Laser microirradiation är ett användbart verktyg för studier av DNA-reparation i levande celler. En metod för användning av UVA lasrar att framkalla olika DNA lesioner visas. Vi har optimerat en metod för lokal microirradiation som upprätthåller normala cellcykelns; Således, bestrålade celler vidare genom Mitos.
Lokala microirradiation med laser representerar ett användbart verktyg för studier av DNA-reparation-relaterade processer i levande celler. Här, beskriver vi en metod att analysera protein kinetik på DNA skador över tid eller protein-protein interaktioner på lokalt microirradiated kromatin. Vi visar också hur man känner igen olika faser av cellcykeln använder Fucci cellulära systemet för att studera cell-cykel-beroende protein kinetik på DNA lesioner. Metodbeskrivningen för användning av två UV-lasrar (355 nm och 405 nm) att framkalla olika typer av DNA-skador presenteras också. Endast de celler microirradiated av 405-nm diode laser fortsatte genom Mitos normalt och var saknar cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). Vi visar också hur microirradiated celler kan fastställas vid en given tidpunkt att utföra immunodetection av endogena proteiner av intresse. DNA reparation i studierna, beskriver vi dessutom biofysikaliska metoder inklusive FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning) och FLIM (livstid Imaging fluorescensmikroskopi) i celler med spontant förekommer DNA skador foci. Vi visar också en tillämpning av FLIM-bandet (fluorescens resonans energi Transfer) i experimentella studier av protein-protein interaktioner.
DNA-skador leder till uppkomsten av DNA lesioner bestående av cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine och singel-strand eller dubbel-strand breaks1,2. Γ-strålning är i form av joniserande strålning med högsta energi och hög penetrans, således denna källa av strålning används allmänt i strålbehandling3. Däremot, inducerad experimentellt DNA-skador som orsakas av UV lasrar härmar naturlig exponering för UV-ljus. UVA microirradiation, representerar som en mikroskopisk metod, en experimentella verktyg för att studera DNA-skador i enskilda levande celler. Microirradiation användes för första gången 40 år sedan för att avslöja organisationen av kromosom regioner4,5. Denna teknik är mycket beroende av antingen funktionella egenskaper confocal Mikroskop eller tekniska gränserna för modern nanoskopi. För att inducera DNA lesioner, kan celler vara presensitized av 5′ Bromdeoxiuridin (BrdU) eller Hoechst 33342 före UV-bestrålning. Bártová et al. 6 tidigare beskrivits det presensitization steget, och nyligen vi optimerat denna microirradiation teknik för att undvika celldöd eller apoptos. Till exempel leder användning av en 405-nm UV-laser (utan Hoechst 33342 presensitization) till induktion av 53BP1-positiv dubbel-strand raster (DSBs) på bekostnad av cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). Å andra presensitization steg i kombination med UV microirradiation framkalla mycket höga nivåer av CPDs och DSBs samtidigt7,8. Denna metod är svårt att tillämpa på studiet av en enda väg för DNA-reparation.
Med microirradiation är det möjligt att analysera protein rekrytering, kinetik och interaktion på DNA skador i levande celler. Ett exempel på denna metod publicerades av Luijsterburg et al. 9 för Heterokromatin protein 1β och vi visade nyligen för första gången som den pluripotency faktorn Oct4 och ett protein som är associerad med Cajal förkroppsligar, coilin, rekryteras till UV-inducerad DNA lesioner6,10. Protein kinetik vid dessa DNA-skador kan också studeras med hjälp av FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning)11,12,13 eller GRÄMA (fluorescens resonans energi Transfer) tekniker14 ,15. Dessa metoder har potential att avslöja enkel diffusion av proteiner vid DNA lesioner eller protein-protein interaktioner. Ett användbart verktyg för ytterligare karakterisering av proteiner är FLIM (livstid Imaging fluorescensmikroskopi) eller dess kombination med bandet teknik (bandet-FLIM)16. Dessa metoder gör det möjligt att studera processer i levande celler som är stabilt eller övergående uttrycker proteinet av intresse märkta av en fluorescerande molekyl17. Här visas ett exempel på exponentiell förfalla time (τ) för GFP-märkta p53 protein och dess interaktion partner, mCherry-taggade 53BP1, spelar en viktig roll i DNA skador svar18,19 . Den parametern τ, är livstid den fluorokrom som tillhandahålls av FLIM beräkningar, specifika för en viss fluorescens färg, dess bindande förmågor och dess cellulära miljön. Därför, denna metod kan visa oss distinktioner mellan protein subpopulations, deras bindande förmågor och deras funktionella egenskaper efter, exempelvis DNA-skador.
Här, en disposition av metodologiska tillvägagångssätt av avancerad mikroskopi tekniker som används i vårt laboratorium för att studera tid-specifika protein rekrytering, kinetik, diffusion och protein-protein interaktioner på platsen av microirradiated kromatin presenteras. Den stegvisa metoden för induktion av lokala DNA lesioner i levande celler, och en beskrivning av metoder som är användbara för studier av DNA-skada-relaterade händelser på lokalt inducerad DNA skador orsakade av UV-lasrar finns.
Mikroskopi tekniker utgör grundläggande verktyg i forskningslaboratorier. Här en kort beskrivning av metoderna som används för studier av protein rekrytering och kinetik på DNA lesioner presenteras. Noterade vi särskilt våra experimentella erfarenheter inom lokala microirradiation av levande celler, och vi diskutera studiet av protein kinetik av FRAP och protein-protein interaktioner på DNA skador av acceptor-blekning bandet28 och dess avancerade ändring bandet-FLIM (<strong class="xfig"…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Grant byrån i Tjeckien, projektet P302-12-G157. Experiment stöddes också av den tjeckiska-norska forskning programmet CZ09, som övervakas av norska medel och av ministeriet för utbildning, ungdom och idrott i Tjeckien (bevilja nummer: 7F14369).
Cell cultivation | |||
HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell transfection | |||
GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Confocal microscopy | |||
Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
White-light laser | Leica Microsystems | ||
355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunofluorescence staining | |||
Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |