Her foreslår vi en protokol for chondrogen differentiering fra ledningsblodmononukleære celleafledte humant inducerede pluripotente stamceller.
Human ledbrusk mangler evnen til at reparere sig selv. Bruskdegeneration behandles således ikke ved helbredende men ved konservative behandlinger. I øjeblikket bestræbes der på at regenerere beskadiget brusk med ex vivo ekspanderede chondrocytter eller knoglemarvafledte mesenkymale stamceller (BMSC'er). Den begrænsede levedygtighed og ustabilitet af disse celler begrænse deres anvendelse i brusk-rekonstruktion. Humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) har modtaget videnskabelig opmærksomhed som et nyt alternativ til regenerative applikationer. Med ubegrænset selvfornyelsesevne og multipotens er hiPSCs blevet fremhævet som en ny erstatningscellekilde til bruskreparation. At opnå en høj mængde chondrogenpellets af høj kvalitet er imidlertid en stor udfordring for deres kliniske anvendelse. I denne undersøgelse anvendte vi embryoidlegeme (EB) -afledte udvækstceller til chondrogen differentiering. Succesfuld chondrogenese blev bekræftet af PCR anD farvning med alcianblåt, toluidinblåt og antistoffer mod henholdsvis kollagentyperne I og II (henholdsvis COL1A1 og COL2A1). Vi tilvejebringer en detaljeret metode til differentiering af blodmononukleære celleafledte iPSC'er (CBMC-hiPSC'er) til chondrogenpellets.
Brugen af hiPSC'er repræsenterer en ny strategi for lægemiddel screening og mekanistiske undersøgelser af forskellige sygdomme. Fra et regenerativt perspektiv er hiPSC'er også en potentiel kilde til udskiftning af beskadigede væv, der har begrænset helbredelsesevne, såsom ledbrusk 1 , 2 .
Regenerering af indfødt leddbrusk har været en udfordring i flere årtier. Ledbrusk er et blødt, hvidt væv, der strækker slutningen af knoglerne og beskytter dem mod friktion. Det har dog begrænset regenerativ evne, når den er beskadiget, hvilket gør selvreparation næsten umulig. Derfor har forskning fokuseret på bruskregenerering været igangværende i flere årtier.
Tidligere blev in vitro differentiering i den kondrogeniske linie sædvanligvis udført med BMSC'er eller native chondrocytter isoleret fra knæleddet 3 . På grund af tO deres chondrogen potentiale, BMSC'er og native kondrocytter har mange fordele, der støtter deres anvendelse i chondrogenese. På grund af deres begrænsede ekspansion og ustabile fænotype står disse celler imidlertid over for flere begrænsninger ved genopbygningen af leddbruskdefekter. Under in vitro kulturbetingelser har disse celler tendens til at miste deres egen karakteristika efter 3-4 passager, hvilket i sidste ende påvirker deres differentieringsevner 4 . Også i tilfælde af native kondrocytter er yderligere skader på knæleddet uundgåeligt, når man opnår disse celler.
I modsætning til BMSC'er eller native kondrocytter kan hiPSC'er uendeligt udvide in vitro . Med de rette kulturbetingelser har hiPSC'er stort potentiale som en erstatningskilde for chondrogen differentiering. Imidlertid er det udfordrende at ændre de høje egenskaber hos hiPSCs 5 . Desuden tager det flere komplicerede in vitro stePs til at styre hiPSCs skæbne til en bestemt celletype. På trods af disse komplikationer anbefales brug af hiPSC'er stadig på grund af deres høje selvfornyelsesevner og deres evne til at differentiere til målrettede celler, herunder chondrocytter 6 .
Kondrogene differentiering udføres sædvanligvis med tredimensionale dyrkningssystemer, såsom pelletkulturen eller mikromassekulturen ved anvendelse af MSC-lignende stamceller. Hvis du bruger hiPSC'er, adskiller protokollen til at generere MSC-lignende stamceller fra de eksisterende protokoller. Nogle grupper bruger monolagskultur af hiPSC'er til direkte at omdanne fænotypen til MSC-lignende celler 7 . De fleste studier bruger dog EB'er til at generere udvækstceller, der ligner MSC 8 , 9 , 10 , 11 .
Forskellige typer vækstfaktorer anvendes til at fremkalde chondrogeNesis. Normalt anvendes BMP- og TGFβ-familieproteiner alene eller i kombination. Differentiering er også blevet induceret med andre faktorer, såsom GDF5, FGF2 og IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 har vist sig at stimulere chondrogenese på en dosisafhængig måde i MSC'er 16 . Sammenlignet med den anden isotype, TGFβ3, inducerer TGFβ1 chondrogenese ved at forøge præ-brusk-mesenkymcellekondensationen. TGFβ3 inducerer chondrogenese ved signifikant at forøge mesenchymcelleproliferationen 17 . Imidlertid anvendes TGFβ3 oftere af forskere end TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 forøger ekspressionen af gener relateret til de chondrogeniske matrixkomponenter i humantArtikulære chondrocytter under in vitro betingelser 20 . BMP2 øger ekspressionen af gener, der er kritiske for bruskdannelse i MSC'er i kombination med TGFβ-proteiner 21 . Det har også vist sig, at BMP2 synergistisk forøger effekten af TGFβ3 gennem Smad- og MAPK-banerne 22 .
I denne undersøgelse blev CBMC-hiPSC'er aggregeret i EB'er ved anvendelse af EB-medium i en petriskål med lav vedhæftning. Udvækstceller blev induceret ved at binde EB'erne til en gelatinecoated skål. Kondrogene differentiering ved hjælp af udvækstceller blev udført ved pellets kultur. Behandling med både BMP2 og TGFβ3 kondenserede succesfuldt cellerne og induceret ekstracellulær matrix (ECM) proteinakkumulering til chondrogen pelletsdannelse. Denne undersøgelse antyder en simpel, men effektiv chondrogene differentieringsprotokol ved anvendelse af CBMC-hiPSC'er.
Denne protokol genererede succesfulde hiPSC'er fra CBMC'er. Vi omprogrammerede CBMC'er til hiPSC'er ved anvendelse af en Sendai viral vektor indeholdende Yamanaka faktorer 24 . Tre sager blev anvendt i differentiering, og alle forsøg med succes fremkaldte chondrogenpellets ved anvendelse af denne protokol. Talrige undersøgelser har rapporteret protokoller til differentieringen af hiPSC'er i chondrocytter 25 , 26</sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Korea Healthcare Technology R & D-projektet, Ministeriet for Sundhed, Velfærd og Familie, Republikken Korea (HI16C2177).
Plasticware | |||
100mm Dish | TPP | 93100 | |
6-well Plate | TPP | 92006 | |
50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
12-well Plate | TPP | 92012 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
E8 Medium Materials | |||
DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL) |
Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL) |
Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL) |
Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μg/mL) |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
Quality Control Materials | |||
18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
Alcian blue | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
Nuclear fast red | Americanmastertech | STNFR100 | |
xylene | Duksan | 115 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
Mayer's hematoxylin solution | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
Name | Company | Catalog Number | Description |
Chondrogenic Differentiation Materials | |||
DMEM | Life Technologies | 11885 | Chondrogenic media component (500 mL) |
Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM) |
rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml) |
Recombinant Hman TGF-beta3 | R&D | 243-B3-002 | Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml) |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
ITS+ Premix | BD | 354352 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Dexamethasone-Water Soluble | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M) |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
Sodium pyruvate solution | Sigma Aldrich | S8636 | Chondrogenic media component (Conc.: 1 %) |
L-Proline | Sigma Aldrich | P5607-25G | Chondrogenic media component (40μg/ml) |