Summary
Eine in-vitro- Methode für die Festlegung der doppelten Widerstand gegen eine EGFR-TKI und ein MET-TKI in Krebszellen wird beschrieben. Diese Methode ist nützlich für die Entwicklung von Therapien für Patienten mit EGFR-Mutationen, die Progression der Erkrankung trotz der EGFR-TKI Behandlung mit MET-Verstärkung ausstellen. Es kann auch für Inhibitoren gezielt andere Moleküle geändert werden.
Abstract
Arzneimittel-Resistenz ist eine große Herausforderung in der Krebstherapie. Die Generation der resistenten Verwandte in Vitro ist notwendig für die Entdeckung neuartiger Mechanismen, um diese Herausforderung zu meistern. Hier, eine 2-stufige Dosiseskalation Methode zur Ermittlung von Dual-Widerstand gegen eine epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)-Tyrosin-Kinase-Inhibitor (TKI), Gefitinib und MET-TKI, PHA665752, beschrieben. Diese Methode basiert auf einfachen schrittweisen Dosissteigerung von Inhibitoren zur Induktion erworbene Resistenz in Zell-Linien. Die alternative Methode zur Erzeugung von resistenten Verwandte beinhaltet Freilegung der Zellen zu hohe Konzentrationen des Inhibitors in einem Schritt. Die schrittweise Dosissteigerung Methode hat eine höhere Möglichkeit erfolgreich induzieren erworbene Resistenz als diese Methode. Aktivierung des EGFR sind Mutationen Biomarker für ein Ansprechen auf die Behandlung mit EGFR-TKI, eine angewandte First-Line Behandlung für nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die diese Mutationen zu beherbergen. Jedoch beschränkt sich trotz Berichte über wirksame Lösungen, die Verwendung von EGFR-TKI weil Tumoren zwangsläufig Widerstand erwerben. Die wichtigsten Mechanismen hinter EGFR-TKI-Resistenz gehören eine sekundäre Mutation bei der Gatekeeper-Website, T790M im Exon 20 des EGFR und ein Bypass-Signal von MET. Somit wäre eine mögliche Lösung für dieses Problem eine Kombination von EGFR-TKI und MET-TKI. Diese Kombinationsbehandlung hat sich gezeigt, wirksam in einem in-vitro- Studienmodell sein. Erworbener Gefitinib-Resistenz wurde durch MET-Verstärkung durch schrittweise Dosissteigerung von Gefitinib für 12 Monate und eine Zell-Linie namens PC-9MET1000 wurde in einer früheren Studie generiert. Um weiter zu untersuchen, die Mechanismen der erworbenen MET-TKI und EGFR-TKI war Widerstand, ein MET-TKI, PHA665752, diese Zellen mit schrittweiser Dosissteigerung in Anwesenheit von Gefitinib für 12 Monate verabreicht. Dieses Protokoll wurde auch für eine Reihe von Kombinationstherapien erworbenen Resistenz gegen andere Hemmer Moleküle herstellen erfolgreich angewendet.
Introduction
Onkogene Mutationen in den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) befinden sich in einer Untergruppe von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und sind wichtige Prädiktive Biomarker von dieser Krankheit1,2. Diese Aktivierung EGFR-Mutationen am häufigsten auftreten, entweder als ein in-Frame löschen im Exon 19 (delE746-A750) oder einer Punktmutation Leucin durch Arginin an Codon 858 Exon 21 (L858R) in der EGFR Tyrosin-Kinase-Domäne3,4zu ersetzen. Behandlung mit EGFR-Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKIs) ist eine klinisch wirksame Therapie für Patienten mit NSCLC beherbergen EGFR-Mutationen. Allerdings ist diese Therapie durch den unvermeidlichen Erwerb des Widerstandes gegen EGFR-TKIs wie Gefitinib und Erlotinib begrenzt. Die häufigste erworbene Resistenz tritt durch eine sekundäre T790M-Mutation im Exon 20 des EGFR, die bei etwa 60 % der Patienten festgestellt wurde, die EGFR-TKI (Gefitinib oder Erlotinib) Resistenz erworben. Andere molekulare Mechanismen erworbene Resistenz gegen EGFR-TKIs sind Aktivierung der Bypass Signalisierung verursacht durch MET Amplifikation, Umwandlung von kleinzelligem Lungenkrebs und epitheliale-mesenchymale Transition5,6. Der Rezeptor für den Hepatozyten-Wachstumsfaktor von MET-Gen kodiert die Dysregulatedin viele Tumoren, wurde berichtet, werden ein wichtiger Kandidat für gezielte Therapien7,8.
Strategien zur Überwindung der erworbenen Resistenz gegen EGFR-TKIs sind jetzt klinische Bewertung unterzogen. Präklinische und klinische Studien haben gezeigt, dass für Patienten mit T790M Mutation9Dritterzeugung EGFR-Inhibitoren wie Osimertinib funktionieren. Darüber hinaus kann das Wachstum der EGFR-mutierten Tumoren mit MET Verstärkung durch Kombinationsbehandlung mit EGFR und MET TKIs6,10gehemmt werden. Klinische Studien, die eine Kombination von MET und EGFR-Inhibitoren bei Patienten mit einer erworbenen Resistenz gegen Gefitinib und Erlotinib Beurteilung sind im Gange jetzt11.
Um den molekularen Mechanismus der erworbenen Resistenz gegen Chemotherapeutika zu untersuchen, werden kontinuierlich Zelllinien, die zunächst auf Inhibitoren reagieren mit dieser Inhibitoren behandelt. Zwei Methoden zur Verfügung, erworbenen Resistenz in Zelllinien zu etablieren. Ist eine schrittweise Dosissteigerung und die andere ist hoher Konzentration ausgesetzt. Die schrittweise Eskalation-Methode wurde häufiger eingesetzt, weil es eine höhere Erfolgsquote hat. Die Zellen zunächst geringen Konzentrationen der Inhibitoren, fast ein Zehntel des Konzentrationswertes der Hälfte-maximale inhibitorischen (IC50), ausgesetzt sind und die Konzentration wird dann schrittweise um 10-30 % erhöht, bis die Zielkonzentration erreicht wird. Hoher Konzentration Belichtungsmethode beinhaltet Freilegung der Zellen, die letzte Dosis von Inhibitor in das Kulturmedium, das ist mehr als der IC50 Wert, also die elterliche Zellen fast vollständig abgetötet werden. Diese hohe Konzentration Belichtungsmethode hat viel eine niedrigere Erfolgsrate als die schrittweise Eskalation-Methode.
In einer früheren Studie zeigte Kombinationsbehandlung mit EGFR-TKI und MET-TKI in einem in Vitro -System wirksam. Erworbener Resistenz gegen eine EFGR-TKI, Gefitinib, entstand durch schrittweise Eskalation für 12 Monate, zusammen mit MET-Verstärkung, und so war eine Gefitinib-resistenten Zellinie namens PC-9MET1000 generierten12.
Die hier vorgestellten Protokoll ist ein zweistufiges Dosiseskalation Verfahren für den Erhalt der EGFR-mutierten NSCLC PC-9 Zellen mit doppelten Widerstand gegen EGFR-TKI, Gefitinib und MET-TKI, PHA665752 (Abbildung 1). Diese Methode zur Einrichtung erworben in Zelllinien resistent ist relativ einfach durchzuführen, mit einer hohen Erfolgsquote. Das beschriebene Protokoll kann für Anwendung mit Inhibitoren von anderen molekularen Ziel Drogen und Zytostatika sowie geändert werden.
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Protocol
1. Stellen Sie her Gefitinib-resistenten Zellen
- Bestimmen Sie die anfängliche Gefitinib Konzentration durch 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromid (MTT) Assay.
- PC-9 Kulturzellen im Wachstumsmedium (RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika (Penicillin: 100 U/mL und Streptomycin: 100 µg/mL)), in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Passen Sie die Zellen mit 1,0 × 105 Zellen/mL eine automatisierte Zelle entgegenzuwirken (siehe Tabelle der Materialien) und 50 µL in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit das Wachstumsmedium Samen; die Endkonzentration der Zellen sollte 5.0 × 103 Zellen/gut.
- Die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Hinzufügen von 50 µL Gefitinib (bei 2 X Endkonzentration) in verschiedenen Konzentrationen: 0, 0,002 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 und 20 µM zu diesen Brunnen so, dass das Endvolumen in jedem gut 100 µL.
- Inkubieren Sie die Platte für 72 h bei 37 ° c
- Fügen Sie 15 µL der Farbstofflösung (siehe Tabelle der Materialien) in jede Vertiefung (Einsatz 13 % Endkonzentration von der Farbstofflösung), und 4 h bei 37 ° c inkubieren
- 100 µL der Solubilisierung/Stopp-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) für die Formazan Gefäss-durch die Farbstofflösung produziert (siehe Tabelle der Materialien) in jedem gut, und es über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Messung die optische Dichte bei 570 nm (OD570) mit einer Mikrotestplatte Reader für den Erhalt des IC50 Wert durch die Erzeugung einer Zellproliferation Kurve.
- Eine statistische-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) grafisch die Daten anzuzeigen, und berechnen Sie den IC50 Wert (Abbildung 2).
- Bereiten Sie 6-12 Wiederholungen und wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal.
- Kontinuierliche schrittweise Dosissteigerung von Gefitinib zur Behandlung von PC-9 Zellen.
- PC-9 Zellkulturen (1 mL in Sub konfluierende Zustand) in p100 Gerichte mit 10 mL Nährmedium in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Fügen Sie ein Zehntel des IC50 Wertes von Gefitinib in die p100-Schüssel.
- Wenn die Zellen in das Kulturmedium Sub konfluierende werden, fügen Sie 1-2 mL Zellen 10 mL frisches Wachstumsmedium mit einer 1-mL-Pipettieren mit 10-30 % höhere Konzentration von Gefitinib in die gleichen Kulturbedingungen hinzu.
- Erhöhen Sie die Gefitinib Konzentration stufenweise um 10-30 % mit jeder Teilung bis 1 µM erreicht; Dies kann etwa 6 bis 12 Monate dauern.
Hinweis: Wenn die Konzentration von Gefitinib den IC50 Wert erreicht, die Zellproliferation wird deutlich langsamer, und also 2-4 mL Zellen bis 10 mL des Mediums frisches Wachstum mit höheren Konzentration von Gefitinib zugesetzt werden; Reduzierung der Anstieg der Konzentration von Gefitinib könnte das Problem lösen. Darüber hinaus wäre es ideal, um die verbleibenden Zellen bei-80 ° C speichern und Wiederverwenden sie bei der vorherigen Konzentration. PC-9 Zellen in Suspension befinden, ist es unnötig, Trypsin für Passagierung verwenden; während des Prozesses Gefitinib Konzentration zu erhöhen, können jedoch die Zellen an der Unterseite der Kulturschale beifügen. In einer solchen Situation kann ein Zelle-Schaber zum Lösen der adhärenten Zellen verwendet werden. - Kultur der Gefitinib-resistente PC-9 Zellen in das Wachstumsmedium mit 1 µM von Gefitinib.
- Führen Sie die MTT-Assay zur Bestätigung des Gefitinib-Widerstands der Zellen13; Diese Gefitinib-resistenten Zellen wurden PC-9MET1000 (bezeichnet als MET1000 Zellen), genannt, weil sie erhöhte Protein- und RNA Ebenen der MET (Abbildung 3A, Abbildung 4A, B) ausgestellt.
2. Dual-Resistenz gegen Gefitinib und PHA665752 herstellen
- Bestimmen der Ausgangskonzentration des PHA665752 von MTT-Assay.
- Kultur der MET1000 Zellen in p100 Gerichte mit 10 mL Wachstumsmedium und 1 µM Gefitinib in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Säen Sie die Zellen in einer 96-Well-Platte bei 5.0 × 103 Zellen/Brunnen mit das Wachstumsmedium in jede Vertiefung 50 µL. Passen Sie die Endkonzentration der Zellen auf 1.0 × 105 Zellen/mL mit einer automatisierten Zelle entgegenzuwirken (siehe Tabelle der Materialien).
- Die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Fügen Sie 50 µL der PHA665752, ein MET-TKI (bei 2 X Endkonzentration), um die Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen: 0, 0,002 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 und 20 µM einschließlich 2 µM Gefitinib (bei 2 X Endkonzentration); Das Endvolumen in jede Vertiefung sollte 100 µL.
- Inkubieren Sie die Platte für 72 h bei 37 ° c
- Fügen Sie 15 µL der Farbstofflösung (siehe Tabelle der Materialien), zu jedem gut, und 4 h bei 37 ° c inkubieren
- 100 µL der Solubilisierung/Stop Lösung für die Formazan Gefäss-durch die Farbstofflösung produziert hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien), jeweils gut und wieder über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Messung die optische Dichte bei 570 nm (OD570) mit einer Mikrotestplatte Reader für den Erhalt des IC50 Wert durch die Erzeugung einer Zellproliferation Kurve.
- Eine statistische-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) grafisch die Daten anzuzeigen, und berechnen Sie den IC50 Wert des PHA665752 in Anwesenheit von Gefitinib (Abb. 3 b).
- Bereiten Sie 6-12 Wiederholungen und wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal.
- Die Dual-Widerstand im MET1000 Zellen Gefitinib und PHA665752 zu etablieren.
- Kultur der MET1000 Zellen in p100 Gerichte mit 10 mL Wachstumsmedium und 1 µM Gefitinib in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Fügen Sie ein Zehntel des IC50 Wertes des PHA665752 in das Wachstumsmedium im Beisein von 1 µM von Gefitinib mit der gleichen Kulturbedingungen.
- Erhöhen Sie die PHA665752 Konzentration stufenweise um 10-30 % mit jeder Teilung bis 1 µM erreicht. Dies kann etwa 6 bis 12 Monate dauern.
Hinweis: Wenn die Konzentration der PHA665752 den IC50 Wert erreicht, die Zellproliferation wird deutlich langsamer, und also 2-4 ml Zellen ergänzt werden mit einer 1-mL-Pipettieren bis 10 mL des Mediums frisches Wachstum mit höheren Konzentration von PHA665752; Reduzierung der Erhöhung der Konzentration der PHA665752 könnte das Problem lösen. Darüber hinaus wäre es ideal, um die verbleibenden Zellen bei-80 ° C speichern und Wiederverwenden sie bei der vorherigen Konzentration. Es ist unnötig, Trypsin für Passagierung verwenden; während die Erhöhung der Konzentration der PHA665752, können jedoch die Zellen am unteren Rand der Kulturschale beifügen. In solchen Situationen kann ein Zelle-Schaber verwendet werden, um die Zellen zu lösen. - Zu guter Letzt Kultur der PC-9 Zellen resistent gegen Gefitinib und PHA665752 in das Wachstumsmedium mit jeweils 1 µM von Gefitinib und PHA665752 in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Führen Sie die MTT-Assay zur Bestätigung, dass die Zellen Dual-resistent gegen Gefitinib und PHA66575213 sindund sind nicht empfindlich gegen PHA665752 im Beisein von Gefitinib; Diese Dual-Widerstand Zellen hießen PC-9 DR (als Dr. Zellen bezeichnet) (Abbildung 5).
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Representative Results
Der Überblick über das Protokoll präsentiert in diesem Manuskript ist in Abbildung 1, einschließlich der Induktions von erworbenen Dual-Resistenz gegen Gefitinib und PHA665752 in den PC-9 Zellen durch eine 2-stufige Dosiseskalation Verfahren gezeigt. Abbildung 2 zeigt einen Rückgang bei der Verbreitung der elterlichen PC-9 Zellen als die Konzentration von Gefitinib erhöht. Dies bedeutet, dass die PC-9 Zellen empfindlich auf Gefitinib wurde, nachdem der Dosiseskalation Eingriff durchgeführt wurde. Abbildung 3 zeigt, dass PC-9MET1000 Zellen Resistenz gegen Gefitinib zeigen, aber empfindlich auf eine MET-TKI, PHA665752, im Beisein von Gefitinib reagieren. Die PC-9 Zellproliferation wurde unterdrückt, bei höheren Konzentrationen von Gefitinib, darauf hinweist, dass sie empfindlich auf Gefitinib waren. Aber zeigen PC-9MET1000 Zellen nicht geringere Verbreitung selbst bei hohen Konzentrationen von Gefitinib, darauf hinweist, dass sie Widerstand gegen Gefitinib erworben hatte. Als PC-9MET100 Zellen mit steigenden Konzentrationen von PHA665752 in das Vorhandensein oder Fehlen von Gefitinib für 72 h behandelt wurden, war seine Vermehrung ein MTT-Assay gemessen deutlich verringert. Es gab auch ein bescheidenen Rückgang der Verbreitung von PC-9MET1000 Zellen in der Abwesenheit von Gefitinib. Somit würde eine Kombination von Gefitinib und PHA665752 Zellproliferation effektiver als die Behandlung mit PHA665752 allein unterdrücken.
Abbildung 4 zeigt verstärkte MET (Proteine und RNA) in PC-9MET1000 und PC-9 DR Zellen; keine erworbenen Mutationen sind im EGFR und MET vorhanden. Daher ist die Entstehung von Bypass-Signalisierung als Ursache der erworbenen Resistenz gegen EGFR-TKI und/oder MET-TKI dringend empfohlen. Abbildung 5 zeigt den Widerstand der PC-9 DR Zellen zu PHA665752 im Beisein von 1 µM von Gefitinib, ein MTT-Assay gemessen. Obwohl die Verbreitung von PC-9MET1000 Zellen wurden durch Behandlung mit Gefitinib und PHA665752 gehemmt, überlebten PC-9 DR Zellen die Behandlung, die darauf hinweist, dass sie Dual-resistent gegen Gefitinib und PHA665752 waren. Somit durch eine 2-stufige Dosiseskalation Verfahren, PC-9 Zellen erworbene Resistenz zu Gefitinib und PC-9MET1000 Zellen erworbene Resistenz zu PHA665752 im Beisein von 1 µM von Gefitinib. Abbildung 6 zeigt die Anchorage-unabhängige Verbreitung MET1000 und DR Zellen in weichen Agar in das Vorhandensein oder Fehlen von PHA665752 und Gefitinib. Das Wachstum des PC-9MET1000 und PC-9 DR Zellen wurden beobachtet, auf weiche Agar, darauf hinweist, dass diese Verwandte in 2D und 3D Systeme wachsen konnte. So hatte beständig Verwandte die Haftungsbeschränkung nicht könnend in 2D Systeme wachsen überwinden. Darüber hinaus konnte PC-9 DR Zellen, aber nicht PC-9MET1000 Zellen in einem Agar mit 1 µM von Gefitinib und PHA665752 wachsen. Dieses Ergebnis zeigt, dass PC-9 DR Zellen resistent gegen Gefitinib und PHA665752 waren und im System sowie 3D Culture wachsen könnte. Die tumorigenic-Eigenschaft des etablierten beständig Verwandte sollte durch eine Kolonie-Bildung-Assay oder in Vivo Transplantation14überprüft werden.
Abbildung 1: Schema der Generierung von Dual-Widerstand: PC-9 DR Zellen aus PC-9 Zellen.
Diagramm zur Erzeugung von Dual-resistente Klone aus PC-9 Zellen durch eine Dosiseskalation 2-Schritt-Verfahren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: EGFR-TKI Gefitinib verhindert die Verbreitung von PC-9 Zellen.
PC-9 Zellen wurden in einer 96-Well-Platte 5 x 103 Zellen/Brunnen mit 50 µL Wachstumsmedium in jedes gut, vorab über Nacht inkubiert und dann mit Gefitinib in den angegebenen Konzentrationen für 72 h behandelt ausgesät. Ein MTT-Assay durchgeführt wurde und die OD-570 wurde gemessen, indem ein Mikrotestplatte Leser. Der IC50 Wert war 0,048 ± 0,01 µM. Daten sind als Mittelwert ± SEM für 6 Brunnen dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: PC-9MET1000 Zellen ausgestellt Widerstand gegen Gefitinib, aber Behandlung mit PHA665752 in Gegenwart von 1 µM von Gefitinib unterdrückt seine Vermehrung.
(A) PC-9 und MET1000 Zellen wurden ausgesät in 96-Well-Platten auf 5 x 103 Zellen/Brunnen mit 50 µL Wachstum mittelfristig in jedem gut, vorher über Nacht inkubiert und dann mit Gefitinib in den angegebenen Konzentrationen für 72 h behandelt (B) MET1000 Zellen wurden in einer 96-Well-Platte 5 x 103 Zellen/Brunnen mit das Wachstumsmedium in jede Vertiefung 50 µL ausgesät , vorher über Nacht inkubiert und dann in den angegebenen Konzentrationen in das Vorhandensein oder Fehlen von 1 µM von Gefitinib für 72 h mit PHA665752 behandelt. Ein MTT-Assay durchgeführt wurde und die OD-570 wurde gemessen, indem ein Mikrotestplatte Leser. Der IC50 Wert im Beisein von Gefitinib war 0.014 ± 0,01 µM zwar, dass in der Abwesenheit von Gefitinib nicht ermittelt wurde. Daten sind als Mittelwert ± SEM für 6 Brunnen dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: MET Verstärkung wurde keine erworbenen Mutationen im EGFR und MET in PC-9MET1000 und PC-9 DR Zellen beobachtet.
(A) Ausdruck Niveaus von Phosphor-MET und total getroffen wurden durch Western-Blot Analyse bestimmt. Β-Aktin diente als ein Steuerelement laden. (B) mRNA Transkripte von PC-9, PC-9MET1000 und PC-9 DR Zellen wurden mittels Real-Time RT-PCR und normiert mit der GAPDH quantifiziert. Daten werden im Vergleich zu PC-9 Werte dargestellt, da ± SEM bedeuten (n = 8). Statistischer Signifikanz wurde geschätzt, mit der zweiseitigen Student t-Test und ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. *, p < 0,05, im Vergleich mit der PC-9 Wert. (C) Exon 19-21 des EGFR-Gens und Exon 14-21 von Met-gen wurden aus genomischer DNA durch PCR verstärkt. PCR-Produkte wurden dann gereinigt und analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: PC-9 DR Zellen sind resistent gegen PHA665752 im Beisein von 1 µM von Gefitinib.
DR-Zellen wurden in einer 96-Well-Platte 5 x 103 Zellen/Brunnen mit 50 µL Wachstumsmedium in jede Vertiefung, vorab über Nacht inkubiert und dann mit PHA665752 behandelt, in den angegebenen Konzentrationen in Anwesenheit von 1 µM von Gefitinib für 72 h ausgesät. Ein MTT-Assay durchgeführt wurde und die OD-570 wurde gemessen, indem ein Mikrotestplatte Leser. Daten sind als Mittelwert ± SEM für 6 Brunnen dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Anchorage-unabhängige Verbreitung von PC-9MET1000 und PC-9 DR Zellen auf weiche Agar in das Vorhandensein oder Fehlen von PHA665752 und Gefitinib.
Zellen (1 × 104) wieder in 0,3 % Agar mit 10 % FBS in 6-Well-Platten vorbeschichtet mit 0,6 % weiche Agar ausgesät wurden suspendiert. Am nächsten Tag Zellen wurden behandelt mit Gefitinib (1 µM) und PHA665752 (1 µM) und dann für 14-21 Tage inkubiert. Kolonien waren voller Flecken mit 0,005 % Kristallviolett für 1 h Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll kann für die Einrichtung der erworbenen Dual-Resistenz in Krebszellen mit einer 2-stufigen Dosiseskalation Methode in Vitroverwendet werden. Viele Forschungsarbeiten haben berichtet, dass PC-9 Zellen EGFR-TKI (Gefitinib oder Erlotinib) Widerstand durch T790M EGFR-Mutationen-15,-16entwickelt. Allerdings wir nicht T790M Mutationen im Exon 20 unserer PC-9MET1000-Zellen durch direkte Sequenzierung (Abbildung 4) erkennen. Darüber hinaus wurde MET Verstärkung beobachtet, um als Bypass Signalweg zu handeln. PC-9MET1000 Zellen sind also extrem selten. Wir berichteten zuvor, dass Lunge Adenokarzinom PC-9 Zellen beherbergen eine 15-bp Deletion im Exon 19 von EGFR Gefitinib-Widerstand mit MET Verstärkung entwickelte nach kontinuierlicher schrittweiser Dosissteigerung, für 12 Monate durchgeführt wurde, bis die Dosis 1 µM (PC-9MET1000-Zellen genannt)17erreicht. Diese Zelllinie wurde empfindlich auf eine MET-TKI in Anwesenheit von Gefitinib. Ermittlung den Mechanismus hinter Widerstand, EGFR und MET-TKIs wurde eine kontinuierliche schrittweise Dosissteigerung Methode entwickelt, um Dual-Widerstand zur MET-TKI, PHA665752 und EGFR-TKI, Gefitinib in PC-9MET1000 Zellen12induzieren. Diese Methode stützte sich auf die Ergebnisse einer klinischen Studie, das Fortschreiten der Krankheit hinaus Gefitinib Behandlung zu studieren. Bei MET verstärkt EGFR-TKI-Resistenz würde ein einziger MET-Inhibitor nicht deutlich die Zellproliferation hemmen. Da die Signalübertragung zwischen den Rezeptor und die nachgelagerten Moleküle sind getrennt (EGFR-ERK1/2 und MET-AKT), die kombinierten Unterdrückung der EGFR und MET erforderlich wären. In einer anderen Lunge Adenokarzinom Zelllinie wurde HCC827, die auch eine EGFR-Mutation, EGFR-TKI-Resistenz birgt durch MET Verstärkung entwickelt. Suda Et Al. berichtet, dass HCC827 Zellen ausgesetzt zu steigenden Konzentrationen von Erlotinib in Anwesenheit von MET-TKI PHA665752 entwickelt Resistenz gegen MET-TKI und EGFR-TKI18. Darüber hinaus werden klinische Studien durchgeführt, um Fälle von MET-Verstärkung mit EGFR-TKI-Resistenz zu studieren. So, um den Mechanismus der erworbenen MET-TKI-Resistenz nach der Behandlung mit EGFR-TKI zu untersuchen, ist es notwendig, Dual-Widerstand zur MET-Inhibitoren und EGFR-Inhibitoren induzieren.
Das Protokoll beschrieben hier beteiligten schrittweise Dosis-Eskalation der MET-TKI, PHA665752, im Beisein von 1 µM von Gefitinib. Die schrittweise Dosissteigerung-Methode ist die zuverlässigste und am häufigsten verwendete Methode18,19. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist den IC50 Wert des Inhibitors erhalten. Wenn dieser Wert nicht genau bestimmt ist, werden die Zellen nicht überhaupt in der Kulturschale wachsen. Daher, wenn das Zellwachstum zu verlangsamen beginnt, könnte Verringerung der Erhöhung der Konzentration des Inhibitors das Problem lösen. Außerdem, wenn die Zellen zu sterben beginnen, wäre es ideal, um die verbleibenden Zellen bei-80 ° C zu speichern, um sie bei der vorherigen Konzentration wiederzuverwenden.
Eine alternative Methode für den Aufbau von Widerstand in Zell-Linien ist die hoch-Konzentration Belichtungsmethode, in der die Zellen die Zielkonzentration des Inhibitors direkt ausgesetzt sind und die Zellen werden kultiviert, bis die Überlebenden resistenten Zellen wuchern beginnen. Obwohl diese Methode mehr klinisch relevant ist, hat es eine niedrigere Erfolgsrate, weil die Zielkonzentration des Inhibitors, die zunächst verwaltet wird, die elterliche Zellen sofort töten könnte. Interessanterweise wurde berichtet, dass resistente Verwandte erhalten durch diese beiden Methoden unterschiedlichen zellulären Eigenschaften19,20aufweisen.
Eine weitere Methode zur Ermittlung der Resistenz ist die in-Vivo Widerstand Methode, in der eine Zellsuspension (1,0 × 106-2.0 × 107) in die Flanken von Mäusen injiziert wird und wenn der Tumor ein Volumen von 200 mm3erreicht, die Mäuse sind unterworfen, kontinuierliche Behandlung mit Inhibitoren. Tumoren, die vollständig zu reagieren und dann wiederkehren während gepflegt Therapie sind geerntet, gehackt, mit Trypsin, verdaut und dann gefiltert und auf Kultur Gerichte ausgesät. Diese Methode kann zwar etwas kompliziert, effektiv in Antikörper-Resistenzen verwendet. Aber nicht wenn die Tumoren, die zeigen Widerstand im in-Vivo -System werden zu einem in-vitro- System, die Zellen manchmal übertragen 2D Kultur-Systeme wachsen. 3D Culture-Systeme wie z. B. eine Basalmembran Matrix sollte daher gebrauchte21.
Obwohl alle drei dieser Methoden eine relativ lange Zeit erfordern durchzuführen, ist die schrittweise Dosissteigerung Methode die wirtschaftlichste. Es ist auch die am besten geeignete Methode für eindeutig verstehen und den Prozess des Erwerbs von Inhibitor-Resistenz zu studieren. Darüber hinaus ist die Erfolgsquote der anderen beiden Methoden deutlich geringer als die der schrittweisen Dosissteigerung Methode.
Sobald der Widerstand besteht, ist es notwendig, die tumorigenic Potenz dieser Zelllinien zu testen. Kolonie Bildung Tests oder in Vivo Transplantationen werden häufig für diesen Zweck (Abbildung 6) eingesetzt. Diese Methoden können den Nachteil der Verwendung 2D Kultur-Systeme überwinden.
Eine große Einschränkung dieser Methoden ist, dass Zellen mit erworbene Resistenz oft nicht genau den Widerstand in menschlichen Krebszellen widerspiegeln. Daher sollte die Mechanismen entdeckt durch Studien in in-vitro- Modelle in menschlichen Gewebeproben durch wiederholte Tests in Biopsie Proben bestätigt werden. Darüber hinaus, obwohl diese Protokolle für die Prüfung der Mechanismus hinter erworbene Resistenz bei der Entwicklung von Tumorzellen nützlich sein könnten, ist es möglich, dass die erworbene Resistenz durch Veränderungen der Mikroumgebung Tumor induziert wurde. Dies ist eine weitere schwere Einschränkung der Untersuchung der Wirksamkeit dieser Protokolle in nur Krebszellen. Es wäre besser, Gewebe aus menschlichem Gewebebanken zu verwenden, die verfügbar sind für viele Forscher.
Die hier vorgestellten Protokoll kann geändert werden, für den Widerstand gegen andere molekulare Inhibitoren sowie Aufbau. Daher ist diese Methode möglicherweise nützlich für die Entwicklung von therapeutischen Werkzeuge um Krebs in der Zukunft zu steuern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Wir danken die Mitgliedern des Instituts für Molekulare Onkologie für ihre nachdenklichen Kommentaren und hilfreiche Ratschläge und Editage für ihre Unterstützung mit englischer Sprache bearbeiten. Diese Arbeit wurde von MEXT-unterstütztes Programm für strategische Forschungsgemeinschaft an privaten Hochschulen (2012-2016) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan unterstützt. Tohru Ohmori erhielt Forschungsförderung (2015-2016) von Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Deutschland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
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