Summary
EGFR TKI ve MET-TKI kanser hücrelerinin içinde çift direnç kurmak için bir vitro yöntemi açıklanmıştır. MET-güçlendirme ile EGFR-TKI tedaviye rağmen hastalık ilerleme sergileyen EGFR mutasyon, hastalar için tedavi geliştirmek için yararlı bir yöntemdir. Ayrıca diğer molekülleri hedefleme inhibitörleri için değiştirilebilir.
Abstract
İlaç direnci kanser tedavisi büyük bir sorun olduğunu. Dayanıklı sublines vitro nesil bu zorluğu aşmak için roman mekanizmaları keşfetmek için gereklidir. Burada, çift-direnç bir epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) kurmak için 2-adım doz-yükseltme yöntem-tirozin kinaz inhibitörü (TKI), gefitinib ve MET-TKI, PHA665752, açıklanmıştır. Bu yöntem basit dayanır kademeli doz-artması inhibitörleri inducing için Edinsel direnç hücre hatlarında. Dayanıklı sublines oluşturmak için alternatif yöntem tek bir adımda inhibitörü yüksek konsantrasyonda hücrelere açığa içerir. Kademeli doz-yükseltme yöntemi daha yüksek bir sahiptir başarıyla inducing imkanı elde direnç bu yöntem daha. EGFR aktive mutasyonlar biyolojik tedavi ile EGFR-TKI, yanıt bir olan bu mutasyonlar liman küçük hücreli dışı akciğer kanserleri (NSCLC) için uygulanan bir ilk basamak tedavi olduğunu. Ancak, tümör, kaçınılmaz olarak direnç kazanmak çünkü rağmen raporları etkili tepkilerin EGFR-TKI kullanımı sınırlıdır. Ağ geçidi denetleyicisi site, exon 20 EGFR T790M ve MET bir yan yol sinyal ikincil bir mutasyon EGFR-TKI direnç arkasında büyük mekanizmaları içerir. Böylece, bu sorun için olası bir çözüm EGFR-TKI ve MET-TKI olacaktır. Bu kombine tedavi bir vitro çalışma modelinde etkili olduğu gösterilmiştir. Edinsel gefitinib-direnç MET-güçlendirme ile 12 ay için kademeli doz-artması tarafından gefitinib kurulmuş ve PC-9MET1000 adında bir hücre kültürünü bir önceki çalışmada oluşturuldu. Edinsel MET-TKI ve EGFR-TKI mekanizmaları daha ayrıntılı araştırmaya direnç, MET TKI, PHA665752, bu hücrelere gefitinib huzurunda kademeli doz yükseltme ile 12 ay için yönetiliyordu. Bu iletişim kuralı da başarıyla diğer inhibitörü moleküllere Edinsel direnç kurmak için kombinasyon tedaviler bir dizi için uygulandı.
Introduction
Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) oncogenic mutasyonlar küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) olan hastalarda alt kümesinde bulunur ve bu hastalığı1,2önemli akıllı biyolojik. Bunlar en sık EGFR mutasyon aktive exon 19 içinde bir çerçeve içinde silme (delE746-A750) ya da bir nokta mutasyon EGFR tirozin kinaz etki alanı3,4' te arginin kodon 858 exon 21 (L858R), lösin yerine olarak ortaya çıkar. EGFR tirozin kinaz inhibitörleri (TKIs) ile tedavi ile EGFR mutasyon yataklık NSCLC hastalar için klinik olarak etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, bu tedavi EGFR-TKIs direnç gefitinib ve erlotinib gibi kaçınılmaz edinimi ile sınırlıdır. En yaygın Edinsel direnç EGFR-TKI (gefitinib veya erlotinib) direnç alınan hastaların yaklaşık % 60 algılandı EGFR, exon 20 bir ikincil T790M mutasyon yoluyla ortaya çıkar. EGFR TKIs Edinsel direnç ile ilişkili diğer moleküler mekanizmaları tarafından MET amplifikasyon, küçük hücreli akciğer kanserleri ve epitel-için-Mezenkimal geçiş5,6neden yan yol sinyal aktif vardır. Reseptör için MET gen tarafından kodlanmış hepatosit büyüme faktörü olan dysregulatedin birçok tümör, önemli bir aday için hedeflenmiş tedaviler7,8olduğu bildirildi.
EGFR TKIs Edinsel direnç üstesinden gelmek için stratejiler şimdi klinik değerlendirme geçiyor. Preklinik ve klinik çalışmalar üçüncü nesil EGFR inhibitörü osimertinib gibi T790M mutasyon9olan hastalar için etkili olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, büyüme ile MET amplifikasyon EGFR-mutant kanserlerin kombine tedavi ile EGFR ve MET TKIs6,10tarafından inhibe olabilir. Klinik çalışmalarda gefitinib ve erlotinib Edinsel direnç ile MET ve EGFR inhibitörü hastalarda bir arada değerlendirilmesi devam şimdi11vardır.
Kemoterapötik ajanlar Edinsel direnç moleküler mekanizması çalışmaya, başlangıçta inhibitörleri için yanıt hücre hatları sürekli bu inhibitörleri ile tedavi edilir. Hücre hatlarında Edinsel direnç kurmak iki yöntem kullanılabilir. Bir kademeli doz-yükseltme ve diğer yüksek konsantrasyon pozlama. Daha yüksek bir başarı oranı olduğundan kademeli yükseltme yöntemi daha yaygın olarak kullanılmıştır. Hücreleri ilk inhibitörleri, yaklaşık 10 yarım-azami inhibitör konsantrasyon (IC50) değerinin düşük konsantrasyonlarda için sunulur ve hedef konsantrasyonu elde kadar konsantrasyonu sonra yavaş yavaş 10-30 oranında artar. Yüksek konsantrasyon pozlama yöntem inhibitörü de ebeveyn hücreler neredeyse tamamen öldürdüm ŞA50 değeri fazla olan kültür orta son doz hücrelere açıklamanızı içerir. Bu yüksek konsantrasyon pozlama yöntemi kademeli yükseltme yöntemi daha çok daha düşük bir başarı oranı var.
Bir önceki çalışmada, kombine tedavi ile EGFR-TKI ve MET-TKI vitro sistemde etkili olduğu gösterilmiştir. Bir EFGR-TKI, gefitinib, Edinsel direnç MET-güçlendirme, birlikte 12 ay için kademeli yükseltme yoluyla kurulmuş ve böylece, oluşturulan12PC-9MET1000 olarak adlandırılan gefitinib dayanıklı hücre çizgi oldu.
Burada sunulan Protokolü EGFR-TKI, gefitinib ve MET-TKI, PHA665752 çift kademeli dirençle EGFR mutasyona uğramış NSCLC PC-9 hücreleri elde etmek için bir iki adım doz-yükseltme işlemdir (şekil 1). Bu yöntem elde oluşturmak için hücre hatlarında dayanıklı, yüksek başarı oranı ile gerçekleştirmek nispeten kolaydır. Açıklanan protokol diğer moleküler hedef uyuşturucu ve sitotoksik ajanlar de inhibitörleri ile uygulama için değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gefitinib dayanıklı hücreleri kurmak
- İlk gefitinib konsantrasyonu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) tahlil tarafından belirlemek.
- Kültür büyüme orta hücrelerde PC-9 (RPMI-1640 orta % 10 FBS ve % 1 antibiyotik (penisilin: 100 U/mL ve streptomisin: 100 µg/mL)), 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka
- 1,0 × 105 hücre/mL otomatik bir hücre ( malzemelerin tabloyabakın) counter ve her iyi büyüme orta kullanarak bir 96-şey plaka bu 50 µL tohum kullanarak hücrelere ayarla; son konsantrasyonu hücre 5.0 × 103 hücreleri/iyi olmalıdır.
- Gecede 37 ° C'de plaka kuluçkaya
- Farklı konsantrasyonları gefitinib (, 2 X son konsantrasyonu) 50 µL ekleyin: 0, 0,002, 0.006, 0.02, 0,06, 0,2, 0.6, 2, 6 ve son hacim her 100 µL şey 20 µM böyle bu kuyuları için.
- 37 ° C'de 72 h plaka kuluçkaya
- Boya çözüm 15 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) için her şey (kullanım son %13 konsantrasyon boya çözüm) ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya
- Solubilization/stop çözüm 100 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) formazan çözücü boya çözüm tarafından üretilen için (bkz. Tablo reçetesi) her şey ve bir gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- 570, optik yoğunluk ölçmek ŞA50 değeri elde etmek için bir hücre çoğalması eğri üreterek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm (OD570).
- İstatistiksel yazılım kullanın (grafik verileri görüntülemek ve ŞA50 değeri (Şekil 2) hesaplamak için Malzemeler tablobkz:).
- 6-12 çoğaltır hazırlamak ve deneyler en az üç kez tekrarlayın.
- Sürekli kademeli doz-artması gefitinib PC-9 hücre tedavisi için.
- P100 yemeklerinde büyüme orta % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 10 mL ile Kültür PC-9 hücreleri (alt Konfluent durumda 1 mL)
- -Onda biri ŞA50 değeri, gefitinib p100 çanak içine ekleyin.
- Hücre kültür orta alt Konfluent olduğunda, 1-2 mL hücre 10 mL taze büyüme ortamının gefitinib aynı kültür koşullarında 10-%30 daha yüksek konsantrasyon ile 1 mL damlalıklı kullanarak ekleyin.
- 1 µM ulaşıncaya kadar gefitinib konsantrasyon giderek her Split 10-30 oranında artış; Bu yaklaşık 6-12 ay sürebilir.
Not: gefitinib konsantrasyonu ŞA50 değeri ulaştığında, hücre çoğalması seçilmesinden çok daha yavaş olur ve çok, hücre 2-4 mL taze büyüme orta 10 mL gefitinib ve daha yüksek konsantrasyon ile eklenebilir; gefitinib konsantrasyon artışı azaltmak sorunu çözebilir. Ayrıca, kalan hücreleri-80 ° C'de depolayın ve bunları önceki konsantrasyon yeniden için ideal olacaktır. PC-9 hücre süspansiyon gibi passaging için tripsin kullanmak gereksizdir; Ancak, gefitinib konsantrasyonu artan işlemi sırasında hücreler kültür çanak altına ekleyebilirsiniz. Böyle bir durumda, hücre kazıyıcı yapışık hücreleri ayırma için kullanılabilir. - Kültür gefitinib dayanıklı PC-9 hücre büyüme orta gefitinib 1 µM ile.
- Hücreleri13gefitinib dayanıklılığını onaylamak için MTT tahlil gerçekleştirmek; yüksek protein ve RNA MET (şekil 3A, şekil 4A, B) düzeyde sergiledi çünkü gefitinib dayanıklı bu hücreler PC-9MET1000 (MET1000 hücreler olarak belirtilen) seçilmiştir.
2. çift-direnç Gefitinib ve PHA665752 kurmak
- PHA665752 ilk konsantrasyon MTT tahlil tarafından belirler.
- Kültür MET1000 hücreleri p100 yemeklerinde büyüme orta ve 1 µM gefitinib %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 10 mL ile
- Hücreleri 96-şey plaka 5.0 × 103 hücreleri/iyi ile her iyi büyüme ortamının 50 µL içine tohum. Son konsantrasyonu 1,0 × 10 hücrelere ayarlamak5 hücre/mL otomatik bir hücre kullanarak counter ( Tablo malzemelerigörmek).
- Gecede 37 ° C'de plaka kuluçkaya
- PHA665752, (at 2 son konsantrasyonu X), farklı konsantrasyonlarda hücrelere bir MET-TKI 50 µL ekleyin: 0, 0,002, 0.006, 0.02, 0,06, 0,2, 0.6, 2, 6 ve 20 µM (, 2 X son konsantrasyonu); 2 µM gefitinib dahil olmak üzere Her şey son hacim 100 µL olmalıdır.
- 37 ° C'de 72 h plaka kuluçkaya
- Boya çözüm 15 µL ekleyin (her şey ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya Malzemeler tablobkz:)
- Formazan çözücü boya çözüm tarafından üretilen için 100 µL solubilization/stop çözüm Ekle (her şey ve tekrar gecede 37 ° C'de kuluçkaya için Malzemeler tablobkz:)
- 570, optik yoğunluk ölçmek ŞA50 değeri elde etmek için bir hücre çoğalması eğri üreterek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm (OD570).
- İstatistiksel yazılım kullanın (grafik verileri görüntülemek ve PHA665752 ŞA50 değeri gefitinib (şekil 3B) huzurunda hesaplamak için Malzemeler tablobkz:).
- 6-12 çoğaltır hazırlamak ve deneyler en az üç kez tekrarlayın.
- MET1000 hücrelere gefitinib ve PHA665752 çift direnç kurmak.
- Kültür MET1000 hücreleri p100 yemekler ile büyüme ortamının 10 mL ve 1 µM gefitinib 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka
- -Onda biri PHA665752 ŞA50 değeri gefitinib aynı kültür koşulları ile 1 µM huzurunda büyüme orta içine ekleyin.
- 1 µM ulaşana kadar PHA665752 konsantrasyon giderek her Split 10-30 oranında artırın. Bu yaklaşık 6-12 ay sürebilir.
Not: PHA665752 konsantrasyonu ŞA50 değeri ulaştığında, hücre çoğalması seçilmesinden çok daha yavaş olur ve kadar 2-4 ml hücre PHA665752 daha yüksek konsantrasyon ile 1 mL damlalıklı 10 ml taze büyüme ortamının kullanarak eklenebilir; PHA665752 konsantrasyon artışı azaltmak sorunu çözebilir. Ayrıca, kalan hücreleri-80 ° C'de depolayın ve bunları önceki konsantrasyon yeniden için ideal olacaktır. Tripsin passaging için kullanmak gerekli değildir; Ancak, PHA665752 konsantrasyon artış sırasında hücreler kültür çanak altına ekleyebilirsiniz. Bu gibi durumlarda, bir hücre kazıyıcı hücreleri ayırmak için kullanılabilir. - Son olarak, kültür PC-9 hücreleri gefitinib ve PHA665752 için 1 µM her gefitinib ve PHA665752 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka ile büyüme orta dayanıklı
- Hücreleri çift gefitinib ve PHA66575213için dayanıklı ve gefitinib huzurunda PHA665752 için hassas değiller onaylamak için MTT tahlil gerçekleştirmek; Bu çift-direnç hücreler PC-9 (DR hücreler olarak belirlenmiş) DR adlandırılmıştır (şekil 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu el yazması sunulan Protokolü bakış Resim 1gefitinib ve PHA665752 alınan çift-direnç indüksiyon PC-9 hücrelerinde 2-adım doz-yükseltme yordam tarafından da dahil olmak üzere, gösterilir. Şekil 2 ebeveyn PC-9 hücrelerin çoğalması gefitinib artar olan konsantrasyonu olarak bir düşüş gösterir. Bu doz-yükseltme müdahalede sonra PC-9 hücreleri için gefitinib demirdi gösterir. Şekil 3 PC-9MET1000 hücreleri gefitinib direnç sergileyen ama gefitinib huzurunda bir MET TKI PHA665752, hassas olduğunu göstermektedir. PC-9 hücre çoğalması, gefitinib, gefitinib için duyarlı olduklarını gösteren daha yüksek konsantrasyonlarda bastırıldı. Ancak, PC-9MET1000 hücreleri azalan nükleer silahların yayılmasına karşı gefitinib, gefitinib direnç satın aldığını belirten yüksek konsantrasyonlarda bile belli etmedi. PC-9MET100 hücreleri gefitinib 72 h için olup PHA665752 konsantrasyonları artan ile tedavi edildi zaman, onun yayılması bir ÇMT tahlil tarafından ölçülen önemli ölçüde azalmıştır. Ayrıca gefitinib yokluğunda PC-9MET1000 hücrelerin çoğalması mütevazı bir düşüş oldu. Böylece, gefitinib ve PHA665752 bir arada Hücre proliferasyonu ile PHA665752 yalnız tedavi daha etkili bir şekilde bastırır.
Şekil 4 PC-9MET1000 ve PC-9 DR hücrelerinde MET (protein ve RNA) güçlendirilmiş düzeyini göstermektedir; alınan hiçbir mutasyonlar EGFR ve MET mevcut. Bu nedenle, yan yol sinyal ortaya çıkması son derece EGFR-TKI ve/veya MET-TKI Edinsel direnç bir nedeni olarak önerilmektedir. Şekil 5 , PC-9 DR hücrelerin direncini PHA665752 için gefitinib, 1 µM huzurunda bir ÇMT tahlil tarafından ölçülen gösterir. PC-9MET1000 hücrelerin çoğalması inhibe rağmen gefitinib ve PHA665752 ile tedavi tarafından PC-9 DR hücreleri çift-gefitinib ve PHA665752 dayanıklı olduklarını belirten tedavi atlattı. Böylece, bir 2-adım doz-yükseltme prosedür yoluyla PC-9 hücreleri gefitinib direnç elde ve PC-9MET1000 hücreleri PHA665752 direnç gefitinib 1 µM huzurunda elde. Şekil 6 MET1000 ve DR anchorage bağımsız yayılması, hücreleri varlığı veya yokluğu PHA665752 ve gefitinib yumuşak agar gösterir. PC-9MET1000 ve PC-9 DR hücrelerinin büyümesini yumuşak agar, bu sublines içinde her ikisi 2D ve 3D sistem büyümek olabilir gösteren Tarih gözlendi. Böylece, dayanıklı sublines 2D sistemlerinde büyümek mümkün değil varlık sınırlamayı aşmak. Ayrıca, PC-9 DR hücreleri ama değil PC-9MET1000 hücreleri, bir agar gefitinib ve PHA665752 1 µM ile büyümek. Bu sonuç PC-9 DR hücreleri gefitinib ve PHA665752 dayanıklı ve bir 3D kültür sistemi içinde büyümek olabilir gösterir. Kurulan dayanıklı sublines tumorigenic özelliği bir koloni oluşumu tahlil veya vivo içinde nakli14tarafından kontrol edilmelidir.
Resim 1: Çift-direniş oluşturma şeması: PC-9 DR hücreleri PC-9 hücrelerden.
Diyagramı çift dayanıklı klonlar PC-9 hücrelerden tarafından 2-adım doz-yükseltme yordamı oluşturmak için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: EGFR-TKI gefitinib PC-9 hücre proliferasyonunu inhibe.
PC-9 hücre içine 5 x 103 hücreleri/iyi ile her iyi gecede önceden inkübe ve 72 h için belirtilen konsantrasyonlarda gefitinib ile tedavi, büyüme ortamının 50 µL bir 96-şey plaka numaralı seribaşı. Bir ÇMT tahlil gerçekleştirilmiş ve aşırı doz570 Mikroplaka okuyucu tarafından ölçüldü. ŞA50 değeri 0.048 yapıldı ± 0,01 µM. veri olarak gösterilir 6 kuyuları için ortalama ± SEM. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: PC-9MET1000 hücreleri gefitinib direnç sergilendi ama gefitinib 1 µM huzurunda PHA665752 ile tedavi, nükleer silahların yayılmasına karşı bastırılır.
(A)PC-9 ve MET1000 hücreleri 96-şey plakaları 5 x 103 hücreleri/iyi ile 50 µL büyüme içine numaralı seribaşı her şey, bir gecede önceden inkübe ve gefitinib 72 h. için belirtilen konsantrasyonlarda ile tedavi orta (B) MET1000 hücre içine bir 96-şey plaka 5 x 103 hücreleri/iyi ile her iyi büyüme ortamının 50 µL seribaşı , gecede önceden inkübe ve sonra PHA665752 ile belirtilen konsantrasyonlarda gefitinib 72 h için 1 µM olup tedavi. Bir ÇMT tahlil gerçekleştirilmiş ve aşırı doz570 Mikroplaka okuyucu tarafından ölçüldü. ŞA50 değeri gefitinib varlığında bu gefitinib yokluğunda değil belirlendi 0,014 ± 0,01 µM, oldu. Veri 6 kuyuları için ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: MET amplifikasyon yok Edinsel mutasyonların EGFR ve MET ile PC-9MET1000 ve PC-9 DR hücrelerinde gözlendi.
Fosfor-MET ve toplam MET düzeyde Western blot analizi ile tespit(a)ifade. Β-aktin yükleme denetimi olarak kullanıldı. (B) mRNA transkript PC-9, PC-9MET1000 ve PC-9 DR hücrelerden sayısal gerçek zamanlı RT-PCR kullanarak ve bu GAPDH ile normalleştirilmiş. Veri ± SEM demek gibi PC-9 değerleri göreli olarak sunulmuştur (n = 8). İstatistiksel anlamlılık tahmin kullanarak iki kuyruklu Öğrenci t-testi ve bir p < 0,05 olarak istatistiksel olarak anlamlı kabul. *, p < 0,05, PC-9 değeri ile karşılaştırıldığında. (C) Exon 19-21 EGFR gen ve Met gen exon 14-21 genomik DNA PCR tarafından güçlendirilmiş. PCR ürünlerinin sonra saflaştırılmış ve analiz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: PC-9 DR PHA665752 için dayanıklı gefitinib 1 µM huzurunda hücrelerdir.
DR hücreleri içine 5 x 103 hücreleri/iyi ile her iyi gecede önceden inkübe ve daha sonra gefitinib 72 h için 1 µM huzurunda belirtilen konsantrasyonlarda PHA665752 ile tedavi, büyüme ortamının 50 µL bir 96-şey plaka numaralı seribaşı. Bir ÇMT tahlil gerçekleştirilmiş ve aşırı doz570 Mikroplaka okuyucu tarafından ölçüldü. Veri 6 kuyuları için ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: varlığı veya yokluğu PHA665752 ve gefitinib yumuşak agar üzerinde PC-9MET1000 ve PC-9 DR hücrelerin çoğalması Anchorage bağımsız.
Hücreler (1 × 104) FBS % 0.6 yumuşak agar ile ön kaplamalı 6-şey tabak içine seribaşı % 10 ile % 0.3 agar yeniden askıya. Ertesi gün, hücreleri gefitinib (1 µM) ile tedavi edildi ve PHA665752 (1 µM) ve 14-21 gün boyunca inkübe. Koloniler %0,005 kristal violet için 1 h. ile lekeli Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan Protokolü 2-adım doz-yükseltme yöntemi içinde vitrokullanarak kanser hücreleri alınan çift direnç kurulması için kullanılabilir. Birçok araştırma kağıtları PC-9 hücreleri EGFR-TKI (gefitinib veya erlotinib) direnç T790M EGFR mutasyon15,16geliştirilen bildirdi. Ancak, biz T790M mutasyonlar bizim PC-9MET1000 hücreleri exon 20 doğrudan sıralama (şekil 4 c) tarafından tespit etmedi. Ayrıca, MET amplifikasyon yolu sinyal bir yan yol hareket gözlendi. Böylece, PC-9MET1000 hücreleri son derece nadirdir. Biz daha önce sürekli kademeli doz-yükseltme dozu 1 µM (PC-9MET1000 hücreleri olarak adlandırılır)17ulaşana kadar 12 ay boyunca gerçekleştirilen sonra akciğer adenokarsinom PC-9 hücreleri EGFR 15-bp silinmesiyle exon 19 içinde barındıran gefitinib-direnç MET güçlendirme ile geliştirilen bildirdi. Bu hücre kültürünü bir MET-TKI gefitinib huzurunda hassastı. Direnç için EGFR - ve MET-TKIs, arkasında mekanizması belirlemek için sürekli kademeli doz-yükseltme yöntemini çift-direnç MET-TKI, PHA665752 ve EGFR-TKI, gefitinib, PC-9MET1000 hücreleri12ikna etmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem ötesinde gefitinib tedavi hastalığın ilerlemesini çalışmaya bir klinik sonuçlarını dayanıyordu. MET-güçlendirilmiş EGFR-TKI-direnç söz konusu olduğunda, tek bir MET inhibitörü önemli ölçüde hücre çoğalması inhibe. Çünkü sinyal iletimi reseptör ve aşağı arasında moleküllerdir ayrılmış (EGFR-ERK1/2 ve MET-AKT), EGFR ve MET kombine bastırılması gerekli olacaktır. Başka bir akciğer adenokarsinom hücre satırında ayrıca limanlar bir EGFR mutasyon, EGFR-TKI direnç HCC827 MET güçlendirme ile geliştirilmiştir. Suda vd. HCC827 hücreleri erlotinib MET-TKI geliştirilen PHA665752 direnç MET-TKI ve EGFR-TKI18huzurunda konsantrasyonları artan maruz bildirdi. Ayrıca, klinik durumlarda ile MET-amplifikasyon EGFR-TKI-dirençle çalışmaya yapılmaktadır. Böylece, tedavi ile EGFR-TKI sonra alınan MET-TKI direnç mekanizmasının araştırmak için çift-direnç MET inhibitörleri ve EGFR inhibitörü ikna etmek gereklidir.
Protokol burada işin içinde kademeli doz-artması MET-TKI, PHA665752, gefitinib 1 µM huzurunda açıklanan. En güvenilir ve en sık kullanılan yöntem18,19kademeli doz-yükseltme yöntemidir. Bu iletişim kuralı en kritik adımda engelleyici ŞA50 değeri almaktır. Bu değer doğru bir şekilde tespit değil, hücreleri tüm kültür tabak içinde büyümeye başarısız olur. Hücre büyümesini yavaşlatmak başlıyorsa, bu nedenle, engelleyici konsantrasyon artışı azaltmak sorunu çözebilir. Ayrıca, hücreleri ölmeye başlayacak olursa, bunları önceki konsantrasyon yeniden için kalan hücreleri-80 ° C'de saklamak ideal olacaktır.
Hücre hatlarında direnç kurmak için alternatif bir yöntem içinde doğrudan, engelleyici hedef konsantrasyon hücreleri maruz kalır yüksek konsantrasyon pozlama yöntem ve hayatta kalan dayanıklı hücreleri başlayana kadar Proliferasyona hücreler kültürlü. Bu yöntem daha klinik olmasına rağmen başlangıçta idare, engelleyici, hedef konsantrasyonu hemen tüm ebeveyn hücrelerini öldürmek çünkü daha düşük bir başarı oranı vardır. İlginçtir, bu iki yöntem ile elde edilen dayanıklı sublines farklı hücresel özellikleri19,20sergi bildirilmiştir.
Direnç kurmak için başka bir yöntem bir hücre süspansiyon (1,0 × 106-2.0 × 107) fareler, yanları enjekte edilir in vivo direnç yöntemi ve tümör 200 mm3birimi ulaştığında, fareler tabi sürekli için tedavi inhibitörleri ile. Tamamen yanıt ve sırasında tekrarlayabilir tümörler tedavi hasat, kıyılmış, tripsin ile sindirmek ve sonra filtre ve kültür yemekleri numaralı seribaşı yapılmaktadır. Bu yöntem, her ne kadar biraz karmaşık, antikor-direnç durumlarda etkin bir şekilde kullanılabilir. Ancak, ne zaman direniş in vivo sistemdeki bir vitro sistemi hücreleri bazen transfer gösteren tümörler 2D kültür sistemleri büyümeye başarısız. Bu nedenle, 3D kültür sistemleri membran matris gibi kullanılan21olmalı.
Bu yöntemlerden her üç gerçekleştirmek için oldukça uzun bir zaman gerektirse de, kademeli doz-yükseltme yöntemi en ekonomik olanıdır. Açıkça anlama ve eğitim inhibitörü-direnç alma işlemi için en uygun yöntemdir. Buna ek olarak, diğer iki yöntemden birini başarı oranı önemli ölçüde yavaş doz-yükseltme yöntemi daha düşük.
Direniş kurulduktan sonra bu hücre satırları tumorigenic potens test etmek gereklidir. Koloni oluşumu testleri veya vivo içinde nakillerine sık sık bu amaçla (şekil 6) istihdam edilmektedir. Bu yöntemler 2D kültür sistemleri kullanarak dezavantaj üstesinden.
Bir büyük bu yöntemler Edinsel direnç kez hücrelerle doğru insan kanser hücrelerinin direnişinde yansıtmıyor kısıtlamasıdır. Bu nedenle, çalışmalar vitro modelleri aracılığıyla keşfetti mekanizmaları insan doku örneklerinde biyopsi örneklerinde tekrarlanan testleri ile teyit edilmesi. Buna ek olarak, ne bu protokollerin Edinsel direnç tümör hücrelerinin gelişimi sırasında arkasında mekanizması incelenmesi için yararlı olabilir, Edinsel direnç tümör microenvironment değişiklikler tarafından akımıdır mümkündür. Bu iletişim kuralları yalnızca kanser hücrelerinin etkinliğini araştıran başka bir ciddi sınırlama bu. Pek çok araştırmacı için kullanılabilir olan insan dokusu bankalardan dokuları kullanmak daha iyi olurdu.
Burada sunulan Protokolü diğer moleküler inhibitörleri de direnç kurmak için değiştirilebilir. Bu nedenle, bu yöntem gelecekte kanser kontrol etmek için tedavi araçları geliştirmek için potansiyel olarak yararlı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Biz üyeleri onların düşünceli yorum ve faydalı tavsiyeler için moleküler Onkoloji Enstitüsü ve Editage İngilizce dil düzenleme ile onların yardım için teşekkür ederim. Bu eser için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya üzerinden (2012-2016) özel üniversitelerde Stratejik Araştırma Vakfı MEXT desteklenen Program tarafından desteklenmiştir. Tohru Ohmori (2015-2016) finansman araştırma Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Almanya) aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
