Summary
En i vitro metode for å etablere to motstand mot en EGFR-TKI og en MET-TKI i kreftcellene er beskrevet. Denne metoden er nyttig for utvikle behandlinger for pasienter med EGFR-mutasjoner, som viser sykdomsprogresjon til tross for EGFR-TKI behandling med MET-forsterkning. Det kan også endres for hemmere målretting andre molekyler.
Abstract
Resistens er en stor utfordring i kreft terapi. Generering av motstandsdyktig sublines i vitro er nødvendig for å oppdage nye mekanismer for å mestre denne utfordringen. Her, en 2-trinns doseopptrapping metode for å etablere to-motstand mot en epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)-tyrosin kinase inhibitor (TKI), gefitinib og en MET-TKI, PHA665752, er beskrevet. Denne metoden er basert på enkel gradvis doseopptrapping av hemmere for å indusere ervervet motstand i linjer. Den alternative metoden for å generere motstandsdyktig sublines innebærer utsette cellene for høye konsentrasjoner av hemmer i ett trinn. Gradvis doseopptrapping metoden har en høyere muligheten for vellykket inducing ervervet motstand enn denne metoden. Aktivere EGFR er mutasjoner biomarkers av en respons på behandling med EGFR-TKI, som er en brukt første linje behandling for ikke-småcellet lungekreft kreft (NSCLC) som havn disse mutasjonene. Men til tross for rapporter av effektive tiltak er bruk av EGFR-TKI begrenset fordi svulster uunngåelig erverve motstand. Store mekanismene bak EGFR-TKI motstand inkluderer en sekundær mutasjon på gatekeeper området, T790M i ekson 20 av EGFR og et omkjøringsvei signal på MET. Dermed vil en mulig løsning for dette problemet være en kombinasjon av EGFR-TKI og MET-TKI. Denne kombinerte behandlingen har vist seg å være effektive i en i vitro studier modell. Ervervet gefitinib-motstand ble etablert gjennom MET-forsterkning av gradvis doseopptrapping av gefitinib 12 måneder, og en celle linje kalt PC-9MET1000 ble generert i en tidligere studie. For ytterligere å undersøke mekanismene av ervervet MET-TKI og EGFR-TKI ble motstand, en MET-TKI, PHA665752, gitt til disse cellene med gradvis doseopptrapping i nærvær av gefitinib i 12 måneder. Denne protokollen har også vært anvendt for en rekke kombinasjon terapi for å etablere ervervet motstand mot andre hemmer molekyler.
Introduction
Kreftfremkallende mutasjoner i epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) finnes i et delsett av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og er viktig prediktiv biomarkers av denne sykdommen1,2. Disse aktivering EGFR mutasjoner oftest opptrer som en i-ramme sletting i ekson 19 (delE746-A750) eller en punkt mutasjon erstatte leucine med arginine på codon 858 av ekson 21 (L858R) i EGFR tyrosin kinase domene3,4. Behandling med EGFR-tyrosin kinase hemmere (TKIs) er en klinisk effektiv terapi for pasienter med NSCLC skjuler EGFR mutasjoner. Men er denne behandlingen begrenset av uunngåelig oppkjøpet av motstand mot EGFR-TKIs som gefitinib og erlotinib. Den vanligste ervervede motstanden skjer via en sekundær T790M mutasjon i ekson 20 av EGFR, som ble oppdaget i ca 60% av pasienter som fikk EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) motstand. Andre molekylære mekanismer knyttet ervervet motstand mot EGFR-TKIs er aktivisering omkjøringsvei signalnettverk forårsaket av MET forsterkning, transformasjonen av småcellet lunge kreft og epithelial til mesenchymal overgang5,6. Reseptoren for hepatocyte vekst faktor, kodet av MET genet, som er dysregulatedin mange svulster, har blitt rapportert å være en viktig kandidat for målrettet terapi7,8.
Strategier for å overvinne ervervet motstanden mot EGFR-TKIs er nå under klinisk evaluering. Prekliniske og kliniske studier har vist at tredjegenerasjons EGFR hemmere som osimertinib er effektivt for pasienter med T790M mutasjon9. I tillegg kan veksten av EGFR-mutant kreft med MET forsterkning bli hemmet av kombinert behandling med EGFR og MET TKIs6,10. Kliniske studier vurdere en kombinasjon av MET og EGFR hemmere hos pasienter med ervervet motstand mot gefitinib og erlotinib er i gang nå11.
For å studere molekylære mekanisme ervervet motstand mot chemotherapeutic agenter, behandles linjer som først svare hemmere kontinuerlig med disse hemmere. To metoder er tilgjengelig å etablere ervervet motstand i linjer. En er gradvis doseopptrapping, og den andre er high-konsentrasjon eksponering. Metoden gradvis opptrapping har blitt mer vanlig, fordi den har en høyere suksessrate. Cellene først utsatt til lave konsentrasjoner av hemmere, nesten en tidel av halv maksimal inhibitoriske konsentrasjon (IC50) verdien, og konsentrasjonen er deretter gradvis økt med 10-30% til målet konsentrasjonen er oppnådd. Den høye-Konsentrasjon eksponering metoden innebærer utsette cellene til siste dose av hemmer i kultur medium, som er mer enn verdien for IC-50 , så foreldre cellene er nesten helt drept. Denne høy-konsentrasjon eksponering metoden har mye en lavere suksessrate enn metoden gradvis opptrapping.
I en tidligere studie viste kombinert behandling med EGFR-TKI og MET-TKI seg å være effektive i en i vitro system. Ervervet motstand mot en EFGR-TKI, gefitinib, ble etablert gjennom gradvis Opptrapping i 12 måneder, sammen med MET forsterkere, og dermed en gefitinib-resistente cellen linje som kalles PC-9MET1000 ble generert12.
Protokollen presenteres her er en totrinns doseopptrapping prosedyre for å få EGFR-mutert NSCLC PC-9 celler med dobbel motstand mot EGFR-TKI, gefitinib og en MET-TKI, PHA665752 (figur 1). Denne metoden for å etablere ervervet motstandsdyktig i linjer er relativt lett å utføre, med høy suksessrate. Beskrevet protokollen kan endres for programmet med hemmere av andre molekylære mål narkotika og cytotoksiske agenter også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. etablere Gefitinib-resistente celler
- Bestemme første gefitinib konsentrasjonen av 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysen.
- Kultur PC-9 celler i vekst medium (RPMI-1640 medium med 10% FBS og 1% antibiotika (penicillin: 100 U/mL og streptomycin: 100 µg/mL)), i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Justere cellene 1.0 × 105 celler/mL ved å bruke en automatisert celle counter (se tabell av materialer) og frø 50 µL av dette i hver brønn av en 96-brønns plate med vekstmediet; siste konsentrasjonen av celler skal 5.0 × 103 celler/godt.
- Inkuber platen overnatting på 37 ° C.
- Legge til 50 µL av gefitinib (på 2 X siste konsentrasjon) i ulike konsentrasjoner: 0, 0,002, 0.006, 0,02, 0.06, 0,2, 0,6, 2, 6 og 20 µM til disse brønnene slik at det siste bindet i hvert tillegg er 100 µL.
- Inkuber platen i 72 h på 37 ° C.
- Legge til 15 µL av fargestoff løsningen (se Tabell for materiale) i hver brønn (bruk siste 13% konsentrasjon av fargestoff løsningen), og Inkuber 4 h på 37 ° C.
- Legge til 100 µL av solubilization/stopp løsning (se Tabell for materiale) for solubilizing formazan produsert av fargestoff løsningen (se Tabell for materiale) i hver vel og ruge det overnatting på 37 ° C.
- Måle optisk densitet ved 570 nm (OD570) bruker en microplate-leser for å få IC50 verdien ved å generere en celle spredning kurve.
- Bruke en statistisk programvare (se Tabell for materiale) å grafisk vise data og beregne IC50 verdien (figur 2).
- Forberede 6-12 gjentak gjenta eksperimenter minst tre ganger.
- Kontinuerlig gradvis doseopptrapping av gefitinib for behandling av PC-9 celler.
- Kultur PC-9 celler (1 mL i sub confluent tilstand) i p100 retter med 10 mL av vekstmediet i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Legge til en tidel av IC50 verdien av gefitinib til p100 parabolen.
- Når cellene i kultur mediet blir sub confluent, kan du legge til 1-2 mL av celler i 10 mL av fersk oppblomstringen medium med en 1-mL Pipetter med 10-30% høyere konsentrasjon av gefitinib i samme kultur vilkår.
- Øke gefitinib konsentrasjonen gradvis med 10-30% hver deling til den når 1 µM; Dette kan ta om 6-12 måneder.
Merk: Når konsentrasjonen av gefitinib når IC50 verdien, celle spredning blir betydelig tregere, og så, 2-4 mL celler kan legges til 10 mL av fersk vekstmediet med høyere konsentrasjon av gefitinib; redusere økning i konsentrasjonen av gefitinib kan løse problemet. Dessuten, det ville være ideelt å lagre de gjenværende cellene ved-80 ° C og bruke dem på tidligere konsentrasjonen. Som PC-9 celler i suspensjon, er det unødvendig å bruke trypsin for passaging; men under prosessen med å øke gefitinib konsentrasjon, fester cellene til bunnen av kultur parabol. I en slik situasjon, kan en celle-skraper brukes for å demontere tilhenger cellene. - Kultur gefitinib-resistente PC-9 cellene i vekstmediet med 1 µM av gefitinib.
- Utføre MTT analysen for å bekrefte gefitinib-motstanden av celler13; disse gefitinib-resistente celler ble kalt PC-9MET1000 (betegnet som MET1000 celler), fordi de utstilt økt protein og RNA nivåer av MET (figur 3A, figur 4A, B).
2. opprette Dual-motstand mot Gefitinib og PHA665752
- Bestemme første konsentrasjonen av PHA665752 av MTT analysen.
- Kultur i MET1000 celler i p100 retter med 10 mL vekst medium og 1 µM gefitinib i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Frø cellene i en 96-brønns plate 5.0 × 103 celler/godt med 50 µL av vekstmediet i hver brønn. Justere siste konsentrasjonen av cellene til 1.0 × 105 celler/mL med et automatisert cellen counter (se Tabell for materiale).
- Inkuber platen overnatting på 37 ° C.
- Legge til 50 µL av PHA665752, en MET-TKI (på 2 X siste konsentrasjon), til cellene i ulike konsentrasjoner: 0, 0,002, 0.006, 0,02, 0.06, 0,2, 0,6, 2, 6 og 20 µM inkludert 2 µM gefitinib (på 2 X siste konsentrasjon). det siste bindet i hver brønn skal 100 µL.
- Inkuber platen i 72 h på 37 ° C.
- Legge til 15 µL av fargestoff løsningen (se Tabell of Materials) til hver vel og ruge 4 h på 37 ° C.
- Legge 100 µL av solubilization/stopp løsning for solubilizing formazan produsert av fargestoff løsningen (se Tabell of Materials) til hver flott og ruge over natten på 37 ° C.
- Måle optisk densitet ved 570 nm (OD570) bruker en microplate-leser for å få IC50 verdien ved å generere en celle spredning kurve.
- Bruke en statistisk programvare (se Tabell for materiale) å grafisk vise data og beregne IC50 verdien av PHA665752 i nærvær av gefitinib (figur 3B).
- Forberede 6-12 gjentak gjenta eksperimenter minst tre ganger.
- Opprette dual-motstanden i MET1000 celler til gefitinib og PHA665752.
- Kultur i MET1000 celler i p100 retter med 10 mL av oppblomstringen medium og 1 µM gefitinib i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Legge til en tidel av IC50 verdien av PHA665752 til vekst medium i nærvær av 1 µM av gefitinib med samme kultur vilkår.
- Øke PHA665752 konsentrasjonen gradvis med 10-30% hver deling før den når 1 µM. Dette kan ta om 6-12 måneder.
Merk: Når konsentrasjonen av PHA665752 når IC50 verdien, celle spredning blir betydelig tregere, og så, 2-4 ml celler kan legges ved hjelp av en 1-mL Pipetter til 10 mL av fersk vekstmediet med høyere konsentrasjon av PHA665752; redusere økning i konsentrasjonen av PHA665752 kan løse problemet. Dessuten, det ville være ideelt å lagre de gjenværende cellene ved-80 ° C og bruke dem på tidligere konsentrasjonen. Det er unødvendig å bruke trypsin for passaging; men under økningen av PHA665752 konsentrasjon fester cellene til bunnen av parabolen kultur. I slike situasjoner, kan celle-skraper brukes til å koble cellene. - Til slutt, kultur på PC-9 celler motstandsdyktig mot både gefitinib og PHA665752 i vekst medium med 1 µM hver gefitinib og PHA665752 i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Utføre MTT analysen for å bekrefte at cellene er dobbelt-resistente mot gefitinib og PHA66575213, og at de ikke er følsom for PHA665752 i nærvær av gefitinib; disse dual-motstand cellene ble kalt PC-9 DR (betegnet som DR celler) (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversikt over protokollen presentert i dette manuskriptet er vist i figur 1, inkludert induksjon av ervervet dual-motstand mot gefitinib og PHA665752 i PC-9 celler av en 2-trinns doseopptrapping. Figur 2 viser en nedgang i spredning av foreldrenes PC-9 celler som konsentrasjonen av gefitinib øker. Dette indikerer at PC-9 cellene ble følsomme for gefitinib etter doseopptrapping prosedyren ble utført. Figur 3 viser at PC-9MET1000 celler viser motstand mot gefitinib, men er følsomme for en MET-TKI, PHA665752, i nærvær av gefitinib. PC-9 celle spredning ble undertrykt på høyere konsentrasjoner av gefitinib, som indikerer at de var følsom for gefitinib. Imidlertid vise PC-9MET1000 celler ikke redusert spredning på høye konsentrasjoner av gefitinib, som indikerer at de hadde kjøpt motstand mot gefitinib. Når PC-9MET100 celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av PHA665752 i tilstedeværelse eller fravær av gefitinib 72 h, ble sin spredning, målt ved en MTT-analysen, betydelig redusert. Det var også en beskjeden nedgang i spredning av PC-9MET1000 celler i fravær av gefitinib. Således, en kombinasjon av gefitinib og PHA665752 undertrykker celle spredning mer effektivt enn behandling med PHA665752 alene.
Figur 4 viser forsterket nivåer av MET (protein og RNA) i PC-9MET1000 og PC-9 DR celler. ingen ervervet mutasjoner er i EGFR og MET. Derfor er fremveksten av omkjøringsvei signalnettverk svært foreslått som en årsak til ervervet motstanden mot EGFR-TKI og/eller MET-TKI. Figur 5 viser motstanden av PC-9 DR celler til PHA665752 i nærvær av 1 µM av gefitinib, målt ved en MTT-analysen. Selv om spredning av PC-9MET1000 celler ble hemmet av behandling med gefitinib og PHA665752, overlevd PC-9 DR celler behandling, som indikerer at de var dobbelt-motstandsdyktig mot gefitinib og PHA665752. Dermed gjennom en 2-trinns doseopptrapping prosedyre, PC-9 celler ervervet motstand mot gefitinib og PC-9MET1000 celler ervervet motstand mot PHA665752 i nærvær av 1 µM av gefitinib. Figur 6 viser anchorage uavhengig spredning MET1000 og DR celler i myk agar i tilstedeværelse eller fravær av PHA665752 og gefitinib. Veksten av både PC-9MET1000 og PC-9 DR celler ble observert på myke agar, indikerer at disse sublines kan vokse i både 2D og 3D. Derfor hadde de resistente sublines overvinne begrensningen av ikke å kunne vokse i 2D systemer. Videre PC-9 DR celler, men ikke PC-9MET1000 celler, kan vokse i en agar med 1 µM gefitinib og PHA665752. Resultatet indikerer at PC-9 DR celler var resistente mot både gefitinib og PHA665752, og kan vokse i en 3D kultur-systemet også. Egenskapen tumorigenic for de etablerte motstandsdyktig sublines bør kontrolleres av en koloni formasjon analysen eller i vivo transplantasjon14.
Figur 1: Skjemaet genererer dual-motstand: PC-9 DR celler fra PC-9 celler.
Diagrammet for å generere dual-resistente kloner fra PC-9 celler av en 2-trinns doseopptrapping. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: EGFR-TKI gefitinib hemmet spredning av PC-9 celler.
PC-9 celler var frø i en 96-brønns plate på 5 x 103 celler/godt med 50 µL av vekstmediet i hver brønn, pre ruges over natten, og deretter behandles med gefitinib i de angitte konsentrasjonene 72 h. MTT analysen ble utført og OD570 ble målt ved en microplate leser. IC50 verdien var 0.048 ± 0,01 µM. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM 6 brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: PC-9MET1000 celler utstilt motstand mot gefitinib, men behandling med PHA665752 i nærvær av 1 µM av gefitinib undertrykt spredningen sin.
(A) PC-9 og MET1000 celler ble sådd i 96-brønnen platene på 5 x 103 celler/godt med 50 µL av vekst medium i hver Vel, pre ruges over natten, og deretter behandles med gefitinib i de angitte konsentrasjonene for 72 h. (B) MET1000 celler var frø i en 96-brønns plate på 5 x 103 celler/godt med 50 µL av vekstmediet i hver brønn , pre ruges over natten, og deretter behandles med PHA665752 i de angitte konsentrasjonene i tilstedeværelse eller fravær av 1 µM av gefitinib 72 h. MTT analysen ble utført og OD570 ble målt ved en microplate leser. IC50 verdien i nærvær av gefitinib var 0.014 ± 0,01 µM, mens det i fravær av gefitinib ikke ble fastsatt. Dataene vises i gjennomsnittlig ± SEM 6 brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: MET forsterkning ble observert i PC-9MET1000 og PC-9 DR celler uten ervervet mutasjoner i EGFR og MET.
(A) uttrykk nivåer av fosfor-MET og total MET ble fastsatt av Western blot analyse. Β-utgangen ble brukt som en lasting. (B) mRNA transkripsjoner fra PC-9, PC-9MET1000 og PC-9 DR kvantifisert bruker sanntid RT PCR og normalisert med at av GAPDH. Dataene presenteres i forhold til PC-9 verdier, som betyr ± SEM (n = 8). Statistisk betydning ble beregnet ved hjelp av tosidige Student t-test, og en p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. *, p < 0,05, sammenlignet med PC-9 verdien. (C) ekson 19-21 av EGFR genet og ekson 14-21 av Met genet ble forsterket fra genomisk DNA av PCR. PCR produkter var så renset og analysert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: PC-9 DR celler er motstandsdyktig mot PHA665752 i nærvær av 1 µM av gefitinib.
DR celler var frø i en 96-brønns plate på 5 x 103 celler/godt med 50 µL av vekstmediet i hver brønn, pre ruges over natten, og deretter behandles med PHA665752 på de angitte konsentrasjonene i nærvær av 1 µM av gefitinib 72 h. MTT analysen ble utført og OD570 ble målt ved en microplate leser. Dataene vises i gjennomsnittlig ± SEM 6 brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Anchorage uavhengig spredning av PC-9MET1000 og PC-9 DR celler på myke agar i tilstedeværelse eller fravær av PHA665752 og gefitinib.
Celler (1 × 104) re suspendert i 0,3% agar med 10% FBS ble sådd i 6-vel platene pre-belagt med 0,6% myk agar. Dagen celler ble behandlet med gefitinib (1 µM) og PHA665752 (1 µM) og deretter ruges i 14-21 dager. Koloniene ble farget med 0.005% crystal violet for 1 h. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her kan brukes for etablering av ervervet dual-motstand i kreftceller ved hjelp av en 2-trinns doseopptrapping metoden i vitro. Mange forskningsartikler har rapportert at PC-9 celler utviklet EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) motstand gjennom T790M EGFR mutasjoner15,16. Men finner vi T790M mutasjoner i ekson 20 av våre PC-9MET1000 celler av direkte sekvensering (figur 4C). Videre ble MET forsterkning observert for å fungere som en bypass signalveien. Dermed er PC-9MET1000 celler svært sjeldne. Vi har tidligere rapportert at lunge adenocarcinoma PC-9 celler skjuler en 15-bp sletting i ekson 19 av EGFR utviklet gefitinib-motstand med MET forsterkning etter kontinuerlig gradvis doseopptrapping ble utført i 12 måneder før dosen nådde 1 µM (kalt PC-9MET1000 celler)17. Cellen var følsom for en MET-TKI i nærvær av gefitinib. For å fastslå mekanismen bak motstand til EGFR - og MET-TKIs, ble en kontinuerlig gradvis doseopptrapping metoden utviklet for å indusere dual-motstand MET-TKI, PHA665752 og EGFR-TKI, gefitinib, PC-9MET1000 celler12. Denne metoden basert på resultatene av en klinisk utprøving å studere progresjon av sykdommen utover gefitinib behandling. I tilfelle av MET-forsterket EGFR TKI-motstand, ville en enkelt MET hemmer ikke betydelig hemmer celle spredning. Fordi signaltransduksjon mellom reseptoren og nedstrøms molekylene er separert (EGFR-ERK1/2 og MET-AKT), kombinerte undertrykkelse av EGFR og MET ville være nødvendig. I en annen lunge adenocarcinoma cellen linje, ble HCC827, som også en EGFR mutasjon, EGFR-TKI motstand utviklet gjennom MET forsterkning. Suda et al. rapportert at HCC827 celler utsatt for økende konsentrasjoner av erlotinib i nærvær av MET-TKI PHA665752 utviklet motstand til MET-TKI og EGFR-TKI18. Videre blir kliniske forsøk utført for å studere tilfeller av MET-forsterkning med EGFR-TKI-motstand. Derfor undersøke mekanisme ervervet MET-TKI motstand etter behandling med EGFR-TKI, er det nødvendig å indusere dual-motstand mot MET hemmere og EGFR hemmere.
Protokollen beskrevet her involvert gradvis dose-opptrapping av en MET-TKI, PHA665752, i nærvær av 1 µM av gefitinib. Gradvis doseopptrapping metoden er den sikreste og mest brukte metoden18,19. Det viktigste trinnet i denne protokollen er å få IC50 verdien av inhibitor. Hvis denne verdien ikke er nøyaktig bestemt, ikke cellene vokse hele i kultur parabolen. Derfor, hvis cellen veksten begynner å avta, redusere økning i konsentrasjonen av inhibitor kan løse problemet. Videre, hvis cellene begynner dø, det ville være ideelt å lagre de gjenværende cellene ved-80 ° C, for å bruke dem på tidligere konsentrasjonen.
En alternativ metode for å etablere motstand i linjer er metoden høy-konsentrasjon eksponering som cellene er utsatt for målet konsentrasjonen av inhibitor direkte, og cellene er kultivert til gjenlevende motstandsdyktig cellene begynner voksende. Selv om denne metoden er mer klinisk relevante, har en lavere suksessrate fordi målet konsentrasjonen av inhibitor, som administreres først, kan drepe alle foreldre cellene umiddelbart. Interessant, har det blitt rapportert at motstandsdyktig sublines fra disse to metodene viser ulike mobilnettet egenskaper19,20.
En annen metode for å etablere motstand er i vivo motstand metoden der en celle suspensjon (1.0 × 106-2.0 × 107) injiseres i flanken av mus, og når svulsten når et volum på 200 mm3, musene utsettes for sammenhengende behandling med hemmere. Svulster som reagerer helt og deretter gjentas under opprettholdt terapi er høstet, hakket, fordøyd med trypsin, filtrert og seeded på kultur retter. Denne metoden, selv om litt komplisert, kan brukes effektivt i tilfeller av antistoff-motstand. Men når svulster som viser motstand i systemet i vivo overføres til en in vitro -system celler noen ganger ikke klarer å vokse 2D kultur systemer. Derfor skal 3D kultur systemer som en kjeller membran matrise brukes21.
Selv om alle tre av disse metodene krever relativt lang tid å utføre, vil gradvis doseopptrapping metoden er den mest økonomiske. Det er også den mest passende metoden for tydelig forstå og studere prosessen med å anskaffe inhibitor-motstand. I tillegg er suksessrate på de to andre metodene betydelig lavere enn metoden gradvis doseopptrapping.
Når motstanden er opprettet, er det nødvendig å teste tumorigenic styrken på disse linjer. Kolonien formasjon tester eller i vivo transplantasjoner er ofte ansatt for dette formålet (figur 6). Disse metodene kan overvinne ulempen ved å bruke 2D kultur systemer.
En stor begrensning av disse metodene er at celler med ervervet motstand ofte ikke nøyaktig gjenspeiler motstanden i menneskelige celler. Derfor skal mekanismer oppdaget gjennom studier i vitro modeller bekreftes menneskelige vevsprøver gjennom gjentatte tester i biopsi prøver. Dessuten, selv om disse protokollene kan være nyttig for å undersøke mekanismen bak ervervet motstand under utviklingen av kreftceller, er det mulig at ervervet motstanden var forårsaket av endringer av svulst microenvironment. Dette er en alvorlig begrensning å undersøke effekten av disse protokollene i bare kreftceller. Det ville være bedre å bruke vev fra menneskelig vev banker, som er tilgjengelig for mange forskere.
Protokollen presenteres her kan endres for å etablere motstand mot andre molekylære hemmere også. Denne metoden er derfor potensielt nyttig for utvikle terapeutiske verktøy for å kontrollere kreft i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Institutt for molekylær onkologi for sine gjennomtenkte kommentarer og nyttige råd, og Editage for deres hjelp med engelsk redigering. Dette arbeidet ble støttet av programmet MEXT støttes for strategisk Research Foundation ved Private universiteter (2012-2016) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Tohru Ohmori mottatt forskningsmidler (2015-2016) fra Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Tyskland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
