Summary
En in vitro- metode til fastlæggelse af dobbelt modstand mod en EGFR-TKI og en MET-TKI i kræftceller er beskrevet. Denne metode er nyttig for at udvikle behandlinger til patienter med EGFR-mutationer, som udviser sygdomsprogression trods EGFR-TKI behandling med MET-forstærkning. Det kan også ændres for hæmmere rettet mod andre molekyler.
Abstract
Resistens udgør en stor udfordring i kræftbehandling. Generation af resistente sublines in vitro- er nødvendige for at opdage nye mekanismer til at overvinde denne udfordring. Her, en 2-trins dosis-eskalering metode til fastlæggelse af dual-modstand mod en epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)-tyrosin kinase inhibitor (TKI), gefitinib og en MET-TKI, PHA665752, er beskrevet. Denne metode er baseret på enkle trinvis dosis-eskalering af inhibitorer for inducerende erhvervet modstand i cellelinjer. Den alternative metode til generering af resistente sublines indebærer udsætter celler for høje koncentrationer af inhibitor i ét trin. Metoden trinvis dosis-eskalering har en højere mulighed for med held inducerende erhvervet modstand end denne metode. Aktivering EGFR er mutationer biomarkører for en reaktion på behandling med EGFR-TKI, som er en anvendt første linje behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), at havnen disse mutationer. Men trods rapporter om effektive svar, brug af EGFR-TKI er begrænset, fordi tumorer uundgåeligt erhverve modstand. De vigtigste mekanismer bag EGFR-TKI modstand omfatte en sekundær mutation på webstedet gatekeeper, T790M i exon 20 af EGFR og en bypass signal om markedsøkonomisk behandling. En mulig løsning på problemet vil således være en kombination af EGFR-TKI og markedsøkonomisk-TKI. Denne kombinerede behandling har vist sig at være effektiv i en in vitro- undersøgelse model. Erhvervede gefitinib-modstand blev etableret gennem MET-forstærkning af trinvis dosis-eskalering af gefitinib i 12 måneder, og en cellelinje opkaldt PC-9MET1000 blev genereret i en tidligere undersøgelse. For at yderligere undersøge mekanismerne af erhvervede MET-TKI og EGFR-TKI blev modstand, en MET-TKI, PHA665752, administreret til disse celler med trinvis dosis-eskalering i overværelse af gefitinib i 12 måneder. Denne protokol har også været anvendt med succes for en række Kombinationsbehandlinger at etablere erhvervet resistens over for andre hæmmer molekyler.
Introduction
Muterede mutationer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er fundet i en delmængde af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og er vigtige prædiktive biomarkører for denne sygdom1,2. Disse aktivering EGFR mutationer oftest forekomme som en i-frame sletning i exon 19 (delE746-A750) eller et punkt mutation erstatter leucin med arginin på codon 858 af exon 21 (L858R) i EGFR tyrosin kinase domæne3,4. Behandling med EGFR-tyrosin kinase hæmmere (TKIs) er en klinisk effektiv behandling for patienter med NSCLC husly EGFR mutationer. Men, denne terapi er begrænset af den uundgåelige erhvervelse af modstand mod EGFR-TKIs som gefitinib og erlotinib. Den mest almindelige erhvervet resistens opstår gennem en sekundær T790M mutation i exon 20 af EGFR, som blev fundet i ca. 60% af patienter, der har erhvervet EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) modstand. Andre molekylære mekanismer forbundet med erhvervet modstand mod EGFR-TKIs er aktivering af bypass signalering forårsaget af markedsøkonomisk forstærkning, transformation af små-cellet lungekræft og epitelial til mesenchymale overgangen5,6. Receptoren for den hepatocyt vækst faktor, kodet af genet MET som er dysregulatedin mange tumorer, er blevet rapporteret til at være en vigtig kandidat til målrettede behandlinger7,8.
Strategier for at overvinde den erhvervede modstand mod EGFR-TKIs er nu under klinisk evaluering. Prækliniske og kliniske undersøgelser har vist, at tredje generation EGFR-hæmmere såsom osimertinib er effektive til patienter med T790M mutation9. Væksten i EGFR-mutant kræftformer med markedsøkonomisk forstærkning kan desuden hæmmes af kombineret behandling med EGFR - og markedsøkonomisk-TKIs6,10. Kliniske forsøg vurderer en kombination af markedsøkonomisk behandling og EGFR-hæmmere hos patienter med erhvervet modstand mod gefitinib og erlotinib er igangværende nu11.
For at studere den molekylære mekanisme af erhvervet modstand mod kemoterapeutika, behandles cellelinjer, der i første omgang reagerer på hæmmere løbende med disse hæmmere. Der findes to metoder til at etablere erhvervet modstand i cellelinjer. Ene er trinvis dosis-eskalering, og den anden er høj koncentration eksponering. Trinvis eskalering metode er blevet mere almindeligt brugt, fordi det har en højere succesrate. Cellerne er først udsat for lave koncentrationer af hæmmere, næsten en tiendedel af værdien halv-maksimal hæmmende koncentration (IC50), og koncentrationen er gradvist derefter steg med 10-30% indtil målet koncentration opnås. Høj koncentration eksponering metode indebærer at udsætte celler til den sidste dosis af inhibitor dyrkningsmedium, hvilket er mere end værdien IC50 så forældrenes cellerne dræbes næsten helt. Denne høj koncentration eksponering metode har meget en lavere succesrate end metoden trinvis eskalering.
I en tidligere undersøgelse, blev kombineret behandling med EGFR-TKI og markedsøkonomisk-TKI vist sig at være effektiv i en in vitro- system. Erhvervet modstand mod en EFGR-TKI, gefitinib, blev etableret gennem gradvis optrapning i 12 måneder, sammen med MET-forstærkning, og således en gefitinib-resistente cellelinje kaldet PC-9MET1000 blev genereret12.
Protokollen præsenteres her er en totrinsprocedure på dosis-eskalering søges EGFR-muteret NSCLC PC-9 celler med dobbelt modstand mod EGFR-TKI, gefitinib og en MET-TKI, PHA665752 (figur 1). Denne metode til oprettelse af erhvervet resistente i cellelinjer er relativt nemme at udføre, med en høj succesrate. Den beskrevne protokol kan ændres for anvendelse med hæmmere af andre Molekylær målet narkotika og cytotoksiske stoffer samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fastlægge Gefitinib-resistente celler
- Bestemme den oprindelige gefitinib koncentration af 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) assay.
- Kultur PC-9 celler i vækstmediet (RPMI-1640 medium med 10% FBS og 1% antibiotika (penicillin: 100 U/mL og streptomycin: 100 µg/mL)), i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Justere celler til 1,0 × 105 celler/mL ved hjælp af en automatiseret celle counter (Se tabel over materialer) og seed 50 µL af dette i hver brønd med en 96-brønd plade ved hjælp af vækstmediet; den endelige koncentration af celler skal være 5.0 × 103 celler/brønd.
- Inkuber plade natten over ved 37 ° C.
- Tilføje 50 µL af gefitinib (på 2 X endelige koncentration) ved forskellige koncentrationer: 0, 0,002, 0.006, 0.02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 og 20 µM disse brønde sådan at den endelige mængden i hver godt er 100 µL.
- Inkuber plade i 72 timer ved 37 ° C.
- Tilføj 15 µL af opløsningen farvestof (Se Tabel af materialer) til hver brønd (brug endelig 13% koncentration af farvestof løsning), og der inkuberes i 4 timer ved 37 ° C.
- Tilsæt 100 µL af opløsningen oploesning/stop (Se Tabel af materialer) for solubilizing af formazankoncentrationen produceret af farvestof løsning (Se Tabel af materialer) i hver godt og Inkuber det natten over ved 37 ° C.
- Måle det optiske densitet ved 570 nm (OD570) ved hjælp af en mikrotiterplade læser for at opnå IC50 værdien ved at generere en celleproliferation kurve.
- Bruge en statistisk software (Se Tabel af materialer) grafisk vise dataene, og beregne værdien IC50 (figur 2).
- Forbered 6-12 gentagelser og gentage eksperimenterne mindst tre gange.
- Kontinuerlig trinvis dosis-eskalering af gefitinib for behandling af PC-9 celler.
- Kultur PC-9 celler (1 mL i sub sammenflydende betingelse) i p100 retter med 10 mL af vækstmediet i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Tilføje en tiendedel af IC50 værdien af gefitinib i p100 skål.
- Når cellerne i dyrkningsmediet bliver sub sammenflydende, tilsættes 1-2 mL af celler 10 mL frisk vækstmedium ved hjælp af en 1-mL pipette med 10-30% højere koncentration af gefitinib i samme dyrkningsbetingelserne.
- Øge gefitinib koncentration gradvist med 10-30% med hver split indtil 1 µM; Dette kan tage omkring 6-12 måneder.
Bemærk: Når koncentrationen af gefitinib når IC50 værdi, celleproliferation bliver betydeligt langsommere, og så 2-4 mL af celler kan tilsættes 10 ml frisk vækstmediet med højere koncentration af gefitinib; at reducere stigningen i koncentrationen af gefitinib måske løse problemet. Det ville desuden være ideel til at gemme de resterende celler ved-80 ° C, og genbruge dem på den tidligere koncentration. Som PC-9 celler i suspension, er det unødvendigt at bruge trypsin for passaging; under processen med stigende gefitinib koncentration, kan cellerne vedhæfte til bunden af kultur parabol. I en sådan situation, kan en celle-skraber bruges til afmontering af vedhængende celler. - Kultur de gefitinib-resistente PC-9 celler i vækstmediet med 1 µM af gefitinib.
- Udføre MTT assay for at bekræfte gefitinib-modstand af celler13; disse gefitinib-resistente celler blev opkaldt PC-9MET1000 (udpeget som MET1000 celler), fordi de udstillede øget protein og RNA niveauer af MET (figur 3A, figur 4A, B).
2. at etablere dobbelt-modstand mod Gefitinib og PHA665752
- Bestemme den oprindelige koncentration af PHA665752 af MTT assay.
- Kultur MET1000 celler i p100 retter med 10 mL af vækstmediet og 1 µM gefitinib i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Frø af celler ind i en 96-brønd plade på 5,0 × 103 celler/brønd med 50 µL af vækstmediet i hver brønd. Justere den endelige koncentration af celler til 1,0 × 105 celler/mL ved hjælp af en automatiseret celle counter (Se Tabel af materialer).
- Inkuber plade natten over ved 37 ° C.
- Tilsæt 50 µL af PHA665752, en MET-TKI (på 2 X endelige koncentration), at cellerne i forskellige koncentrationer: 0, 0,002, 0.006, 0.02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 og 20 µM herunder 2 µM gefitinib (på 2 X slutkoncentration); den endelige mængden i hver brønd bør være 100 µL.
- Inkuber plade i 72 timer ved 37 ° C.
- Tilføj 15 µL af opløsningen farvestof (Se Tabel af materialer) til hver godt, og der inkuberes i 4 timer ved 37 ° C.
- Tilføj 100 µL af oploesning/stop løsning for solubilizing af formazankoncentrationen produceret af farvestof løsning (Se Tabel af materialer) til hver godt, og igen inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Måle det optiske densitet ved 570 nm (OD570) ved hjælp af en mikrotiterplade læser for at opnå IC50 værdien ved at generere en celleproliferation kurve.
- Bruge en statistisk software (Se Tabel af materialer) grafisk vise dataene, og beregne IC50 værdien af PHA665752 i nærværelse af gefitinib (figur 3B).
- Forbered 6-12 gentagelser og gentage eksperimenterne mindst tre gange.
- Etablere dual-modstand i MET1000 celler gefitinib og PHA665752.
- Kultur MET1000 celler i p100 retter med 10 mL af vækstmediet, og 1 µM gefitinib i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Tilføje en tiendedel af IC50 værdien af PHA665752 i vækstmediet i nærværelse af 1 µM af gefitinib med samme dyrkningsbetingelserne.
- Øge PHA665752 koncentrationen gradvist med 10-30% med hver split indtil 1 µM. Dette kan tage omkring 6-12 måneder.
Bemærk: Når koncentrationen af PHA665752 når IC50 værdi, celleproliferation bliver betydeligt langsommere, og så 2-4 ml af celler kan tilføjes ved hjælp af en 1-mL pipette på 10 mL af den friske vækstmediet med højere koncentration af PHA665752; at reducere stigningen i koncentrationen af PHA665752 kan løse problemet. Det ville desuden være ideel til at gemme de resterende celler ved-80 ° C, og genbruge dem på den tidligere koncentration. Det er unødvendigt at bruge trypsin for passaging; dog under stigning af PHA665752 koncentration, kan cellerne vedhæfte til bunden af kultur parabol. I sådanne situationer, kan en celle-skraber bruges til at løsne cellerne. - Endelig kultur PC-9 celler resistente over for både gefitinib og PHA665752 i vækstmediet med 1 µM hver gefitinib og PHA665752 i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Udføre MTT assay for at bekræfte, at cellerne er dual-resistente gefitinib og PHA66575213, og at ikke der er følsomme over for PHA665752 i nærværelse af gefitinib; disse dobbelt-modstand celler blev opkaldt PC-9 DR (udpeget som DR celler) (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversigt over protokollen præsenteret i dette håndskrift er vist i figur 1, inklusive induktion af erhvervede dual-modstand mod gefitinib og PHA665752 i PC-9 celler af en 2-trins dosis-eskalering procedure. Figur 2 viser et fald i udbredelsen af forældrenes PC-9 celler som koncentrationen af gefitinib stigninger. Dette indikerer, at PC-9 celler blev følsomme over for gefitinib efter proceduren dosis-eskalering blev udført. Figur 3 viser, at PC-9MET1000 celler udviser modstand mod gefitinib, men er følsomme over for en markedsøkonomisk-TKI, PHA665752, tilstedeværelse af gefitinib. PC-9 celleproliferation blev undertrykt i højere koncentrationer af gefitinib, der angiver, at de var følsomme over for gefitinib. PC-9MET1000 celler viste imidlertid ikke nedsat spredning selv ved høje koncentrationer af gefitinib, der angiver, at de havde erhvervet modstand mod gefitinib. Når PC-9MET100 celler blev behandlet med stigende koncentrationer af PHA665752 i tilstedeværelse eller fravær af gefitinib for 72 h, var dens spredning, som målt ved en MTT assay, faldt betydeligt. Der var også et beskedent fald i udbredelsen af PC-9MET1000 celler i mangel af gefitinib. Således, en kombination af gefitinib og PHA665752 ville undertrykke celleproliferation mere effektivt end behandling med PHA665752 alene.
Figur 4 viser forstærket niveauer af MET (både protein og RNA) i PC-9MET1000 og PC-9 DR celler; ingen erhvervet mutationer er til stede i EGFR og markedsøkonomisk behandling. Derfor er fremkomsten af bypass signalering meget foreslået som en årsag til den erhvervede modstand mod EGFR-TKI og/eller MET-TKI. Figur 5 viser modstanden i PC-9 DR celler til PHA665752 i nærværelse af 1 µM af gefitinib, målt ved en MTT assay. Selv om udbredelsen af PC-9MET1000 celler blev hæmmet af behandling med gefitinib og PHA665752, overlevede PC-9 DR celler den behandling, der angiver, at de var dobbelt-resistente gefitinib og PHA665752. Således gennem en 2-trins dosis-eskalering procedure, PC-9 celler erhvervet modstand mod gefitinib og PC-9MET1000 celler erhvervet modstand mod PHA665752 i nærværelse af 1 µM af gefitinib. Figur 6 viser forankring-uafhængig spredning af MET1000 og DR celler i blød agar i tilstedeværelse eller fravær af PHA665752 og gefitinib. Væksten i både PC-9MET1000 og PC-9 DR celler blev observeret på bløde agar, der angiver, at disse sublines kunne vokse i både 2D og 3D-systemer. Således, at resistente sublines havde overvundet begrænsning af ikke at kunne vokse i 2D systemer. Derudover PC-9 DR celler, men ikke PC-9MET1000 celler, kunne vokse i en agar med 1 µM gefitinib og PHA665752. Dette resultat angiver, at PC-9 DR celler var resistente over for både gefitinib og PHA665752, og kunne vokse i 3D kultur system så godt. Egenskaben tumorfremkaldende af de etablerede resistente sublines bør kontrolleres af en koloni dannelse assay eller i vivo transplantation14.
Figur 1: Skema til at generere dual-modstand: PC-9 DR celler fra PC-9 celler.
Diagram til at generere dual-resistente kloner fra PC-9 celler af en 2-trins dosis-eskalering procedure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: EGFR-TKI gefitinib hæmmede udbredelsen af PC-9 celler.
PC-9 celler var seedet til en 96-brønd plade på 5 x 103 celler/brønd med 50 µL af vækstmediet i hver brønd, forud inkuberet natten over, og derefter behandlet med gefitinib ved de angivne koncentrationer i 72 timer. En MTT analyse blev udført og OD570 blev målt af en mikrotiterplade læser. IC50 værdi var 0,048 ± 0,01 µM. Data er vist som gennemsnit ± SEM til 6 wells. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: PC-9MET1000 celler udstillet modstand mod gefitinib, men behandling med PHA665752 i nærværelse af 1 µM af gefitinib undertrykt dens spredning.
(A) PC-9 og MET1000 celler var seedede i 96-brønd plader på 5 x 103 celler/brønd med 50 µL af vækst medium i hver godt, forud inkuberet natten over, og derefter behandlet med gefitinib ved de angivne koncentrationer for 72 h. (B) MET1000 celler var seedet til en 96-brønd plade på 5 x 103 celler/brønd med 50 µL af vækstmediet i hver brønd , forud inkuberet natten over, og derefter behandlet med PHA665752 ved de angivne koncentrationer i tilstedeværelse eller fravær af 1 µM af gefitinib i 72 timer. En MTT analyse blev udført og OD570 blev målt af en mikrotiterplade læser. IC50 værdi ved tilstedeværelse af gefitinib var 0.014 ± 0,01 µM, mens der i mangel af gefitinib ikke blev bestemt. Data er vist som gennemsnit ± SEM til 6 wells. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: MET forstærkning blev observeret i PC-9MET1000 og PC-9 DR celler med ingen erhvervet mutationer i EGFR og markedsøkonomisk behandling.
(A) udtryk niveauer af fosfor-MET og samlede markedsøkonomisk behandling blev bestemt af Western blot analyse. Β-actin blev brugt som en loading kontrol. (B) mRNA udskrifter fra PC-9, PC-9MET1000 og PC-9 DR celler blev kvantificeres ved hjælp af real-time RT-PCR og normaliserede med de GAPDH. Data er præsenteret i forhold til PC-9 værdier, som betyder ± SEM (n = 8). Statistisk signifikans blev anslået ved hjælp af den tosidede Student t-test, og en p < 0,05 blev anset for statistisk signifikant. *, p < 0,05, sammenlignet med PC-9 værdi. (C) Exon 19-21 i EGFR genet og exon 14-21 af Met-genet blev forstærket fra genomisk DNA af PCR. PCR produkter blev derefter renset og analyseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: PC-9 DR celler er resistente over for PHA665752 i nærværelse af 1 µM af gefitinib.
DR celler var seedet til en 96-brønd plade på 5 x 103 celler/brønd med 50 µL af vækstmediet i hver brønd, forud inkuberet natten over, og derefter behandlet med PHA665752 i de angivne koncentrationer i nærværelse af 1 µM på gefitinib i 72 timer. En MTT analyse blev udført og OD570 blev målt af en mikrotiterplade læser. Data er vist som gennemsnit ± SEM til 6 wells. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: forankring-uafhængig spredning af PC-9MET1000 og PC-9 DR celler på bløde agar i tilstedeværelse eller fravær af PHA665752 og gefitinib.
Celler (1 × 104) re suspenderet i 0,3% agar med 10% FBS var seedede i 6-godt plader overfladebelagt med 0,6% blød agar. Den følgende dag, celler blev behandlet med gefitinib (1 µM) og PHA665752 (1 µM) og derefter inkuberes i 14-21 dage. Kolonier var plettet med 0,005% krystalviolet for 1 h. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her kan bruges til oprettelse af erhvervede dual-modstand i kræftceller ved hjælp af en 2-trins dosis-eskalering metode in vitro. Mange forskningsartikler har rapporteret, at PC-9 celler udviklet EGFR-TKI (gefitinib eller erlotinib) modstand gennem T790M EGFR mutationer15,16. Men vi gjorde ikke opdager T790M mutationer i exon 20 af vores PC-9MET1000 celler af direkte sekventering (figur 4 c). Derudover blev MET forstærkning observeret for at fungere som en bypass signalering pathway. Således er PC-9MET1000 celler ekstremt sjældne. Vi har tidligere rapporteret, at lunge adenocarcinom PC-9 celler husly en 15-bp sletning i exon 19 af EGFR udviklet gefitinib-modstand med markedsøkonomisk forstærkning efter kontinuerlig trinvis dosis-eskalering blev udført i 12 måneder indtil dosis nået 1 µM (opkaldt PC-9MET1000 celler)17. Denne cellelinje var følsomme over for en markedsøkonomisk-TKI i overværelse af gefitinib. For at fastlægge mekanismen bag modstand til EGFR - og markedsøkonomisk-TKIs, blev en kontinuerlig trinvis dosis-eskalering metode udviklet for at fremkalde dual-modstand til MET-TKI, PHA665752 og EGFR-TKI, gefitinib i PC-9MET1000 celler12. Denne metode har påberåbt sig resultaterne af et klinisk forsøg at studere progression af sygdommen ud over gefitinib behandling. For markedsøkonomisk behandling-forstærket EGFR-TKI-modstand, ville en enkelt MET hæmmer ikke betydeligt hæmmer celledelingen. Fordi signaltransduktion mellem receptor og downstream molekyler adskilt (EGFR-ERK1/2 og markedsøkonomisk-AKT), den kombinerede undertrykkelse af EGFR og markedsøkonomisk behandling ville være påkrævet. I en anden lunge adenocarcinom cellelinie, blev HCC827, som også havne et EGFR mutation, EGFR-TKI modstand udviklet gennem MET forstærkning. Suda et al. rapporterede, at HCC827 celler udsat for stigende koncentrationer af erlotinib i overværelse af MET-TKI PHA665752 udviklet resistens over for markedsøkonomisk behandling-TKI og EGFR-TKI18. Derudover er kliniske forsøg gennemføres for at undersøge tilfælde af MET-forstærkning med EGFR-TKI-modstand. For at efterforske mekanismen af erhvervede MET-TKI modstand efter behandling med EGFR-TKI, er det således nødvendigt at fremkalde dual-modstand til MET hæmmere og EGFR-hæmmere.
Protokollen beskrevet her involveret trinvis dosis-eskalering af en MET-TKI, PHA665752, i nærværelse af 1 µM af gefitinib. Trinvis dosis-eskalering metode er den mest pålidelige og den mest anvendte metode18,19. Det mest afgørende skridt i denne protokol er at opnå IC50 værdien af inhibitoren. Hvis denne værdi ikke bestemmes præcist, mislykkes cellerne til at vokse på alle i kultur parabol. Derfor, hvis cellevækst begynder at bremse, kan reducere stigningen i koncentrationen af hæmmer måske løse problemet. Desuden, hvis cellerne begynder at dø, det ville være ideelt til at gemme de resterende celler ved-80 ° C, hvis du vil genbruge dem i den tidligere koncentration.
En alternativ metode til fastlæggelse af modstand i cellelinjer er metoden høj koncentration eksponering, som cellerne er udsat for target koncentrationen af inhibitoren direkte, og cellerne er kulturperler indtil de overlevende resistente celler begynder prolifererende. Selvom denne metode er mere klinisk relevant, har en lavere succesrate fordi målet koncentrationen af inhibitor, der administreres i første omgang, kan dræbe alle forældrenes cellerne straks. Interessant, er det blevet rapporteret, at resistente sublines opnået gennem disse to metoder udviser forskellige cellulære egenskaber19,20.
En anden metode til fastlæggelse af modstand er den i vivo modstand metode, hvor en cellesuspension (1,0 × 106-2.0 × 107) indsprøjtes i flankerne af mus, og når svulsten når et rumfang på 200 mm3, musene er underkastet en kontinuerlig behandling med hæmmere. Tumorer, der reagerer helt og derefter gentages under vedligeholdes terapi er høstet, hakket, fordøjes med trypsin, og derefter filtreret og seedet på kultur retter. Denne metode, kan selv om noget kompliceret, bruges effektivt i tilfælde af antistof-modstand. Men når de tumorer, der viser resistens hos in vivo -system er overført til en in vitro- system, cellerne undertiden undlader at vokse 2D kultur systemer. 3D kultur systemer såsom en basalmembran matrix bør derfor være brugte21.
Selv om alle tre af disse metoder kræver en relativt lang tid at udføre, trinvis dosis-eskalering metode er den mest økonomiske. Det er også den mest passende metode til klart forstå og studere processen med at erhverve inhibitor-modstand. Succesraten for de andre to metoder er derudover væsentligt lavere end metoden trinvis dosis-eskalering.
Når modstanden er etableret, er det nødvendigt at teste tumorfremkaldende styrken af disse cellelinjer. Koloni dannelse tests eller i vivo transplantationscentre er ofte ansat til dette formål (figur 6). Disse metoder kan overvinde ulempe ved hjælp af 2D kultur systemer.
En stor begrænsning af disse metoder er, at celler med erhvervet modstand ofte ikke præcist afspejler modstanden i menneskelige kræftceller. Derfor, de mekanismer, der er opdaget gennem undersøgelser i in vitro- modeller bør bekræftes i menneskelige vævsprøver gennem gentagne tests i biopsi prøver. Desuden, selv om disse protokoller kan være nyttige til at undersøge mekanismen bag erhvervet modstand under udviklingen af tumorceller, er det muligt, at den erhvervede modstand er fremkaldt af ændringer af tumor mikromiljø. Dette er en anden alvorlig begrænsning af undersøger effekten af disse protokoller i kun kræftceller. Det ville være bedre at bruge væv fra humant vævsbanker, som er tilgængelige for mange forskere.
Protokollen præsenteres her kan ændres for at etablere modstand mod andre Molekylær hæmmere. Denne metode er derfor potentielt nyttige for udviklingen af terapeutiske værktøjer for at styre kræft i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi takke medlemmerne af Institut for Molekylær onkologi for deres tankevækkende kommentarer og nyttige råd, og Editage for deres hjælp med engelsksprogede redigering. Dette arbejde blev støttet af den MEXT-støttet Program for den strategiske forskningsfond på Private universiteter (2012-2016) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan. Tohru Ohmori modtaget forskningsstøtte (2015-2016) fra Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Tyskland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
