Summary

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Published: June 19, 2017
doi:

Summary

Qui proponiamo un protocollo di differenziazione condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mononucleate del sangue cordonale.

Abstract

La cartilagine articolare umana manca la capacità di ripararsi. La degenerazione di cartilagine viene quindi trattata non da curative ma da trattamenti conservatori. Attualmente si stanno impegnando a rigenerare la cartilagine danneggiata con condrociti espansi ex vivo o cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSCs). Tuttavia, la restrittività e l'instabilità di queste cellule limitano la loro applicazione nella ricostruzione della cartilagine. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) hanno ricevuto l'attenzione scientifica come una nuova alternativa per le applicazioni rigenerative. Con abilità illimitate di auto-rinnovamento e multipotenza, i hiPSCs sono stati evidenziati come una nuova sorgente di sostituzione cellulare per la riparazione della cartilagine. Tuttavia, l'ottenimento di un'elevata quantità di pellets condizionati di alta qualità è una sfida importante per la loro applicazione clinica. In questo studio abbiamo usato cellule embrionali (EB) derivate per la differenziazione condrogenica. La chondrogenesi di successo è stata confermata da PCRD con blu alcian, toluidina blu e anticorpi contro i tipi di collagene I e II (COL1A1 e COL2A1 rispettivamente). Forniamo un metodo dettagliato per la differenziazione dei iPSC (CBMC-hiPSCs) derivati ​​da cellule mononucleari di sangue del cordone in pellet condondenso.

Introduction

L'uso di hiPSC rappresenta una nuova strategia per lo screening dei farmaci e studi meccanistici di varie malattie. Da una prospettiva rigenerativa, i hiPSC sono anche una potenziale fonte per la sostituzione di tessuti danneggiati che hanno capacità di guarigione limitata, come la cartilagine articolare 1 , 2 .

La rigenerazione della cartilagine articolare nativa è stata una sfida per diversi decenni. La cartilagine articolare è un morbido tessuto bianco che copre la fine delle ossa, proteggendole dall'attrito. Tuttavia, ha una capacità di rigenerazione limitata quando è danneggiata, rendendo quasi impossibile l'auto-riparazione. Pertanto, la ricerca incentrata sulla rigenerazione della cartilagine è stata in corso per diversi decenni.

In precedenza, la differenziazione in vitro nel linfodondrogeno è stata normalmente eseguita con BMSC o condrociti naturali isolati dall'articolazione del ginocchio 3 . DovutoO il loro potenziale condrogenico, BMSC e condrociti nativi hanno numerosi meriti che sostengono il loro utilizzo nella condogenesi. Tuttavia, a causa della loro limitata espansione e del fenotipo instabile, queste cellule presentano numerose limitazioni nella ricostruzione dei difetti della cartilagine articolare. Sotto le condizioni di coltura in vitro , queste cellule tendono a perdere le proprie caratteristiche dopo 3-4 passaggi, che infine influenzano le loro capacità di differenziazione 4 . Inoltre, nel caso dei condrociti nativi, un danno aggiuntivo per il ginocchio è inevitabile quando si ottiene queste cellule.

A differenza di BMSC o di condrociti nativi, i hiPSCs possono espandersi indefinitamente in vitro . Con le condizioni di coltura adeguate, i hiPSC hanno un grande potenziale come fonte di ricambio per la differenziazione condrogenica. Tuttavia, è impegnativo cambiare le caratteristiche intrinseche di hiPSCs 5 . Inoltre, ci sono diversi complicati in vitro stePs per dirigere il destino di hiPSCs a un tipo specifico di cella. Nonostante queste complicazioni, l'uso di hiPSC è ancora raccomandato a causa delle loro elevate capacità di auto-rinnovamento e della loro capacità di differenziarsi in cellule mirate, compresi i condrociti 6 .

La differenziazione condrogenica è di solito effettuata con sistemi di coltura tridimensionali, come la coltura di pellet o la coltura di micromassi, utilizzando le cellule progenitrici MSC. Se si usa hiPSCs, il protocollo per generare le cellule progenie di MSC è diverso dai protocolli esistenti. Alcuni gruppi usano la cultura monolayer di hiPSC per convertire direttamente il fenotipo in cellule simili a MSC 7 . Tuttavia, la maggior parte degli studi utilizza EB per generare cellule di crescita che assomigliano a MSCs 8 , 9 , 10 , 11 .

Vari tipi di fattori di crescita sono utilizzati per indurre il chondrogeNesis. Di solito, le proteine ​​familiari BMP e TGFβ vengono utilizzate, da soli o in combinazione. La differenziazione è stata anche indotta con altri fattori, come GDF5, FGF2 e IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 è stato dimostrato di stimolare la condogenesi in modo dose-dipendente nei MSC 16 . Rispetto all'altro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induce la condogenesi aumentando la condensazione delle cellule mesenchimali pre-cartilagine. TGFβ3 induce la condogenesi aumentando significativamente la proliferazione cellulare mesenchimale 17 . Tuttavia, TGFβ3 viene utilizzato più frequentemente dai ricercatori di TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 aumenta l'espressione di geni relativi ai componenti della matrice condrogenica nell'uomoCondrociti articolari sotto condizioni in vitro 20 . BMP2 aumenta l'espressione di geni critici alla formazione di cartilagine nei MSC in combinazione con le proteine ​​TGFβ 21 . È stato inoltre dimostrato che BMP2 valorizza sinergicamente l'effetto di TGFβ3 attraverso i percorsi Smad e MAPK 22 .

In questo studio CBMC-hiPSCs sono stati aggregati in EB utilizzando mezzo EB in un piatto di Petri a basso assorbimento. Le cellule di crescita sono state indotte collegando i EB a un piatto rivestito di gelatina. La differenziazione condrogenica usando le cellule di crescita è stata eseguita con la coltura del pellet. Il trattamento con entrambi BMP2 e TGFβ3 ha condensato con successo le cellule e l'accumulo di proteine ​​della matrice extracellulare (ECM) indotta per la formazione di pellet condrogenico. Questo studio suggerisce un semplice ma efficace protocollo di differenziazione dei condensatori usando CBMC-hiPSCs.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale dell'Università Cattolica della Corea (KC12TISI0861). I CBMC utilizzati per la riprogrammazione sono stati direttamente ottenuti dalla Banca di Cord Blood del Seoul St. Mary's Hospital. 1. Differenziazione condensata da iPSC Generazione CBMC-iPSC Generare CBMC-hiPSC utilizzando il protocollo mostrato nel nostro lavoro precedente 23 . Ra…

Representative Results

In questo studio, abbiamo generato pellet condensatori da CBMC-hiPSCs indurre cellule outgrowth da EBs. La differenziazione condrogenica è stata indotta usando CBMC-hiPSC con elevata pluripotenza 11 confermata. Uno schema semplice del nostro protocollo è mostrato in Figura 1A . Prima della differenziazione, le colonie iPSC sono state ampliate ( Figura 1B ). IPSC espansi sono stati assemblati come EB per…

Discussion

Questo protocollo ha generato hiPSC da CBMC. Abbiamo riprogrammato i CBMC a hiPSC utilizzando un vettore virale Sendai contenente fattori Yamanaka 24 . Tre casi sono stati utilizzati nella differenziazione, e tutti gli esperimenti hanno generato con successo i pellet condrodotti utilizzando questo protocollo. Numerosi studi hanno riportato protocolli per la differenziazione dei hiPSC nei condrociti 25 , 26 , 2…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del progetto R & D di tecnologia della Corea del Sud, Ministero della Sanità, del Welfare & Famiglia, della Repubblica di Corea (HI16C2177).

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
6-well Plate TPP 92006
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
Name Company Catalog Number Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES Life Technologies 11330-057 E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080-094 E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin Sigma Aldrich T3705 E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2 Peprotech 100-18B E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin Life Technologies 12585-014 E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS Life Technologies 14190-144
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
Name Company Catalog Number Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
Alcian blue Sigma Aldrich A3157-10G
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252-25G
Safranin O Sigma Aldrich 090m0039v
Nuclear fast red Americanmastertech STNFR100 
xylene Duksan 115 
Ethanol Duksan 64-17-5
Mayer's hematoxylin solution wako pure chemical industries LAK7534
DAP VECTOR LABORATORIES SK-4100
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
Name Company Catalog Number Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM Life Technologies 11885 Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2 R&D 355-BM-050 Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3 R&D 243-B3-002 Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828-028 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix BD 354352 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble  Sigma Aldrich D2915-100MG Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement Life Technologies 35050-061 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution Sigma Aldrich S8636 Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline Sigma Aldrich P5607-25G Chondrogenic media component (40μg/ml)

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Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55988, doi:10.3791/55988 (2017).

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