتين للحصول على خلايا تحور EGFR NSCLC PC-9 مع المقاومة المزدوج EGFR-TKI وجيفيتينيب MET TKI، PHA665752 (الشكل 1). هذا الأسلوب لإنشاء المكتسبة مقاومة في خطوط الخلايا سهلة نسبيا لتنفيذ، مع ارتفاع نسبة نجاح. يمكن تعديل البروتوكول وصف التطبيق مع مثبطات للعقاقير الجزيئية المستهدفة والعوامل السامة للخلايا، فضلا عن الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إنشاء خلايا مقاومة جيفيتينيب
- تحديد تركيز جيفيتينيب الأولية بمقايسة بروميد (MTT) ديفينيلتيترازوليوم 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-.
- الثقافة PC-9 خلايا في النمو المتوسطة (المتوسط RPMI 1640 مع المضادات الحيوية FBS و 1% 10% (البنسلين: 100 يو/مليلتر ووالستربتوميسين: 100 ميكروغرام/مل))، في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- ضبط الخلايا إلى 1.0 × 105 خلايا/مل باستخدام خلية الآلي مواجهة (انظر الجدول للمواد)، والبذور 50 ميليلتر من هذا في كل بئر من صفيحة 96-جيدا باستخدام متوسط النمو؛ ينبغي أن يكون التركيز النهائي للخلايا 5.0 × 103 خلايا/جيدا.
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- إضافة 50 ميليلتر من جيفيتينيب (في 2 × التركيز النهائي) بتركيزات مختلفة: 0، 0.002، 0.006، 0.02، 0.06، 0.2، 0.6، 2 و 6 و 20 ميكرومتر إلى هذه الآبار هذه أيضا أن حجم النهائي في كل 100 ميليلتر.
- احتضان لوحة ح 72 في 37 درجة مئوية.
- إضافة 15 ميليلتر من الحل صبغ (انظر الجدول للمواد) لكل بئر (الاستخدام النهائي 13% تركيز الحل صبغ)، واحتضان ح 4 في 37 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميليلتر من الحل solubilization/إيقاف (انظر الجدول للمواد) سولوبيليزينج في فورمازان التي تنتجها الحل صبغ (انظر الجدول للمواد) في كل خير، واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- قياس الكثافة الضوئية في 570 نانومتر (OD570) باستخدام قارئ ميكروسكوبية للحصول على قيمة50 IC عن طريق توليد منحنى انتشار خلايا.
- استخدام برمجيات إحصائية (انظر الجدول للمواد) لعرض البيانات بيانيا وحساب القيمة50 IC (الشكل 2).
- إعداد replicates 6-12 وتكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل.
- التدرجي الجرعة-التصعيد المستمر جيفيتينيب للمعالجة للكمبيوتر-9 خلايا.
- الثقافة PC-9 خلايا (1 مل في حالة شبه المتلاقية) في أطباق p100 مع 10 مل متوسط النمو في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- إضافة عشر قيمة50 IC جيفيتينيب إلى الطبق p100.
- عندما تصبح الخلايا في الأجلين المتوسط والثقافة الفرعية المتلاقية، إضافة 1-2 مل خلايا إلى 10 مل متوسط نمو جديدة باستخدام بيبيت 1 مل بتركيز أعلى من 10-30 في المائة من جيفيتينيب في نفس الظروف الثقافة.
- زيادة تركيز جيفيتينيب تدريجيا بنسبة 10-30% مع كل انقسام حتى تصل إلى 1 ميكرومتر؛ قد تستغرق هذه العملية حوالي 6-12 شهرا.
ملاحظة: عندما يصل تركيز جيفيتينيب القيمة50 IC، تكاثر الخلايا يصبح أبطأ بكثير، وهكذا، يمكن إضافة 2-4 مل خلايا إلى 10 مل متوسط نمو جديدة مع تركيز أعلى من جيفيتينيب؛ الحد من الزيادة في تركيز جيفيتينيب قد يحل المشكلة. وعلاوة على ذلك، سيكون من المثالي لتخزين الخلايا المتبقية في-80 درجة مئوية، وإعادة استخدامها في تركيز السابقة. كما PC-9 خلايا في تعليق، ليس من الضروري استخدام التربسين باساجينج؛ ومع ذلك، أثناء العملية لزيادة تركيز جيفيتينيب، قد إرفاق الخلايا إلى الجزء السفلي من صحن الثقافة. في هذه حالة، يمكن استخدامها خلية-مكشطة لفصل الخلايا ملتصقة. - ثقافة مقاومة جيفيتينيب PC-9 خلايا في الأجلين المتوسط والنمو مع 1 ميكرومتر من جيفيتينيب.
- إجراء فحص MTT لتأكيد جيفيتينيب-مقاومة الخلايا13؛ هذه الخلايا مقاومة جيفيتينيب أسماء الكمبيوتر--9MET1000 (سميت الخلايا MET1000)، نظراً لأنها أظهرت زيادة البروتين والحمض النووي الريبي مستويات MET (الشكل 3A، الشكل 4 أ، ب).
2-إنشاء المزدوج-مقاومة جيفيتينيب و PHA665752
- تحديد تركيز PHA665752 الأولى بفحص MTT.
- الثقافة MET1000 الخلايا في أطباق p100 مع 10 مل من المتوسطة النمو و 1 ميكرومتر جيفيتينيب في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- بذور الخلايا في لوحة 96-جيدا في 5.0 × 103 خلايا/جيدا مع 50 ميليلتر من متوسط النمو في كل بئر. ضبط التركيز النهائي للخلايا إلى 1.0 × 105 خلايا/مل تستخدم خلية الآلي مواجهة (انظر الجدول للمواد).
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- إضافة 50 ميليلتر من PHA665752، MET-TKI (في 2 × التركيز النهائي)، إلى الخلايا بتركيزات مختلفة: 0، 0.002، 0.006، 0.02، 0.06، 0.2، 0.6، 2 و 6 و 20 ميكرومتر بما في ذلك 2 ميكرومتر جيفيتينيب (2 X النهائي التركيز عند)؛ ينبغي أن تكون وحدة التخزين النهائي في كل بئر 100 ميليلتر.
- احتضان لوحة ح 72 في 37 درجة مئوية.
- إضافة 15 ميليلتر من الحل صبغ (انظر الجدول للمواد) لكل خير، واحتضان ح 4 في 37 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميليلتر من solubilization/إيقاف الحل سولوبيليزينج في فورمازان التي تنتجها الحل صبغ (انظر الجدول للمواد) لاحتضان كل جيدا، ومرة أخرى بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- قياس الكثافة الضوئية في 570 نانومتر (OD570) باستخدام قارئ ميكروسكوبية للحصول على قيمة50 IC عن طريق توليد منحنى انتشار خلايا.
- استخدام برمجيات إحصائية (انظر الجدول للمواد) لعرض البيانات بيانيا وحساب قيمة50 IC PHA665752 حضور جيفيتينيب (الشكل 3B).
- إعداد replicates 6-12 وتكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل.
- إنشاء المزدوج-المقاومة في خلايا MET1000 إلى جيفيتينيب و PHA665752.
- الثقافة MET1000 الخلايا في أطباق p100 مع 10 مل متوسط النمو، و 1 ميكرومتر جيفيتينيب في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- إضافة عشر قيمة50 IC PHA665752 إلى المتوسطة النمو حضور 1 ميكرومتر من جيفيتينيب بنفس الشروط الثقافة.
- زيادة تركيز PHA665752 تدريجيا بنسبة 10-30% مع كل انقسام حتى تصل إلى 1 ميكرومتر. قد تستغرق هذه العملية حوالي 6-12 شهرا.
ملاحظة: عندما يصل تركيز PHA665752 إلى القيمة50 IC، تكاثر الخلايا يصبح أبطأ بكثير، وهكذا، يمكن إضافة 2-4 مل خلايا باستخدام بيبيت 1 مل إلى 10 مل متوسط نمو جديدة مع تركيز أعلى من PHA665752؛ الحد من الزيادة في تركيز PHA665752 قد يحل المشكلة. وعلاوة على ذلك، سيكون من المثالي لتخزين الخلايا المتبقية في-80 درجة مئوية، وإعادة استخدامها في تركيز السابقة. ليس من الضروري استخدام التربسين باساجينج؛ ومع ذلك، أثناء زيادة تركيز PHA665752، قد إرفاق الخلايا إلى الجزء السفلي من الطبق الثقافة. في مثل هذه الحالات، يمكن خلية-مكشطة لفصل الخلايا. - وأخيراً، الثقافة PC-9 خلايا مقاومة جيفيتينيب و PHA665752 على المديين المتوسط والنمو مع ميكرومتر 1 من كل من جيفيتينيب و PHA665752 في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- إجراء فحص MTT للتأكد من أن الخلايا المزدوج المقاوم جيفيتينيب و PHA66575213، وأنها ليست حساسة ل PHA665752 حضور جيفيتينيب؛ كانت تسمية هذه الخلايا المقاومة المزدوج الدكتور PC-9 (تسمية كخلايا الدكتور) (الشكل 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نظرة عامة على البروتوكول قدم في هذه المخطوطة يرد في الشكل 1، بما في ذلك استحثاث المقاومة المزدوجة المكتسبة إلى جيفيتينيب و PHA665752 في خلايا PC-9 إجراء تصعيد جرعة في الخطوة 2. ويبين الشكل 2 انخفاضا في انتشار الأبوية PC-9 خلايا كتركيز الزيادات جيفيتينيب. وهذا يشير إلى أن الخلايا PC-9 أصبحت حساسة إلى جيفيتينيب بعد إجراء تصعيد الجرعة. ويبين الشكل 3 أن الخلايا PC 9MET1000 تبدي مقاومة جيفيتينيب، ولكن حساسة ل MET TKI، PHA665752، حضور جيفيتينيب. كان إعاقة انتشار الخلايا PC-9 في تركيزات أعلى من جيفيتينيب، مشيراً إلى أنهم كانوا حساسة إلى جيفيتينيب. غير PC-9MET1000 الخلايا لا تظهر انخفاض انتشار حتى بتركيزات عالية من جيفيتينيب، مما يشير إلى أنها قد اكتسبت مقاومة جيفيتينيب. عندما كانت تعامل الخلايا PC-9MET100 مع زيادة تركيز PHA665752 في وجود أو عدم وجود جيفيتينيب ح 72، انتشارها، مقيسا فحص MTT، قد تناقص. وكان هناك أيضا انخفاضا متواضعا في انتشار الخلايا 9MET1000 الكمبيوتر في حالة عدم وجود جيفيتينيب. وهكذا، مزيج من جيفيتينيب و PHA665752 أن قمع انتشار الخلايا أكثر فعالية من العلاج مع PHA665752 وحدها.
ويبين الشكل 4 مستويات تضخم تابعين (البروتين والحمض النووي الريبي) في الخلايا PC-9MET1000 والدكتور PC-9؛ لا الطفرات المكتسبة موجودة في EGFR ويلتقي. ولذلك، يقترح ظهور إشارات تجاوز عالية كسبب للمقاومة المكتسبة EGFR TKI و/أو MET TKI. يبين الشكل 5 مقاومة الخلايا الدكتور PC-9 إلى PHA665752 حضور 1 ميكرومتر من جيفيتينيب، مقيسا فحص MTT. على الرغم من أن كانت تحول دون انتشار الخلايا PC-9MET1000 بالمعاملة مع جيفيتينيب و PHA665752، نجا الدكتور PC-9 خلايا العلاج، مما يشير إلى أنهم كانوا ثنائي المقاوم جيفيتينيب و PHA665752. وهكذا، من خلال إجراء تصعيد جرعة في الخطوة 2، اكتسبت PC-9 خلايا مقاومة جيفيتينيب والخلايا PC 9MET1000 اكتسبت مقاومة PHA665752 حضور 1 ميكرومتر من جيفيتينيب. ويبين الشكل 6 انتشار مستقلة مرسى MET1000 والدكتور الخلايا في أجار ناعمة في وجود أو عدم وجود PHA665752 وجيفيتينيب. ولوحظ نمو الخلايا PC-9MET1000 والدكتور PC-9 في أجار الناعمة، مشيراً إلى أن هذه سوبلينيس يمكن أن تنمو في 2D و 3D نظم. وهكذا، قد تغلبت على سوبلينيس مقاومة الحد من عدم تمكنه من النمو في 2D نظم. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنمو خلايا الدكتور PC-9، ولكن ليس خلايا الكمبيوتر--9MET1000، في أجار مع 1 ميكرومتر جيفيتينيب و PHA665752. هذه النتيجة تشير إلى أن الدكتور PC-9 خلايا مقاومة جيفيتينيب و PHA665752، ويمكن أن تنمو في نظام ثقافة 3D كذلك. يجب التحقق من ممتلكات ورمي سوبلينيس مقاومة المنشأة فحص تكوين مستعمرة أو في فيفو زرع14.
الشكل 1: مخطط لتوليد المقاومة المزدوج: الدكتور PC-9 خلايا من خلايا PC-9.
رسم تخطيطي لتوليد استنساخ المزدوج مقاومة من خلايا PC-9 قبل إجراء الخطوة 2-تصعيد لجرعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: جيفيتينيب EGFR TKI كبح انتشار الخلايا PC-9.
كان المصنف الخلايا PC-9 في لوحة 96-جيدا في 5 × 103 خلايا/جيدا مع 50 ميليلتر من متوسط النمو في كل بئر، قبل المحتضنة بين عشية وضحاها، وثم تعامل مع جيفيتينيب في تركيزات المشار إليها ح 72. أنجز فحص MTT و التطوير التنظيمي570 تم قياسه بواسطة قارئ ميكروسكوبية. وكانت قيمة50 IC 0.048 ± 0.01 ميكرومتر. البيانات هي كما هو موضح يعني ± SEM للآبار 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: PC-9MET1000 الخلايا أظهرت مقاومة جيفيتينيب، ولكن المعاملة مع PHA665752 حضور 1 ميكرومتر جيفيتينيب منع انتشارها.
كانت تبذر الخلايا (A) PC-9 و MET1000 إلى لوحات 96-جيدا في 5 × 103 خلايا/جيدا مع 50 ميليلتر من نمو متوسطة في بعضها حسنا، قبل المحتضنة بين عشية وضحاها، وثم تعامل مع جيفيتينيب في تركيزات المشار إليها ل 72 h. خلايا MET1000 (ب) كانت تبذر في لوحة 96-جيدا في 5 × 103 خلايا/جيدا مع 50 ميليلتر من متوسط النمو في كل بئر ، قبل المحتضنة بين عشية وضحاها، وثم تعامل مع PHA665752 في تركيزات المشار إليه في وجود أو عدم وجود 1 ميكرومتر من جيفيتينيب ح 72. أنجز فحص MTT و التطوير التنظيمي570 تم قياسه بواسطة قارئ ميكروسكوبية. وكانت قيمة50 IC حضور جيفيتينيب 0,014 ± 0.01 ميكرومتر، في حين أنه في حالة عدم وجود جيفيتينيب لم يتحدد. وترد البيانات ك ± يعني وزارة شؤون المرأة للآبار 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التضخيم MET لوحظ في خلايا PC-9MET1000 والدكتور PC-9 مع لا الطفرات المكتسبة في EGFR ويلتقي.
التعبير (A) هي التي تحدد مستويات MET MET الفوسفور ومجموع تحليل لطخة غربية. Β-أكتين استخدمت كعنصر تحكم تحميل. (ب) مرناً النصوص من الخلايا PC-9 والكمبيوتر--9MET1000، والدكتور PC-9 تم قياس كمية استخدام الوقت الحقيقي RT-PCR وتطبيع مع جابده. وترد البيانات المتعلقة بقيم PC-9، كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 8). دلالة إحصائية قدرت استخدام ثنائي الطرف الطالب t-الاختبار، و ف < 0.05 اعتبرت يعتد به إحصائيا. *، ف < 0.05، مقارنة مع قيمة PC-9. إكسون (ج) 19-21 من الجينات EGFR واكسون 14-21 من الجينات Met قد تتضخم من الحمض النووي الجينوم ببكر. منتجات PCR ثم تنقيته وتحليلها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: الدكتور PC-9 خلايا تقاوم PHA665752 حضور 1 ميكرومتر من جيفيتينيب.
كان المصنف الخلايا الدكتور في لوحة 96-جيدا في 5 × 103 خلايا/جيدا مع 50 ميليلتر من متوسط النمو في كل بئر، قبل المحتضنة بين عشية وضحاها، وثم تعامل مع PHA665752 في تركيزات المشار إليه حضور 1 ميكرومتر جيفيتينيب ح 72. أنجز فحص MTT و التطوير التنظيمي570 تم قياسه بواسطة قارئ ميكروسكوبية. وترد البيانات ك ± يعني وزارة شؤون المرأة للآبار 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: مرسى مستقلة انتشار الخلايا PC-9MET1000 والدكتور PC-9 في أجار ناعمة في وجود أو عدم وجود PHA665752 وجيفيتينيب.
الخلايا (1 × 104) تعليق إعادة في أجار 0.3% مع 10% FBS كانت تبذر في لوحات 6-جيدا قبل المغلفة مع أجار لينة 0.6 في المائة. وفي اليوم التالي الخلايا تعامل مع جيفيتينيب (1 ميكرومتر) و PHA665752 (1 ميكرومتر) وثم المحتضنة لمدة 14-21 يوما. المستعمرات كانت ملطخة بالبنفسجي كريستال 0.005 في المائة حاء 1 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام البروتوكول هو موضح هنا لإنشاء المقاومة المزدوجة المكتسبة في الخلايا السرطانية باستخدام أسلوب تصعيد جرعة 2-الخطوة في المختبر. وأفادت العديد من الورقات البحثية أن تطوير PC-9 خلايا المقاومة EGFR TKI (جيفيتينيب أو ارلوتينيب) من خلال T790M EGFR الطفرات15،16. ومع ذلك، نحن لم يكشف عن الطفرات T790M في إكسون 20 خلايانا PC-9MET1000 بالتسلسل المباشر (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، لوحظ MET التضخيم بمثابة تجاوز إشارات الطريق. وهكذا، خلايا PC-9MET1000 نادرة للغاية. ونحن أفادت سابقا أن تطوير الرئة غدية PC-9 خلايا إيواء حذف 15-بي بي في إكسون 19 EGFR جيفيتينيب-المقاومة مع التضخيم MET بعد تصعيد الجرعة تدريجي مستمر لمدة 12 شهرا حتى وصلت الجرعة إلى 1 ميكرومتر (تسمية الخلايا PC 9MET1000)17. وكان هذا الخط خلية حساسة MET TKI حضور جيفيتينيب. من أجل تحديد الآلية وراء المقاومة تكيس EGFR و MET، وضعت أسلوب تصعيد جرعة تدريجي مستمر للحث على المقاومة المزدوج إلى MET TKI و PHA665752 و EGFR-TKI، جيفيتينيب، في خلايا الكمبيوتر--9MET100012. يعتمد هذا الأسلوب على نتائج تجربة سريرية لدراسة تطور المرض بعد العلاج جيفيتينيب. مثبط MET واحد لا إلى حد كبير في حالة تضخيم MET EGFR-TKI-المقاومة، أن تمنع انتشار الخلايا. لتوصيل الإشارة بين مستقبلات وفي المصب الجزيئات المنفصلة (EGFR-ERK1/2 ويلتقي AKT)، قمع مجتمعة EGFR ويلتقي سيكون مطلوباً. وفي خط خلية غدية الرئة آخر، وضعت HCC827، الذي يأوي أيضا الطفرة EGFR، EGFR TKI المقاومة من خلال التضخيم MET. سودا وآخرون عن تعرض الخلايا HCC827 لزيادة تركيزات ارلوتينيب حضور MET TKI PHA665752 وضعت مقاومة MET TKI و EGFR TKI18. وعلاوة على ذلك، تجري حاليا تجارب سريرية لدراسة حالات التضخيم MET EGFR-TKI-مقاومة. وهكذا، للتحقيق في إليه المقاومة MET TKI المكتسبة بعد العلاج مع EGFR TKI، من الضروري حمل المزدوج-مقاومة لمثبطات MET ومثبطات EGFR.
ووصف البروتوكول هنا المشاركة متدرجة الجرعة-تصاعد MET TKI، PHA665752، حضور 1 ميكرومتر من جيفيتينيب. أسلوب تصعيد الجرعة التدريجي هو الأكثر موثوقية وال18،الأسلوب الأكثر استخداماً19. أن الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الحصول على قيمة50 IC المانع. إذا لم يتم تحديد هذه القيمة بدقة، سوف تفشل الخلايا تنمو على الإطلاق في الطبق الثقافة. ولذلك، إذا كان نمو الخلية يبدأ ببطء، الحد من الزيادة في تركيز المانع قد يحل المشكلة. علاوة على ذلك، إذا كانت الخلايا يبدأ الموت، سيكون من المثالي لتخزين الخلايا المتبقية في-80 درجة مئوية، إعادة استخدامها في تركيز السابقة.
أسلوب بديل لإنشاء المقاومة في خطوط الخلايا هي طريقة التعرض لتركيزات عالية، فيها الخلايا تتعرض لتركيز مثبط الهدف مباشرة، وتستزرع الخلايا حتى بداية خلايا مقاومة الباقين على قيد الحياة تنتشر. على الرغم من أن هذا الأسلوب أكثر سريرياً ذات الصلة، لديها معدل نجاح أقل نظراً لتركيز الهدف مثبط، التي تدار في البداية، قد قتل كافة الخلايا الأبوية فورا. من المثير للاهتمام، وأفيد أن مقاومة سوبلينيس التي تم الحصول عليها من خلال هاتين الطريقتين يحمل الخصائص الخلوية المختلفة19،20.
طريقة أخرى لإنشاء المقاومة هو في فيفو المقاومة الأسلوب، وفيها تعليق خلية (1.0 × 106-2.0 × 107) يحقن الجناحين الفئران، وعندما يصل الورم إلى حجم 200 ملم3، الفئران يتعرضون باستمرار المعاملة مع مثبطات. تحتفظ الأورام التي تستجيب تماما وثم تتكرر خلال العلاج يتم حصادها مفروم ويهضم مع التربسين، وثم تصفيتها والمصنف على أطباق الثقافة. هذا الأسلوب، على الرغم من معقدة إلى حد ما، يمكن استخدام فعال في حالات مقاومة جسم. ومع ذلك، عندما تفشل الأورام التي تظهر في المقاومة في النظام في فيفو يتم نقلها إلى في المختبر نظام الخلايا في بعض الأحيان تنمو ثقافة 2D نظم. ولذلك ينبغي أن تكون نظم الثقافة 3D مثل مصفوفة غشاء المستخدمة21.
على الرغم من أن كل ثلاثة من هذه الأساليب يتطلب وقتاً طويلاً نسبيا لتنفيذ، هو الأسلوب التدرجي في تصعيد الجرعة الأكثر اقتصادا. كما أنها الطريقة الأكثر ملاءمة لوضوح فهم ودراسة عملية الحصول على مقاومة مثبط. وبالإضافة إلى ذلك، معدل نجاح هاتين الطريقتين الأخرى أقل بكثير من أن أسلوب التصعيد الجرعة تدريجي.
بمجرد تأسيس المقاومة، من الضروري اختبار فاعلية هذه خطوط الخلايا الورمية. اختبارات تشكيل مستعمرة أو زرع في فيفو غالباً ما يلجأ لهذا الغرض (الشكل 6). هذه الأساليب قد التغلب على مساوئ استخدام نظم الثقافة 2D.
قيداً رئيسيا من هذه الأساليب أن الخلايا مع المقاومة المكتسبة غالباً ما لا تعكس بدقة المقاومة في الخلايا السرطانية البشرية. ولذلك، ينبغي تأكيد الآليات التي تم اكتشافها من خلال دراسات في نماذج في المختبر في عينات الأنسجة البشرية من خلال التجارب المتكررة في عينات خزعة. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن هذه البروتوكولات يمكن أن تكون مفيدة لدراسة الآلية وراء المقاومة المكتسبة أثناء تطوير الخلايا السرطانية، فمن الممكن أن حملت المقاومة المكتسبة بالتعديلات من ورم المكروية. وهذا قيد خطير آخر للتحقيق في مدى فعالية هذه البروتوكولات في الخلايا السرطانية فقط. سيكون من الأفضل استخدام أنسجة من بنوك الأنسجة البشرية، التي تتوفر لكثير من الباحثين.
يمكن تعديل البروتوكول المعروضة هنا لإنشاء مقاومة لمثبطات الجزيئية الأخرى كذلك. ولذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة لتطوير وسائل علاجية لمكافحة السرطان في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر أعضاء معهد علم الأورام الجزيئي للتعليقات المدروسة ونصائح مفيدة، واديتاجي لمساعدتها مع تحرير اللغة الإنجليزية. وأيد البرنامج يدعم يأمرون هذا العمل "مؤسسة الأبحاث الاستراتيجية" في الجامعات الخاصة (2012-2016) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا في اليابان. أوموري توهرو تلقي أبحاث التمويل (2015-2016) من بورنغير-انغلهايم (انغلهايم، ألمانيا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
