Her foreslår vi en protokoll for kondrogen differensiering fra blodblodmononukleærcelle-avledede, menneskeskapte pluripotente stamceller.
Menneskelig leddbrusk mangler evnen til å reparere seg selv. Bruskdegenerasjon behandles således ikke ved kurativ, men ved konservative behandlinger. For tiden er det gjort anstrengelser for å regenerere ødelagt brusk med eks vivo utvidede kondrocytter eller benmarg-avledede mesenkymale stamceller (BMSCs). Den begrensede levedyktighet og ustabilitet av disse cellene begrenser imidlertid deres anvendelse i bruskutbygging. Menneskeinducerte pluripotente stamceller (hiPSCs) har fått vitenskapelig oppmerksomhet som et nytt alternativ for regenerative applikasjoner. Med ubegrenset selvfornyelsesevne og multipotency har hiPSCs blitt uthevet som en ny erstatningscellekilde for brusk reparasjon. Imidlertid er det en stor utfordring for deres kliniske anvendelse å skaffe en høy mengde chondrogenpellets av høy kvalitet. I denne studien brukte vi embryoidlegemer (EB) -avlede utvoksningsceller for kondrogen differensiering. Vellykket kondrogenese ble bekreftet av PCR anD-farvning med alcianblått, toluidinblått og antistoffer mot henholdsvis kollagentyper I og II (henholdsvis COL1A1 og COL2A1). Vi gir en detaljert metode for differensiering av blodmononukleære celle-avledede iPSCs (CBMC-hiPSCs) i kondrogenpellets.
Bruken av hiPSCs representerer en ny strategi for narkotika-screening og mekanistiske studier av ulike sykdommer. Fra et regenerativt perspektiv er hiPSCer også en potensiell kilde for erstatning av skadede vev som har begrenset helbredelsesevne , som leddbrusk 1 , 2 .
Regenerering av innfødt leddbrusk har vært en utfordring i flere tiår. Articular brusk er et mykt, hvitt vev som belegger enden av bein, beskytter dem mot friksjon. Imidlertid har den begrenset regenerativ evne når den er skadet, noe som gjør selvreparasjon nesten umulig. Derfor har forskning fokusert på bruskregenerering vært igangsatt i flere tiår.
Tidligere ble in vitro differensiering i kondrogene linjer vanligvis utført med BMSC'er eller native kondrocytter isolert fra knæleddet 3 . DuettO deres kondrogen potensial, BMSC og nasjonale kondrocytter har mange fordeler som støtter deres bruk i kondrogenese. På grunn av deres begrensede ekspansjon og ustabile fenotype står imidlertid disse cellene overfor flere begrensninger i rekonstruksjonen av leddbruskdefekter. Under in vitro kulturbetingelser har disse cellene en tendens til å miste sine egne egenskaper etter 3-4 passasjer, noe som til slutt påvirker deres differensieringsevner 4 . Også i tilfelle av nasjonale kondrocytter er ytterligere skade på kneleddet uunngåelig ved oppnåelse av disse cellene.
I motsetning til BMSCs eller native kondrocytter, kan hiPSCs utvide ubestemt in vitro . Med de rette kulturbetingelsene har hiPSCs stort potensial som en erstatningskilde for kondrogen differensiering. Imidlertid er det utfordrende å endre hjerteegenskapene til hiPSCs 5 . Videre tar det flere kompliserte in vitro stePs å lede skjebnen til hiPSCs til en bestemt celletype. Til tross for disse komplikasjonene anbefales bruk av hiPSCs fortsatt på grunn av deres høye selvfornyelsesevner og deres evne til å skille seg inn i målrettede celler, inkludert kondrocyter 6 .
Kondrogen differensiering gjøres vanligvis med tredimensjonale kultursystemer, slik som pelletkulturen eller mikromasskulturen, ved bruk av MSC-lignende stamceller. Hvis du bruker hiPSCs, er protokollen for å generere MSC-lignende stamceller forskjellig fra de eksisterende protokollene. Noen grupper bruker monolagskultur av hiPSCs for direkte å konvertere fenotypen til MSC-lignende celler 7 . Imidlertid bruker de fleste studier EBs til å generere vekstceller som ligner MSCs 8 , 9 , 10 , 11 .
Ulike typer vekstfaktorer brukes til å indusere kondomNesis. Vanligvis brukes BMP- og TGFβ-familieproteiner, alene eller i kombinasjon. Differensiering har også blitt indusert med andre faktorer, slik som GDF5, FGF2 og IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 har vist seg å stimulere kondrogenese på en doseavhengig måte i MSCs 16 . Sammenlignet med den andre isotypen, TGFβ3, inducerer TGFβ1 kondrogenese ved å øke pre-brusk mesenkymcellekondensasjon. TGFβ3 inducerer kondrogenese ved betydelig økning av mesenkymcelleproliferasjonen 17 . Imidlertid brukes TGFβ3 oftere av forskere enn TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 øker ekspresjonen av gener relatert til kondrogen-matriks-komponentene i menneskerArtikulære kondrocytter under in vitro betingelser 20 . BMP2 øker ekspresjonen av gener som er kritiske for bruskdannelse i MSCs i kombinasjon med TGFβ-proteiner 21 . Det har også blitt vist at BMP2 synergistisk forbedrer effekten av TGFβ3 gjennom Smad og MAPK-veiene 22 .
I denne studien ble CBMC-hiPSCs aggregert i EB'er ved bruk av EB-medium i en petriskål med lav vedlegg. Utvekstceller ble indusert ved å feste EBsene til en gelatine-belagt parabolen. Kondrogen differensiering ved bruk av utvekstceller ble utført ved pelletkultur. Behandling med både BMP2 og TGFβ3 kondenserte vellykket cellene og indusert ekstracellulær matriks (ECM) proteinakkumulering for kondrogen pelletsdannelse. Denne studien antyder en enkel, men effektiv kronondrogen differensieringsprotokoll ved bruk av CBMC-hiPSCs.
Denne protokollen har generert hiPSCer fra CBMCs. Vi reprogrammerte CBMCs til hiPSCs ved hjelp av en Sendai viral vektor som inneholder Yamanaka-faktorene 24 . Tre tilfeller ble brukt i differensiering, og alle eksperimenter genererte vellykket kondrogenpellets ved hjelp av denne protokollen. Mange studier har rapportert protokoller for differensiering av hiPSCs i kondrocyter 25 , 26 , 27 , <s…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra Korea Healthcare Technology FoU-prosjektet, departementet for helse, velferd og familie, Republikken Korea (HI16C2177).
Plasticware | |||
100mm Dish | TPP | 93100 | |
6-well Plate | TPP | 92006 | |
50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
12-well Plate | TPP | 92012 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
E8 Medium Materials | |||
DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL) |
Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL) |
Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL) |
Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μg/mL) |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
Quality Control Materials | |||
18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
Alcian blue | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
Nuclear fast red | Americanmastertech | STNFR100 | |
xylene | Duksan | 115 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
Mayer's hematoxylin solution | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
Chondrogenic Differentiation Materials | |||
DMEM | Life Technologies | 11885 | Chondrogenic media component (500 mL) |
Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM) |
rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml) |
Recombinant Hman TGF-beta3 | R&D | 243-B3-002 | Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml) |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
ITS+ Premix | BD | 354352 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Dexamethasone-Water Soluble | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M) |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Sodium pyruvate solution | Sigma Aldrich | S8636 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
L-Proline | Sigma Aldrich | P5607-25G | Chondrogenic media component (40μg/ml) |