Summary
EGFR TKI와 암 세포에서 메트로 TKI 듀얼 저항을 설정 하기 위한 생체 외에서 방법을 설명 합니다. 이 방식은 메트로 증폭 EGFR TKI 치료에도 불구 하 고 질병의 진행을 전시 EGFR 돌연변이와 환자에 대 한 치료를 개발 하는 데 유용 합니다. 그것은 또한 다른 분자를 대상으로 하는 저 해제에 대 한 수정할 수 있습니다.
Abstract
약은 암 치료에 주요 도전 이다. 저항 sublines에 체 외에서 의 세대는 발견이 문제를 극복 하기 위해 새로운 메커니즘이 필요 합니다. 여기, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 듀얼-저항을 설정 하기 위한 2 단계 복용량 단계적 확대 방법-티로신 키 니 아 제 억제제 (TKI), gefitinib, 그리고 메트로 TKI, PHA665752, 설명. 이 메서드는 간단한 기반 유도 대 한 억제제의 stepwise 복용량 확대 인수 셀 라인에 저항. 저항 sublines를 생성 하기 위한 대체 방법을 한 단계에서 억제 물의 높은 농도에 세포를 노출 포함 됩니다. Stepwise 복용량 에스컬레이션 메서드는 높은 성공적으로 유도의 가능성이이 방법 보다는 저항을 취득. EGFR 활성화 변이 EGFR TKI와 치료에 대 한 응답의 biomarkers 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 항구이 돌연변이 대 한 적용 된 첫 줄 치료. 그러나, 효과적인 응답의 보고서에도 불구 하 고 EGFR TKI 사용 제한 된다 종양 저항을 필연적으로 취득 하기 때문에. EGFR TKI 저항 뒤에 주요 메커니즘 게이트 키퍼 사이트, EGFR의 exon 20에에서 T790M 및 메트로의 우회 신호에 보조 돌연변이 포함합니다. 따라서,이 문제에 대 한 잠재적인 솔루션 EGFR TKI와 메트로 TKI의 조합 것입니다. 이 결합 된 치료 생체 외에서 연구 모델에서 효과적 이기 위하여 보였다. 인수 gefitinib 저항 메트로 증폭을 통해 gefitinib의 stepwise 복용량 확대 하 여 12 개월, 고 셀 라인 PC-9MET1000 라는 이전 연구에서 생성 된. 추가 획득된 메트로 TKI와 EGFR TKI 메커니즘을 조사 하기 위해 저항, 메트로 TKI PHA665752, 12 개월 gefitinib 존재 stepwise 복용량 단계적 확대와 이러한 셀에 관리 되었다. 이 프로토콜도 성공적으로 설정할 다른 억제 물 분자에 인수 저항 조합 요법의 수에 대 한 적용 되었습니다.
Introduction
표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 종양 돌연변이 비 작은 세포 폐암 (NSCLC) 환자의 일부에서 발견 되며이 질병1,2의 중요 한 예측 생체. EGFR 돌연변이 가장 일반적으로 활성화 이러한 엑손 19에에서는 프레임 삭제 (delE746-A750) 또는 교체 신 exon 21 (L858R)의 codon 858에서 아르기닌 EGFR 티로신 키 니 아 제 도메인3,4점 돌연변이로 발생 합니다. EGFR 티로신 키 니 아 제 억제제 (TKIs)와 치료는 EGFR 돌연변이 품고 NSCLC 환자에 대 한 임상적으로 효과적인 치료. 그러나,이 치료는 gefitinib 등 erlotinib EGFR TKIs 저항의 피할 수 없는 인수에 의해 제한 됩니다. 가장 일반적인 획득된 저항 EGFR TKI gefitinib (erlotinib) 저항을 취득 하는 환자의 약 60%에서 검색 된 EGFR의 exon 20에서에서 보조 T790M 돌연변이 통해 발생 합니다. EGFR TKIs 인수 저항와 관련 된 다른 분자 메커니즘은 활성화 우회 신호 메트로 증폭, 작은 세포 폐 암 및 상피-엽 전환5,6의 변화에 의해 발생. 수용 체 메트로 유전자 인코딩 hepatocyte 성장 인자는 dysregulatedin 많은 종양, 중요 한 후보로 타겟 요법7,8될 것으로 보고 되었습니다.
EGFR TKIs를 인수 저항 극복을 위한 전략 이제 임상 평가 겪고 있다. 전 임상 및 임상 연구 osimertinib와 같은 3 세대 EGFR 억제제는 T790M 돌연변이9환자에 대 한 효과적으로 나타났습니다. 또한, 메트로 증폭 EGFR 돌연변이 암의 성장 EGFR 및 메트로 TKIs6,10결합된 치료에 의해 저해 수 있습니다. Gefitinib erlotinib를 인수 저항을 가진 환자에서 메트로 EGFR 억제제의 조합을 평가 하는 임상 시험11지금 진행 되 고 있다.
화학요법 에이전트에 저항을 취득된의 분자 메커니즘 연구, 셀 라인 처음 반응 억제제 하는 이러한 억제제와 지속적으로 처리 됩니다. 두 가지 방법 셀 라인에 인수 저항을 설정할 수 있습니다. Stepwise 복용량 단계적 확대, 하나 이며 다른 고 농도 노출 됩니다. Stepwise 에스컬레이션 메서드는 더 일반적으로 사용 되었다, 더 높은 성공률을가지고 있기 때문에. 세포는 처음 억제제, 거의 절반 최대한 억제 농도 (IC50) 값의 10 분의 낮은 농도에 노출 하 고 대상 농도 달성 될 때까지 농도 10-30%로 점차 증가 다음. 고 농도 노출 방법은 노출 셀 부모 세포는 거의 완전히 사망 이므로 IC50 값 보다 더 많은 문화 매체에 억제제의 마지막 복용량을 포함 한다. 이 고 농도 노출 메서드는 단계적 확대 방법 보다 훨씬 낮은 성공률.
이전 연구에서 EGFR TKI와 메트로 TKI 결합된 치료 체 외에 시스템에 효과적일 표시 했다. 인수는 EFGR TKI, gefitinib, 저항 메트로-증폭, 함께 12 개월에 대 한 단계적 확대를 통해 고 따라서, PC-9MET1000 라는 gefitinib 저항 셀 라인 생성된12이었다.
여기에 제시 된 프로토콜은 EGFR TKI, gefitinib, 그리고 메트로 TKI, PHA665752 듀얼 저항 NSCLC PC 9 EGFR 돌연변이 세포를 얻기 위해 2 단계 복용량 단계적 확대 절차 (그림 1). 이 방법은 인수 설정에 대 한 셀 라인에 저항은 비교적 쉽게 수행, 높은 성공률. 다른 분자 대상 약물 및 세포 독성 대리인 뿐만의 억제제와 응용 프로그램에 대 한 설명된 프로토콜을 수정할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 설정 Gefitinib 내성 세포
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT) 분석 결과 의해 초기 gefitinib 농도 결정 합니다.
- PC-9 셀 성장 매체에 문화 (RPMI-1640 매체 10% 1 %FBS 항생제 (페니실린: 100 U/mL와 스: 100 µ g/mL)), 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서
- 1.0 × 105 셀/mL를 사용 하는 자동화 된 셀 ( 재료의 표참조) 카운터에 성장 매체;를 사용 하 여 96 잘 접시의 각 잘이 50 µ L 씨 셀 조정 셀의 최종 농도 5.0 × 103 셀/잘 해야 합니다.
- 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어
- 다른 농도에서 50 µ L gefitinib (최종 농도 X 2)에서 추가: 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, 및 각 최종 볼륨 잘 100 µ L은 이러한 웰 스 같은 20 µ M.
- 37 ° c.에서 72 h에 대 한 접시를 품 어
- 15 µ L 염료 솔루션의 추가 ( 재료의 표참조)을 각 영역 (사용 최종 13% 용액의 농도 염료), 그리고 4 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- 가용 화/정지 솔루션의 100 µ L를 추가 ( 재료의 표참조)는 formazan solubilizing 염료 솔루션을 제작한 대 한 ( 재료의 표참조) 각에 잘, 그리고 37 ° c.에 그것을 밤새 품 어
- 570에서 광학 밀도 측정 nm (OD570) 세포 증식 곡선을 생성 하 여 IC50 값을 얻기 위해 microplate 리더를 사용 하 여.
- 통계 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 그래픽 데이터를 표시 하 고 계산 IC50 값 (그림 2).
- 6-12 복제를 준비 하 고 세 번 이상 실험을 반복.
- 연속 stepwise 복용량-에스컬레이션 gefitinib PC-9 셀의 처리를 위해의.
- 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에 성장 매체의 10 mL와 p100 요리에서 문화 PC-9 셀 (하위 confluent 상태로 1 mL)
- P100 접시에 gefitinib IC50 값의 1/10을 추가 합니다.
- 문화 매체에 셀 될 때 하위 confluent, 1 mL를 피펫으로 gefitinib 같은 문화 조건에서의 10-30% 더 높은 농도로 사용 하 여 신선한 성장 매체의 10 mL를 셀의 1-2 mL를 추가 합니다.
- 1 µ M;에 도달할 때까지 각 분할 10-30 %gefitinib 농도 점차적으로 증가 이 약 6-12 개월 걸릴 수 있습니다.
참고: gefitinib 농도 IC50 값에 도달 하면, 세포 증식 상당히 느린, 되 고 그래서, 셀 2-4 mL gefitinib;의 높은 농도 가진 신선한 성장 매체의 10 mL를 추가할 수 있습니다. gefitinib의 농도 있는 증가 감소 문제를 해결할 수 있습니다. 또한, 그것은-80 ° C에서 남아 있는 세포를 저장 하 고 이전 농도에서 그들을 다시 사용 하는 이상적인 것입니다. PC-9 셀 서 스 펜 션에는, 그것은 뿌리고;에 대 한 트립 신을 사용 하는 데 필요한 그러나, gefitinib 농도 증가의 과정, 셀 문화 접시의 하단에 첨부할 수 있습니다. 이런 상황에서 셀-스 크레이 퍼 부착 세포를 분리 사용할 수 있습니다. - 문화 gefitinib 저항 PC-9 셀 gefitinib의 1 µ M와 성장 매체에.
- MTT 분석 결과 셀13; gefitinib 저항 확인 수행 그들은 증가 단백질 및 RNA 수준 메트로 (그림 3A, 그림 4A, B)의 전시 하기 때문에 이러한 gefitinib 내성 세포 PC-9MET1000 (MET1000 셀으로 지정), 선정 됐다.
2. 설정 Gefitinib 및 PHA665752 듀얼-저항
- MTT 분석 결과 의해 PHA665752의 초기 농도 결정 합니다.
- 성장 매체의 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 1 µ M gefitinib 10 mL와 p100 요리에서 문화는 MET1000 셀
- 5.0 × 103 셀/잘 각 잘에서 성장 매체의 50 µ L에서 96 잘 접시에 셀을 시드하십시오. 1.0 × 10 셀의 최종 농도 조정5 셀/mL는 자동화 된 셀을 사용 하 여 카운터 ( 재료의 표참조).
- 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어
- PHA665752는 메트로-TKI (최종 농도 X 2)에 다른 농도에서 세포의 50 µ L를 추가: 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6, 및 2 µ M gefitinib (2 X 최종 농도에서);를 포함 하 여 20 µ M 각 잘에서 마지막 볼륨 100 µ L를 해야 한다.
- 37 ° c.에서 72 h에 대 한 접시를 품 어
- 15 µ L 염료 솔루션의 추가 ( 재료의 표참조) 각 음을 4 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- 염료 해결책에 의해 생산 된 formazan solubilizing 가용 화/정지 솔루션의 100 µ L 추가 ( 재료의 표참조)을 각각 잘, 그리고 다시 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 570에서 광학 밀도 측정 nm (OD570) 세포 증식 곡선을 생성 하 여 IC50 값을 얻기 위해 microplate 리더를 사용 하 여.
- 통계 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 그래픽 데이터를 표시 하 고 gefitinib (그림 3B) 존재 PHA665752의 IC50 값을 계산.
- 6-12 복제를 준비 하 고 세 번 이상 실험을 반복.
- Gefitinib 및 PHA665752 MET1000 셀에 듀얼 저항을 설정 합니다.
- 성장 매체의 10 mL와 p100 요리에서 문화는 MET1000 세포와 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 1 µ M gefitinib
- 1 µ M 같은 문화 조건 gefitinib의 면 전에 서 성장 매체에 PHA665752의 IC50 값의 1/10을 추가 합니다.
- 증가 PHA665752 농도 점차적으로 각 분할 10-30 %1 µ M에 도달할 때까지. 이 약 6-12 개월 걸릴 수 있습니다.
참고: PHA665752의 농도는 IC50 값에 도달 하면, 세포 증식 상당히 느린, 되 고 그래서, 셀 2-4 ml를 신선한 성장 매체의 10 mL를 1 mL 피펫으로 PHA665752;의 높은 농도를 사용 하 여 추가할 수 있습니다. PHA665752의 농도 있는 증가 감소 문제를 해결할 수 있습니다. 또한, 그것은-80 ° C에서 남아 있는 세포를 저장 하 고 이전 농도에서 그들을 다시 사용 하는 이상적인 것입니다. 뿌리고;에 트립 신을 사용할 필요는 없습니다. 그러나, PHA665752 농도의 증가, 동안 셀 문화 접시의 하단에 첨부할 수 있습니다. 이러한 상황에서 셀 분리 하 셀-스 크레이 퍼를 사용할 수 있습니다. - 마지막으로, 문화 PC-9 셀 1 µ M 각 gefitinib과 PHA665752의 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에 함께 성장 매체에서 gefitinib와 PHA665752에 저항
- MTT 분석 결과 셀은 듀얼-gefitinib, PHA66575213, gefitinib; 존재 PHA665752에 과민 하다는 것 확인 수행 이 듀얼 저항 세포 PC 9 박사 (DR 셀으로 지정) 선정 됐다 (그림 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 원고에 제시 하는 프로토콜의 개요는 그림 1, 2 단계 복용량 에스컬레이션 절차에 의해 PC-9 셀에 gefitinib 및 PHA665752 획득 듀얼-저항 유도 포함 한에 표시 됩니다. 그림 2 gefitinib 증가 농도 부모의 PC-9 셀의 확산에 있는 감소를 보여준다. 이 복용량 단계적 확대 절차 수행 후 PC-9 셀 gefitinib에 민감한 되었다 나타냅니다. 그림 3 보여줍니다 PC 9MET1000 셀 gefitinib, 저항을 전시 하지만 gefitinib 존재 메트로 TKI, PHA665752에 민감합니다. PC-9 셀 확산 gefitinib, gefitinib에 민감한 그들이 나타내는의 높은 농도에서 억제 되었다. 그러나, PC 9MET1000 셀 gefitinib, 그들은 저항 gefitinib 인수 했다 나타내는의 높은 농도 에서도 감소 확산을 보여주지 않았다. PC 9MET100 셀 gefitinib 72 h에 대 한의 유무에 PHA665752의 농도 증가 함께 치료 되었다, 그것의 확산, MTT 분석 결과에 의해 측정으로 크게 감소 했다. 또한 gefitinib의 부재에서 PC-9MET1000 세포의 확산에 겸손 한 감소가 했다. 따라서, gefitinib과 PHA665752의 조합 세포 증식을 PHA665752 혼자 치료 보다 더 효과적으로 억제 것 이다.
그림 4 는 메트로 (단백질 및 RNA)의 증폭된 레벨 PC 9MET1000 및 PC 9 박사 세포; 아무 인수 돌연변이 EGFR과 메트로에 있습니다. 따라서, 우회 신호의 출현은 매우 EGFR TKI / 메트로 TKI 획득된 내성의 원인으로 제안 했다. 그림 5 에서는 PC-9 박사 셀의 저항 PHA665752를 gefitinib의 1 개의 µ M의 MTT 분석 결과 의해 측정 된. PC-9MET1000 세포의 확산 gefitinib와 PHA665752 처리에 의해 저해 되었다, 비록 PC 9 박사 세포 치료, 그들은 듀얼 gefitinib과 PHA665752에 내성을 했다 나타내는 살아남았다. 따라서, 2-단계 복용량 단계적 확대 절차를 통해 PC-9 셀 gefitinib에 저항을 취득 하 고 PC-9MET1000 셀 인수 gefitinib의 1 µ M의 PHA665752 저항 키를 누릅니다. 그림 6 보여 줍니다 MET1000와 박사의 앵커리지 독립적인 확산 셀 소프트 한 천 PHA665752 및 gefitinib의 유무에. PC-9MET1000와 PC 9 박사 세포의 성장은 나타내는이 sublines 모두 2D 및 3D 시스템에서 성장할 수 있는 부드러운 천에 관찰 되었다. 따라서, 저항 sublines 2D 시스템에서 성장할 수 없다는 한계를 극복 했다. 또한, PC-9 박사 셀, 하지만 하지 PC 9MET1000 셀, gefitinib과 PHA665752의 1 개의 µ M와 agar에서 성장할 수 있습니다. 이 결과 PC 9 박사 셀 gefitinib 하 PHA665752, 저항 했다 뿐만 아니라 3D 문화 시스템에서 성장할 수 있는 나타냅니다. 식민지 대형 분석 결과 또는 vivo에서 이식14설립된 저항 sublines의 tumorigenic 속성을 검사 되어야 한다.
그림 1: 스키마 생성 듀얼-저항: PC-9 닥터 PC 9 세포에서 세포.
2 단계 복용량 에스컬레이션 절차에 의해 PC-9 셀에서 듀얼 저항 클론을 생성 하기 위한 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: EGFR TKI gefitinib PC 9 세포의 증식을 억제.
PC-9 셀 5 x 103 셀/잘 각 잘, 사전, 인 큐베이 팅 하 고 72 h에 대 한 지정 된 농도에서 gefitinib 다음 치료에 성장 매체의 50 µ L에서 96 잘 접시에 시드 했다. MTT 분석 결과 수행 하 고 세570 microplate 리더에 의해 측정 되었다. IC50 값은 0.048 ± 0.01 µ M. 데이터 6 웰 스에 대 한 평균 ± SEM으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: PC-9MET1000 세포 전시 gefitinib에 저항 하지만 gefitinib의 1 µ M의 PHA665752와 치료의 확산을 억제.
(A) PC-9 및 MET1000 세포에서 5 x 103 셀/잘 성장의 50 µ L 96 잘 접시에 시드 했다 각 음, 미리 incubated 하룻밤, 그리고 다음 72 헤 대 표시 농도에서 gefitinib 치료 중간 (B) MET1000 셀은 5 x 103 셀/잘 각 잘에서 성장 매체의 50 µ L에서 96 잘 접시에 시드 미리 incubated 하룻밤, 그리고 다음 gefitinib 72 h에 대 한의 1 µ M의 유무에 표시 된 농도에서 PHA665752와 치료. MTT 분석 결과 수행 하 고 세570 microplate 리더에 의해 측정 되었다. Gefitinib 존재 IC50 가치 gefitinib의 부재에서 결정 하지 동안 0.014 ± 0.01 µ M 이었다. 데이터는 6 웰 스에 대 한 평균 ± SEM으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 메트로 증폭 EGFR에 메트로 인수 없는 돌연변이와 PC 9MET1000 및 PC 9 박사 셀에서 관찰 되었다.
(A) 식 수준 형광체 메트로 및 총 메트로의 서쪽 오 점 분석에 의해 결정 되었다. Β-말라 로드 제어로 사용 되었다. (B) mRNA PC-9, PC-9MET1000, 및 PC 9 박사 셀에서 성적 GAPDH의 정규화 및 실시간 RT-PCR를 사용 하 여 계량 했다. ± Sem의 의미 대로 데이터 PC 9 값을 기준으로 표시 됩니다 (n = 8). 통계적 의미는 양측 학생 t를 사용 하 여 추정 되었다-테스트, 그리고 p < 0.05 통계적으로 중요 하 게 고려 되었다. *, p < 0.05, PC-9 값과 비교. EGFR 유전자의 (C) Exon 19-21, 14-21 메트로 유전자의 엑손 genomic DNA에서 PCR에 의해 증폭 되었다. PCR 제품 정화 그리고 분석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: PC-9 박사 셀은 gefitinib의 1 µ M의 PHA665752를 저항 한다.
박사 셀 5 x 103 셀/잘 각 잘, 사전, 인 큐베이 팅 하 고 gefitinib 72 h에 대 한의 1 µ M의 표시 농도에서 PHA665752와 치료를 다음에 성장 매체의 50 µ L에서 96 잘 접시에 시드 했다. MTT 분석 결과 수행 하 고 세570 microplate 리더에 의해 측정 되었다. 데이터는 6 웰 스에 대 한 평균 ± SEM으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 의 PHA665752 및 gefitinib의 유무에서 소프트 한 PC 9MET1000 및 PC 9 박사 셀 앵커리지-독립 확산.
셀 (1 × 104) 다시 10% FBS 6 잘 플레이트 중 0.6% 소프트 한 코팅으로 시드 했다 0.3 %agar 정지. 다음 날, 셀 gefitinib (1 µ M)로 치료 했다 및 PHA665752 (1 µ M) 및 다음 14-21 일 동안 알을 품. 0.005% 크리스탈 바이올렛 1 헤에 대 한 식민지 했다 물 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 인수 듀얼-저항 2 단계 복용량 에스컬레이션 메서드 시험관을 사용 하 여 암 세포에의 설립을 위해 사용할 수 있습니다. 많은 연구 논문 PC-9 셀 T790M EGFR 돌연변이15,16통해 EGFR TKI gefitinib (erlotinib) 저항 개발을 보고 있다. 그러나, 우리가 검색 하지 못했습니다 T790M 돌연변이 우리의 PC 9MET1000 셀의 exon 20에서에서 직접 연속 (그림 4C). 또한, 메트로 증폭 신호 전달 경로 우회 역할을 관찰 되었다. 따라서, PC 9MET1000 셀은 매우 드물다. 우리는 이전 연속 stepwise 복용량 에스컬레이션 복용량 1 µ M (PC-9MET1000 셀 라는)17에 도달할 때까지 12 개월 동안 수행한 후 폐 선 암 PC-9 셀 EGFR의 exon 19에서에서 15-bp 삭제 은닉 메트로 증폭 gefitinib 저항을 개발 보고 했다. 이 셀 라인 메트로 TKI gefitinib 존재에 민감 했다. 저항을 EGFR-및 메트로-TKIs, 뒤에 메커니즘을 결정 하기 위하여 연속 stepwise 복용량 에스컬레이션 메서드 메트로 TKI, PHA665752, 및 PC 9MET1000 셀12gefitinib EGFR TKI 듀얼-저항을 유도 하기 위해 개발 되었다. 이 방법은 gefitinib 치료 넘어 질병의 진행을 연구 하는 임상 시험의 결과에 의존 합니다. EGFR-TKI-저항 메트로 증폭, 경우 단일 메트로 억제제 것 하지 크게 억제 세포 증식. 때문에 수용 체와 하류 사이의 신호 전달 분자는 분리 (EGFR-ERK1/2와 메트로 AKT), EGFR과 메트로의 결합된 억제 해야 할 것 이다. 다른 폐 선 암 세포 선, HCC827, 또한 항구는 EGFR 돌연변이, EGFR TKI 저항 메트로 증폭을 통해 개발 되었다. 스 외. HCC827 셀 메트로 TKI와 EGFR TKI18메트로 TKI PHA665752 개발 저항 존재 erlotinib의 농도 증가에 노출 했다. 또한, 임상 시험 공부 EGFR TKI 저항 메트로 증폭의 경우 실시 되고있다. 따라서, EGFR TKI와 치료 후 획득 메트로 TKI 저항 메커니즘을 조사, 그것은 메트로 억제제와 EGFR 억제제에 듀얼-저항을 유도 하는 데 필요한.
프로토콜 설명 여기 참여 stepwise 복용량-에스컬레이션 메트로 TKI, PHA665752의 1 µ M gefitinib의 존재. Stepwise 복용량 에스컬레이션 메서드는 가장 안정적이 고 가장 일반적으로 사용 되는 방법은18,19. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 억제제의 IC50 값을 얻는 이다. 이 값이 정확 하 게 결정 되지 않습니다, 셀 문화 접시에 전혀 성장 되지 것입니다. 따라서, 세포의 성장을 느리게 하기 시작는 억제제의 농도 있는 증가 감소 문제를 해결할 수 있습니다. 또한, 세포는 죽기 시작, 그것은 이전 농도에서 그들을 다시 사용-80 ° C에서 남아 있는 세포를 저장 하 이상적일 것입니다.
셀 라인에 저항을 설정 하기 위한 다른 방법 있는 세포에 노출 되는 대상 농도 억제제의 직접, 고 농도 노출 방법 이며, 살아남은 내성 세포 확산 시작 될 때까지 셀 교양. 이 메서드는 더 임상 관련, 처음 관리는, 억제제의 대상 집중 즉시 모든 부모의 셀 죽 일 수도 있기 때문에 낮은 성공률이 있다. 흥미롭게도, 그것은 이러한 두 가지 방법을 통해 저항 sublines 다른 셀룰러 속성19,20전시 보고 되었습니다.
저항을 설정 하는 또 다른 방법은 이다 vivo에서 저항 방법, 세포 현 탁 액 (1.0 × 106-2.0 × 107) 마우스의 옆구리에 주입 되며 종양 200 m m3의 볼륨에 도달 하면 쥐 억제제와 지속적인 복종된 치료. 완전 하 게 응답 하 고 다음 중 재발 종양 치료는 수확, 다진, 트립 신, 함께 소화 필터링 하 고 문화 요리에 시드 유지. 이 방법은 다소 복잡 하 게, 비록 사용할 수 있습니다 효과적으로 항 체 저항의 경우에. 그러나 때 종양 vivo에서 시스템에 저항 시스템 생체 외에서 때로는 셀 전송 됩니다 보여 주는 2D 문화 시스템 실패 합니다. 따라서, 지하실 멤브레인 매트릭스 3 차원 문화 시스템 사용된21이어야 한다.
이러한 방법 중 세 수행 하는 비교적 장시간 필요, stepwise 복용량 단계적 확대 방법은 가장 경제적인 것 이다. 그것은 또한 명확 하 게 이해 하 고 공부 억제제 저항을 취득 하는 과정에 대 한 가장 적합 한 방법입니다. 또한, 다른 두 가지 방법의 stepwise 복용량 단계적 확대 방법의 그것 보다 훨씬 낮습니다.
저항 설립 되 면, 그것은 이러한 셀 라인의 tumorigenic 힘을 테스트 하는 데 필요한입니다. 식민지 형성 테스트 또는 vivo에서 간이식이이 목적 (그림 6)에 대 한 자주 채택 된다. 이러한 방법을 2D 문화 시스템을 사용 하 여 단점은 극복할 수 있습니다.
이 방법의 주요 한계는 셀 인수 저항 종종 인간 암 세포에 저항에 정확 하 게 반영을 하지 않습니다. 따라서, 생체 외에서 모델에서 연구를 통해 발견 된 메커니즘 인간의 조직 샘플에서 생 검 견본에서 반복된 테스트를 통해 확인 되어야 한다. 또한, 이러한 프로토콜은 종양 세포의 발달 동안에 취득 된 저항 뒤에 메커니즘을 조사 하기 위한 도움이 될 수 있습니다, 비록 그것이 인수 저항 종양 microenvironment의 변경에 의해 유도 되었다 가능 합니다. 이것은 조사만 암 세포에 이러한 프로토콜의 효능의 또 다른 심각한 제한 이다. 그것은 많은 연구에 사용할 수 있는 인체 조직 은행에서 티슈를 사용 하는 것이 좋을 겁니다.
여기에 제시 된 프로토콜 뿐만 아니라 다른 분자 억제제에 대 한 저항을 설정 수정할 수 있습니다. 따라서,이 메서드는 잠재적으로 미래에 암 제어 치료 도구를 개발 하는 데 유용.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 그들의 사려깊은 의견 및 유용한 조언, 분자 종양학 연구소 그리고를 통해 그들의 영어 편집 Editage의 구성원 감사. 이 작품에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본의 사립 대학 (2012-2016 년) 전략 연구 재단에 대 한 문 부 과학성 지원 프로그램에 의해 지원 되었다. 도입한 가마타 Boehringer 인 겔 하 임 (인 겔 하 임, 독일)에서 연구 자금 (2015-2016 년)을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
