Cancer Research

Om dubbla motstånd mot EGFR-TKI och träffade-TKI i lunga adenokarcinom celler In Vitro med en 2-stegs-dosupptrappning procedur

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55967

Toshimitsu Yamaoka¹, Motoi Ohba¹, Satoru Arata^1,2, Tohru Ohmori¹

¹Institute of Molecular Oncology, Showa University, ²Center for Biotechnology, Showa University

Summary

En in vitro- Metod för fastställande av dubbla motstånd mot en EGFR-TKI och en MET-TKI i cancerceller beskrivs. Denna metod är användbar för att utveckla behandlingar för patienter med EGFR-mutationer, som uppvisar sjukdomsprogress trots EGFR-TKI behandling med MET-förstärkning. Det kan också ändras för hämmare inriktning andra molekyler.

Abstract

Resistens är en stor utmaning i cancerbehandling. Generering av resistenta segmenten i vitro är nödvändigt för att upptäcka nya mekanismer att övervinna denna utmaning. Här, en 2-stegs-dosupptrappning metod för fastställande av dual-motstånd mot en epidermal tillväxtfaktor (EGFR)-tyrosinkinashämmare (TKI), gefitinib och en MET-TKI, PHA665752, beskrivs. Denna metod bygger på Enkel stegvis dosökning av hämmare för att inducera förvärvad resistens i cellinjer. Den alternativa metoden för att skapa resistenta segmenten innebär att utsätta celler till höga koncentrationer av hämmaren i ett steg. Metoden stegvis dosökning har en högre möjligheten att framgångsrikt inducerande förvärvad resistens än denna metod. Aktivera EGFR är mutationer biomarkörer för ett svar på behandling med EGFR-TKI, som är en tillämpad första linjens behandling för icke-small cell lung cancer (NSCLC) som hyser dessa mutationer. Men trots rapporter om effektiva svar är användning av EGFR-TKI begränsad eftersom tumörer oundvikligen förvärva motstånd. De viktigaste mekanismerna bakom EGFR-TKI motstånd inkluderar en sekundär mutation på webbplatsen gatekeeper, T790M i exon 20 av EGFR och en bypass signal om marknadsekonomisk status. En möjlig lösning på problemet skulle således vara en kombination av EGFR-TKI och MET-TKI. Denna kombinerade behandling har visat sig vara effektivt i en in vitro- studie modell. Förvärvad gefitinib-resistens inrättades genom MET-förstärkning av stegvis-upptrappning av dosen av gefitinib i 12 månader, och en cellinje som heter PC-9MET1000 skapades i en tidigare studie. För att ytterligare undersöka mekanismer förvärvade MET-TKI och EGFR-TKI administrerades motstånd, en MET-TKI, PHA665752, till dessa celler med stegvis dosökning i närvaro av gefitinib i 12 månader. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats även för ett antal kombinationsbehandlingar att upprätta förvärvad resistens mot andra hämmare molekyler.

Introduction

Onkogena mutationer i den epidermal tillväxtfaktor (EGFR) finns i en undergrupp av patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och är viktiga Prediktiva biomarkörer för denna sjukdom¹^,². Dessa aktiverande EGFR-mutationer vanligast förekomma antingen som en i-frame borttagning i exon 19 (delE746-A750) eller en punktmutation som ersätter leucin med arginin vid kodon 858 av exon 21 (L858R) i EGFR tyrosin Kinas domän³^,⁴. Behandling med EGFR-tyrosinkinashämmare (TKI) är en kliniskt effektiv terapi för patienter med NSCLC härbärgerat EGFR-mutationer. Denna behandling är dock begränsad av oundvikliga förvärvet av resistens mot EGFR-TKI såsom gefitinib och erlotinib. Den vanligaste förvärvad resistens uppstår genom en sekundär T790M mutation i exon 20 av EGFR, som upptäcktes i cirka 60% av patienterna som förvärvat EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) motstånd. Andra molekylära mekanismer som är associerad med förvärvad resistens mot EGFR-TKI är aktivering av bypass signalering orsakas av MET amplifiering, omvandling av små-cellig lung cancer och epitelial-till-mesenkymala övergången⁵^,⁶. Receptorn för hepatocyte tillväxtfaktorn, kodas av genen MET, som är dysregulatedin många tumörer, har rapporterats vara en viktig kandidat för riktade terapier⁷^,⁸.

Strategier för att övervinna den förvärvad resistensen mot EGFR-TKI nu genomgår klinisk utvärdering. Prekliniska och kliniska studier har visat att tredje generationens EGFR-hämmare såsom osimertinib är effektiv för patienter med T790M mutation⁹. Dessutom kan tillväxten av EGFR-mutant cancerformer med MET förstärkning hämmas av kombinerad behandling med EGFR - och MET-TKI⁶^,¹⁰. Kliniska prövningar bedömningen av en kombination av MET och EGFR-hämmare hos patienter med förvärvad resistens mot gefitinib och erlotinib är pågår nu¹¹.

För att studera den molekylära mekanismen av förvärvad resistens mot kemoterapeutika, behandlas cellinjer som initialt reagerar på hämmare kontinuerligt med dessa hämmare. Det finns två metoder att upprätta förvärvad resistens i cellinjer. En är stegvis dosökning, och den andra är högkoncentrerad exponering. Stegvis upptrappning metoden har använts oftare, eftersom det har större framgång. Cellerna är först utsätts för låga koncentrationer av hämmare, nästan en tiondel av värdet halv maximal hämmande koncentration (IC₅₀), och koncentrationen ökas sedan gradvis med 10-30% tills målet koncentrationen uppnås. Metoden högkoncentrerad exponering innebär att utsätta celler till den sista dosen av hämmare i odlingsmediet, vilket är mer än värdet IC₅₀ , så de föräldrarna cellerna dödas nästan helt. Högkoncentrerad exponering metoden har mycket en lägre framgång än metoden stegvis upptrappning.

I en tidigare studie visade kombinerad behandling med EGFR-TKI och MET-TKI sig vara effektivt i ett in vitro -system. Förvärvad resistens mot en eGFR-TKI, gefitinib, inrättades genom stegvis upptrappning i 12 månader, tillsammans med MET-amplifiering, och således en gefitinib-resistenta cellinje som kallas PC-9MET1000 var genererade¹².

Det protokoll som presenteras här är ett tvåstegsförfarande dosupptrappning för att erhålla EGFR-muterade NSCLC PC-9 celler med dubbla motstånd mot den EGFR-TKI, gefitinib och en MET-TKI, PHA665752 (figur 1). Denna metod för att fastställa förvärvat resistenta i cellinjer är relativt lätt att utföra, med en hög framgång. Protokollet beskrivs kan ändras för tillämpning med hämmare av andra molekylära målet droger och cytotoxiska medel samt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. upprätta Gefitinib-resistenta celler

Bestäm första gefitinib genom 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid (MTT) analys.
1. Kultur PC-9 celler i odlingsmedium (RPMI-1640 medium med 10% FBS och 1% antibiotika (penicillin: 100 U/mL och streptomycin: 100 µg/mL)), i en 5% CO₂ inkubator vid 37 ° C.
2. Justera celler till 1,0 × 10⁵ celler/mL med hjälp av en automatiserad cell counter (se tabell av material) och utsäde 50 µL av detta i varje brunn en plattan med 96 brunnar med odlingsmedium; den slutliga koncentrationen av celler bör vara 5,0 × 10³ celler per brunn.
3. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C.
4. Tillsätt 50 µL av gefitinib (vid 2 X slutlig koncentration) vid olika koncentrationer: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 och 20 µM till dessa brunnar som är sådan att den slutliga volymen i varje brunn är 100 µL.
5. Inkubera plattan för 72 timmar vid 37 ° C.
6. Tillsätt 15 µL av färgämne lösningen (se Tabell för material) till varje brunn (användning slutlig 13% koncentration av färgämne lösningen), och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C.
7. Tillsätt 100 µL av lösbarhet/stopp lösning (se Tabell för material) för solubilizing av formazan producerade av färgämne lösningen (se Tabell för material) i varje väl och inkubera det över natten vid 37 ° C.
8. Mät den optiska densiteten vid 570 nm (OD₅₇₀) använder en microplate reader för att erhålla IC₅₀ värdet genom att generera en cellproliferation kurva.
9. Använda en statistisk programvara (se Tabell för material) för att grafiskt visa data och beräkna IC₅₀värdet (figur 2).
10. Laga 6-12 replikat och upprepa experimenten minst tre gånger.
Kontinuerlig stegvis-upptrappning av dosen av gefitinib för behandling av PC-9 celler.
1. Kultur PC-9 celler (1 mL i sub konfluenta skick) i p100 rätter med 10 mL odlingsmedium i en 5% CO₂ inkubator vid 37 ° C.
2. Lägga till en tiondel av IC₅₀ värdet av gefitinib i p100 skålen.
  1. När cellerna i odlingsmediet blir sub konfluenta, tillsätt 1-2 mL av celler till 10 mL färsk odlingsmedium med en 1mL Pipettera med 10-30% högre koncentration av gefitinib i samma kultur förhållanden.
3. Stegvis öka gefitinib koncentrationen av 10-30% med varje split tills den når 1 µM, Detta kan ta ca 6-12 månader.
  Obs: När koncentrationen av gefitinib når värdet IC₅₀ , cellproliferation blir betydligt långsammare och så, 2-4 mL av celler kan läggas till 10 mL färsk odlingsmedium med högre koncentration av gefitinib; att minska ökningen av koncentrationen av gefitinib kan lösa problemet. Dessutom vore det idealiska att lagra återstående cellerna vid-80 ° C och återanvända dem i tidigare koncentration. Eftersom PC-9 celler i suspension, är det onödigt att använda trypsin för passaging; men under processen för ökande gefitinib koncentration, fäster cellerna till botten av kultur maträtt. I en sådan situation, kan en cell-skrapa användas för demontering vidhäftande cellerna.
4. Kultur den gefitinib-resistenta PC-9 celler i odlingsmedium med 1 µM för gefitinib.
5. Utföra MTT analysen för att bekräfta gefitinib-motståndet av celler¹³; dessa gefitinib-resistenta celler namngavs PC-9MET1000 (designerat som MET1000 celler), eftersom de utställda ökat protein och RNA på MET (figur 3A, figur 4A, B).

2. fastställa Dual-motstånd mot Gefitinib och PHA665752

Bestämma den ursprungliga koncentrationen av PHA665752 av MTT-analysen.
1. Kultur MET1000 cellerna i p100 rätter med 10 mL odlingsmedium och 1 µM gefitinib i en 5% CO₂ inkubator vid 37 ° C.
2. Kärna ur cellerna i en plattan med 96 brunnar på 5,0 × 10³ celler per brunn med 50 µL av odlingsmedium i varje brunn. Justera den slutliga koncentrationen av celler till 1,0 × 10⁵ celler/mL med hjälp av en automatiserad cell counter (se Tabell för material).
3. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C.
4. Tillsätt 50 µL av PHA665752, en MET-TKI (vid 2 X slutlig koncentration), till celler i olika koncentrationer: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 och 20 µM inklusive 2 µM gefitinib (med 2 X slutlig koncentration); den slutliga volymen i varje brunn bör 100 µL.
5. Inkubera plattan för 72 timmar vid 37 ° C.
6. Tillsätt 15 µL av färgämne lösningen (se Tabell för material) till varje brunn, och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C.
7. Tillsätt 100 µL av lösbarhet/stopp lösning för solubilizing av formazan producerade av färgämne lösningen (se Tabell för material) till varje brunn, och igen Inkubera över natten vid 37 ° C.
8. Mät den optiska densiteten vid 570 nm (OD₅₇₀) använder en microplate reader för att erhålla IC₅₀ värdet genom att generera en cellproliferation kurva.
9. Använda en statistisk programvara (se Tabell för material) för att grafiskt visa data och beräkna IC₅₀ värdet av PHA665752 i närvaro av gefitinib (figur 3B).
10. Laga 6-12 replikat och upprepa experimenten minst tre gånger.
Upprätta dual-motståndet i MET1000 celler gefitinib och PHA665752.
1. Kultur MET1000 cellerna i p100 rätter med 10 mL odlingsmedium och 1 µM gefitinib i en 5% CO₂ inkubator vid 37 ° C.
2. Lägga till en tiondel av IC₅₀ värdet av PHA665752 i odlingsmedium i närvaro av 1 µM för gefitinib med samma kultur villkor.
3. PHA665752 koncentrationen gradvis öka med 10-30% med varje split tills den når 1 µM. Detta kan ta ca 6-12 månader.
  Obs: När koncentrationen av PHA665752 når värdet IC₅₀ , cellproliferation blir betydligt långsammare och så, 2-4 ml av celler kan läggas med en 1 mL Pipettera 10 ml av den färska odlingsmedium med högre koncentration av PHA665752; att minska ökningen av koncentrationen av PHA665752 kan lösa problemet. Dessutom vore det idealiska att lagra återstående cellerna vid-80 ° C och återanvända dem i tidigare koncentration. Det är onödigt att använda trypsin för passaging; dock under ökningen av PHA665752 koncentration fäster cellerna till botten av skålen kultur. I sådana situationer, kan en cell-skrapa användas för att lossa cellerna.
4. Slutligen, kultur den PC-9 celler tål både gefitinib och PHA665752 i odlingsmedium med 1 µM varje gefitinib och PHA665752 i en 5% CO₂ inkubator vid 37 ° C.
5. Utföra MTT analysen för att bekräfta att cellerna är dual-resistenta mot gefitinib och PHA665752¹³, och att de inte är känsliga för PHA665752 i närvaro av gefitinib; dessa dubbla-motstånd celler namngavs PC-9 DR (designerat som DR celler) (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Översikt av det protokoll som presenteras i detta manuskript visas i figur 1, inklusive induktion av förvärvad dual-resistens mot gefitinib och PHA665752 i PC-9 celler genom en 2-stegs-dosupptrappning förfarande. Figur 2 visar en minskning av spridningen av föräldrarnas PC-9 celler som koncentrationen av gefitinib ökar. Detta indikerar att PC-9 cellerna blev känslig för gefitinib efter dosupptrappning förfarandet utfördes. Figur 3 visar att PC-9MET1000 celler uppvisar resistens mot gefitinib, men är känsliga för en MET-TKI, PHA665752, i närvaro av gefitinib. PC-9 cell spridning var undertryckt vid högre koncentrationer av gefitinib, vilket indikerar att de var känsliga för gefitinib. PC-9MET1000 celler visade dock inte minskad spridning även vid höga koncentrationer av gefitinib, som anger att de hade förvärvat resistens mot gefitinib. När PC-9MET100 celler behandlades med ökande koncentrationer av PHA665752 i närvaron eller frånvaron av gefitinib för 72 h, var dess spridning, mätt genom MTT test, minskat betydligt. Det fanns även en blygsam minskning av spridningen av PC-9MET1000 celler i avsaknad av gefitinib. Således skulle en kombination av gefitinib och PHA665752 undertrycka cellproliferation effektivare än behandling med PHA665752 ensam.

Figur 4 visar förstärkta nivåer av MET (både proteiner och RNA) i PC-9MET1000 och PC-9 DR celler; inga förvärvade mutationer förekommer i EGFR och MET. Uppkomsten av bypass signalering är därför mycket föreslås som en orsak till den förvärvad resistensen mot EGFR-TKI eller MET-TKI. Figur 5 visar motståndet av PC-9 DR celler till PHA665752 i närvaro av 1 µM för gefitinib, mätt som en MTT-analysen. Även om spridningen av PC-9MET1000 celler var hämmas av behandling med gefitinib och PHA665752, överlevde PC-9 DR celler behandlingen, vilket indikerar att de dubbla-resistenta mot gefitinib och PHA665752. Således genom en 2-stegs-dosupptrappning förfarande, PC-9 celler förvärvat resistens mot gefitinib och PC-9MET1000 celler förvärvat resistens mot PHA665752 i närvaro av 1 µM för gefitinib. Figur 6 visar anchorage-oberoende spridning av MET1000 och DR celler i mjuk agar i närvaron eller frånvaron av PHA665752 och gefitinib. Tillväxten av både PC-9MET1000 och PC-9 DR celler observerades på mjuk agar, som anger att dessa segmenten kunde växa i både 2D och 3D system. Således hade de resistenta segmenten övervinna begränsning av inte kunna växa i 2D-system. Dessutom PC-9 DR celler, men inte PC-9MET1000 celler, kunde växa i en agar med 1 µM gefitinib och PHA665752. Detta resultat visar att PC-9 DR celler var resistenta mot både gefitinib och PHA665752, och kunde växa i en 3D kultur-system samt. De etablerade resistenta segmenten tumörframkallande egendom bör kontrolleras av en koloni bildandet assay eller i vivo transplantation¹⁴.

Figur 1: Schema för att generera dual-motstånd: PC-9 DR celler från PC-9 celler.
Diagram för att generera dual-resistenta kloner från PC-9 celler genom en 2-stegs-dosupptrappning förfarande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: EGFR-TKI gefitinib hämmade spridningen av PC-9 celler.
PC-9 celler var seedad i en plattan med 96 brunnar på 5 x 10³ celler per brunn med 50 µL av odlingsmedium i varje brunn, pre inkuberas över natten, och sedan behandlas med gefitinib i de angivna koncentrationerna för 72 h. En MTT-analys utfördes och de OD₅₇₀ mättes genom en microplate reader. Var IC₅₀värdet 0,048 ± 0,01 µM. Data visas som den medelvärde ± SEM för 6 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: PC-9MET1000 celler uppvisade resistens mot gefitinib, men behandling med PHA665752 i närvaro av 1 µM av gefitinib undertryckta dess spridning.
(A) PC-9 och MET1000 celler var seedad i 96 brunnar plattor på 5 x 10³ celler per brunn med 50 µL av tillväxt medium i varje väl, pre inkuberas över natten, och sedan behandlas med gefitinib i de angivna koncentrationerna för 72 h. (B) MET1000 celler var seedad i en plattan med 96 brunnar på 5 x 10³ celler per brunn med 50 µL av odlingsmedium i varje brunn , före inkuberas över natten, och sedan behandlas med PHA665752 vid koncentrationerna som anges i närvaro eller frånvaro av 1 µM för gefitinib för 72 h. En MTT-analys utfördes och de OD₅₇₀ mättes genom en microplate reader. IC₅₀värdet i närvaro av gefitinib var 0,014 ± 0,01 µM, medan det i avsaknad av gefitinib inte bestämdes. Data visas som den medelvärde ± SEM för 6 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: MET förstärkning observerades i PC-9MET1000 och PC-9 DR celler med inga förvärvade mutationer i EGFR och MET.
(A) uttryck nivåer av fosfor-MET och totala MET bestämdes genom Western blot analys. Β-aktin användes som en lastning kontroll. (B) mRNA avskrifter från PC-9, PC-9MET1000 och PC-9 DR celler kvantifierades med real-time RT-PCR och normaliserade med GAPDH. Data presenteras i förhållande till PC-9 värden, som betyder ± SEM (n = 8). Statistisk signifikans uppskattades med hjälp av tvåsidiga Student t-test, och en p < 0.05 ansågs statistiskt signifikant. *, p < 0,05, jämfört med PC-9 värdet. (C) Exon 19-21 av EGFR-genen och exon 14-21 av Met genen var förökas från genomisk DNA med PCR. PCR-produkter var sedan renas och analyseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: PC-9 DR celler är resistenta mot PHA665752 i närvaro av 1 µM för gefitinib.
DR celler var seedad i en plattan med 96 brunnar på 5 x 10³ celler per brunn med 50 µL av odlingsmedium i varje brunn, pre inkuberas över natten, och sedan behandlas med PHA665752 i de angivna koncentrationerna i närvaro av 1 µM på gefitinib för 72 h. En MTT-analys utfördes och de OD₅₇₀ mättes genom en microplate reader. Data visas som den medelvärde ± SEM för 6 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Anchorage-oberoende spridning av PC-9MET1000 och PC-9 DR celler på mjuk agar i närvaron eller frånvaron av PHA665752 och gefitinib.
Celler (1 × 10⁴) åter upphängd i 0,3% agar med 10% FBS var seedad i 6-väl plattor före belagd med 0,6% mjuk agar. Följande dag, celler behandlades med gefitinib (1 µM) och PHA665752 (1 µM) och sedan inkuberas i 14-21 dagar. Kolonier var fläckade av 0,005% kristallviolett för 1 h. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskrivs här kan användas för etableringen av förvärvad dual-resistens i cancerceller använder en 2-stegs-dosupptrappning metod in vitro. Många forskningsrapporter har rapporterat att PC-9 celler utvecklas EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) motstånd genom T790M EGFR mutationer¹⁵^,¹⁶. Dock gjorde vi inte upptäcka T790M mutationer i exon 20 av våra PC-9MET1000 celler av sekvensering (figur 4 c). Dessutom observerades MET förstärkning för att agera som en bypass signalering utbildningsavsnitt. PC-9MET1000 celler är således ytterst sällsynt. Vi har tidigare rapporterat att lunga adenokarcinom PC-9 celler hysa 15-bp borttagning i exon 19 av EGFR utvecklat gefitinib-motstånd med MET förstärkning efter kontinuerlig stegvis dosökning utfördes under 12 månader tills dosen nådde 1 µM (heter PC-9MET1000 celler)¹⁷. Denna cellinje var känslig för en MET-TKI i närvaro av gefitinib. För att bestämma mekanismen bakom motstånd till EGFR - och MET-TKI, utvecklades en kontinuerlig stegvis dosökning-metod för att framkalla dual-motstånd till MET-TKI, PHA665752 och EGFR-TKI, gefitinib, i PC-9MET1000 celler¹². Denna metod förlitade sig på resultaten från en klinisk studie för att studera utvecklingen av sjukdomen bortom gefitinib behandling. När det gäller MET-förstärkta EGFR-TKI-motstånd, skulle en enda MET-hämmare inte signifikant hämmar cellproliferation. Eftersom signaltransduktion mellan receptorn och nedströms molekyler är separerade (EGFR-ERK1/2 och MET-AKT), kombinerade undertryckande av EGFR och MET skulle krävas. I en annan lunga adenokarcinom cellinje utvecklades HCC827, som också hamnar en EGFR-mutationen, EGFR-TKI motstånd genom MET förstärkning. Suda et al. rapporterade att HCC827 celler utsätts för ökande koncentrationer av erlotinib i närvaro av MET-TKI PHA665752 utvecklat resistens mot MET-TKI och EGFR-TKI¹⁸. Dessutom genomförs kliniska prövningar för att undersöka fall av MET-förstärkning med EGFR-TKI-motstånd. Således, för att undersöka mekanismen av förvärvad MET-TKI resistens efter behandling med EGFR-TKI, är det nödvändigt att inducera dual-motstånd till MET-hämmare och EGFR-hämmare.

Protokollet beskrivs här inblandade stegvis-upptrappning av dosen av en MET-TKI, PHA665752, i närvaro av 1 µM för gefitinib. Stegvis dosökning-metoden är den mest tillförlitliga och de vanligaste metod¹⁸^,¹⁹. Det mest kritiska steget i detta protokoll är att erhålla IC₅₀ värdet av hämmaren. Om detta värde inte bestäms korrekt, misslyckas cellerna att växa alls i kultur skålen. Därför, om celltillväxt börjar avta, minskar ökningen av koncentrationen av hämmaren kan lösa problemet. Dessutom om celler börjar dö, vore det perfekt att lagra återstående cellerna vid-80 ° C, för att återanvända dem i tidigare koncentration.

En alternativ metod för att fastställa motstånd i cellinjer är högkoncentrerad exponering metoden, där cellerna är utsatta för en målkoncentration av hämmaren direkt, och cellerna odlas tills de efterlevande resistenta cellerna börjar frodas. Även om denna metod är mer kliniskt relevant, har det en lägre framgång eftersom målet koncentrationen av hämmaren, som administreras initialt, kan döda alla föräldra celler omedelbart. Intressant nog har det rapporterats att resistenta segmenten erhålls genom dessa metoder uppvisar olika cellulära egenskaper¹⁹^,²⁰.

En annan metod för att fastställa motstånd är i vivo resistens metoden, där en cellsuspension (1,0 × 10 (^6-2,0 × 10⁷) injiceras i flanken av möss, och när tumören når en volym på 200 mm³, mössen utsatts för kontinuerlig behandling med hämmare. Tumörer som svarar helt och sedan återkomma under underhålls behandling skördas, malet, smält med trypsin, och sedan filtreras och seedade på kultur rätter. Denna metod, kan även om något komplicerat, användas effektivt i fall av antikropp-motstånd. Men när de tumörer som visar motstånd i systemet i vivo överförs till ett in vitro -system, cellerna ibland misslyckas att växa 2D kultur system. Därför bör 3D kultur system såsom en basalmembranet matris används²¹.

Trots att alla tre av dessa metoder kräver en relativt lång tid att utföra, är den mest ekonomiska metoden stegvis dosökning. Det är också den lämpligaste metoden för att tydligt förstå och studera processen att förvärva hämmare-motstånd. Framgången för de andra två metoderna är dessutom betydligt lägre än för metoden stegvis dosökning.

När motståndet är etablerad, är det nödvändigt att testa tumörframkallande styrkan av dessa cellinjer. Kolonin bildandet tester eller i vivo transplantationer används ofta för detta ändamål (figur 6). Dessa metoder kan övervinna nackdelen med att använda 2D kultur system.

En stor begränsning av dessa metoder är att celler med förvärvad resistens ofta inte korrekt återspeglar motståndet i mänskliga cancerceller. De mekanismer som upptäckte genom studier i in vitro- modeller bör därför bekräftas i mänsklig vävnadsprover genom upprepade tester i biopsiprover. Dessutom, även om dessa protokoll kan vara användbar för att undersöka mekanismen bakom förvärvad resistens under utvecklingen av tumörceller, är det möjligt att den förvärvad resistens motiverades av förändringar av den tumör mikromiljö. Detta är en annan allvarlig begränsning av undersökt effekten av dessa protokoll i endast cancerceller. Det vore bättre att använda vävnader från mänsklig vävnadsbanker, som är tillgängliga för många forskare.

Det protokoll som presenteras här kan ändras för att fastställa resistens mot andra molekylär-hämmare samt. Denna metod är därför potentiellt användbara för att utveckla terapeutiska verktyg för att kontrollera cancer i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Vi tacka medlemmarna i Institutet för molekylär onkologi för deras genomtänkta kommentarer och goda råd, och Editage för deras hjälp med engelska språkgranskning. Detta arbete stöds av MEXT-stödda programmet för stiftelsen strategisk forskning vid privata universitet (2012-2016) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan. Tohru Ohmori fått forskningsmedel (2015-2016) från Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Tyskland).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Wako	189-02025	with L-Glutamine and Phenol Red
CellTiter 96	Promega	G4100	Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
FBS	gibco	26140-079
Pen Strep	gibco	15140-163
gefitinib	Selleck	S1025	stocked 10 mM/EMSO at -20ºC
PHA665752	Selleck	S1070	stocked 10 mM/EMSO at -20ºC
96-well plate	IWAKI	860-096	flat bottom with lid, low evaporation type
TC10 Automated Cell Counter	BIO RAD	#1450010
CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay	Promega	G4100	Dye Solution and Solubilization/Stop Solution
Powerscan HT microplate reader	BioTek
GraphPad Prism v.5.0 software	GraphPad Inc.
PC-9	Riken BioResource Center	RCB4455
P100 dish	FALCON	353003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).

Om dubbla motstånd mot EGFR-TKI och träffade-TKI i lunga adenokarcinom celler <em>In Vitro</em> med en 2-stegs-dosupptrappning procedur

Play Video

PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaoka, T., Ohba, M., Arata, S.,… More

Yamaoka, T., Ohba, M., Arata, S., Ohmori, T. Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure. J. Vis. Exp. (126), e55967, doi:10.3791/55967 (2017).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video