Summary
Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.
Abstract
Microirradiation locale avec des lasers représente un outil utile pour l’étude des processus liés à la réparation ADN dans des cellules vivantes. Nous décrivons ici une approche méthodologique à l’analyse cinétique de protéine aux lésions de l’ADN sur les interactions temps ou protéines sur localement microirradiated la chromatine. Nous montrons aussi comment reconnaître les différentes phases du cycle cellulaire en utilisant le système cellulaire Fucci pour étudier la cinétique de protéines cycle cellulaire-dépendante aux lésions de l’ADN. Une description méthodologique de l’utilisation de deux lasers UV (355 nm et 405 nm) pour induire différents types de dommages à l’ADN est également présentée. Seulement le cellules microirradiated de la 405 nm diode laser s’est déroulé normalement par le biais de mitose et sont dépourvues de dimères de pyrimidine de cyclobutane (CPDs). Nous montrons aussi comment les cellules de microirradiated peuvent être fixés à un moment donné pour effectuer l’immunodétection des protéines endogènes d’intérêt. Pour les études de réparation de l’ADN, nous décrivons en outre l’utilisation de méthodes biophysiques y compris FRAP (récupération de Fluorescence après photoblanchiment) et FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) dans les cellules survenant spontanément foyers de dommages d’ADN. Nous montrons également une application de FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) dans les études expérimentales des interactions protéine-protéine.
Introduction
Lésions de l’ADN entraîne l’apparition de lésions de l’ADN consistant en cyclobutane dimères de pyrimidine (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine et simple brin ou double-brins1,2. Rayons gamma sont la forme de rayonnements ionisants avec la plus haute énergie et une pénétrance élevée, donc cette source de rayonnement est largement utilisée en radiothérapie3. D’autre part, expérimentalement induit des lésions de l’ADN provoquée par exposition naturelle d’imite les lasers UV à la lumière UV. UVA microirradiation, comme une méthode d’examen microscopique, représente un outil expérimental pour l’étude des lésions de l’ADN dans les cellules vivantes individuels. Microirradiation a été utilisée pour la première fois il y a 40 ans afin de révéler l’organisation du chromosome régions4,5. Cette technique est fortement tributaire de deux propriétés fonctionnelles des microscopes confocaux ou les limites techniques du nanoscopy moderne. Pour provoquer des lésions de l’ADN, les cellules peuvent être présensibilisées par 5' bromodéoxyuridine (BrdU) ou Hoechst 33342 avant l’irradiation UV. Bártová et al. 6 décrit précédemment l’étape presensitization, et récemment nous avons optimisé cette technique de microirradiation afin d’éviter la mort cellulaire ou apoptose. Par exemple, l’utilisation d’un laser UV de 405 nm (sans presensitization de Hoechst 33342) conduit à l’induction de cassures double brin de 53BP1 positif (CDB) au détriment des dimères de pyrimidine de cyclobutane (CPDs). En revanche, presensitization marches, combinés avec UV microirradiation induisent des niveaux très élevés de la CPDs et CDB simultanément7,8. Cette méthodologie est difficile à appliquer à l’étude d’une seule voie de réparation de l’ADN.
Avec microirradiation, il est possible d’analyser les protéines recrutement, cinétique et interaction aux lésions de l’ADN dans les cellules vivantes. Un exemple de cette méthode a été publié par Luijsterburg et al. 9 pour l’hétérochromatine protéine 1β et nous a montré récemment pour la première fois que le facteur de pluripotence Oct4 et une protéine associée aux corps de Cajal, coilin, sont recrutés à l’ADN par les rayons UV lésions6,10. Cinétique de protéines à ces lésions de l’ADN peuvent également être étudiés à l’aide de la PAF (récupération de Fluorescence après photoblanchiment)11,12,13 ou FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) techniques14 ,,15. Ces méthodes sont susceptibles de révéler la simple diffusion des protéines à des lésions de l’ADN ou des interactions protéine-protéine. Un outil utile pour une caractérisation plus poussée des protéines est FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) ou sa combinaison avec frette technologie (frette-FLIM)16. Ces méthodes permettent l’étude des processus en vivant des cellules qui sont stablement ou transitoirement exprimant la protéine d’intérêt marqué par une molécule fluorescente17. Ici, un exemple de temps de décroissance exponentielle (τ) pour la protéine p53 GFP-étiquetée et son partenaire d’interaction, mCherry-le tag 53BP1, jouant un rôle important dans l’ADN des dommages réponse18,19 est présenté. Le paramètre τ, la durée de vie du fluorochrome fourni par des calculs de FLIM, est spécifique pour une teinture de fluorescence donnée, ses capacités de liaison et son environnement cellulaire. Par conséquent, cette méthode peut nous montrer des distinctions entre les sous-populations de protéine, leurs capacités de liaison et leurs propriétés fonctionnelles après, par exemple, dommages à l’ADN.
Ici, un aperçu des approches méthodologiques des techniques de microscopie avancée utilisée dans notre laboratoire pour étudier le recrutement de protéines précis, cinétique, diffusion et interactions de protéine-protéine sur le site de la chromatine microirradiated est présenté. La méthode étape par étape pour l’induction des lésions locales d’ADN dans les cellules vivantes, ainsi qu’une description des méthodologies utiles pour l’étude des événements liés à l’ADN-dommages à localement induites lésions de l’ADN provoquées par les lasers UV sont fournis.
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Protocol
1. culture de lignées cellulaires
- lignées cellulaires dérivées de HeLa
Remarque : les cellules de carcinome cervical HeLa utilisation : soit les cellules HeLa exprimant de manière stable histone H2B tag GFP ou HeLa-Fucci cellules exprimant DP-Cdt1 dans le G1 et premières phases S et GFP-geminin dans les phases G2-S/M ( Figure 1).- Pour la culture de toutes les lignées cellulaires dérivées de HeLa, utilisez Dulbecco ' s modified Eagle ' s de moyenne (DMEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 % et des antibiotiques appropriés à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO 2. Remplacer le moyen 2 - 3 fois par semaine.
- Supprimer le milieu de culture et rincer les cellules à l’aide de 1 x PBS pour éliminer toute trace de sérum contenant des inhibiteurs de trypsine. Effectuez cette étape sous une hotte à température ambiante à biohazard.
- Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA préchauffée pour couvrir la couche de cellules et garder les cellules à cellules de Trypsinize 37 ° c jusqu'à ce que la couche de cellules est dispersée (habituellement 3-5 min).
- Ajouter 3 mL de milieu de croissance complète préchauffée pour inactiver la trypsine-EDTA et disperser le milieu par pipetage doucement plusieurs fois.
Remarque : Cette procédure doit être effectuée sous une hotte de biohazard afin de protéger l’utilisateur contre des contaminants et de maintenir des conditions de culture cellulaire optimal. - Comte de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatique ou Bürker chambre. Diluer la suspension cellulaire de 1 × 10 5 cellules/mL à la pipette 5 mL dans une autre boite. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO 2.
- Culture des souris des cellules souches embryonnaires (mESCs), lignée cellulaire D3
- Culture mESCs sur cell culture plats recouverts de 0,2 % gélatine et mESC support d’entretien. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO 2.
Remarque : Préparer le milieu de culture et d’entretien mESCs en portions de 50 mL et stockant entre 2 et 8 ° C pendant 2 semaines sont recommandée. Le medium de mESC contient 75 mL ES cellules FBS, 5 mL de pénicilline G et la streptomycine, 5 mL des acides aminés Non essentiels (10 mM) (concentration finale de 0,1 mM), 50 µL de souris facteur inhibiteur de leucémie (mLIF ; 100 µg/mL) (concentration finale 10 ng/mL), 430 µL MTG (1- Thioglycérol ; dilution 1 : 100 en DMEM) (concentration finale 100 µM) et le milieu DMEM hyperglycémie jusqu'à 500 mL. - Aspirer le milieu de culture de mESC de la boîte de Petri et rincer les cellules une fois avec du PBS 1 x.
- Ajouter 0,5 mL de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher de la capsule. Puis, inactiver la trypsine par laver les cellules avec 2 mL de milieu de culture de mESC additionné de sérum de veau fœtal 15 %.
- Utiliser une pipette pour déloger les cellules restantes de la boîte de Pétri.
Remarque : Il est important d’obtenir des cellules individuelles, parce que les amas de cellules promouvoir la différenciation des cellules. - Split cellules 01:10 sur gélatinisé vaiselle avec support maintenance mESC.
Remarque : Si la densité des cellules mESC est trop faible, ils ne se développent pas bien ; Si la densité est trop haute, la différenciation est promue. - Veiller à ce que les mESCs sont maintenus dans un État indifférencié en effectuant mESC passage tous les deux jours de fractionnement de cellules à partir d’une boîte de Pétri en quatre nouveaux plats. Inspecter les colonies mESC avec un microscope inversé sous un grossissement de 200 X 100 X ou d’et, si l'on constate de mES spontanée de la différenciation cellulaire, effectuer des transferts Western pour évaluer la déplétion protéique Oct4.
Remarque : Avec le passage de la cellule optimale, différenciation spontanée de mESCs in vitro peut être réduite.
- Culture mESCs sur cell culture plats recouverts de 0,2 % gélatine et mESC support d’entretien. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO 2.
2. La Transfection de cellules
- graines cellules 48 h avant les expériences sur des plats de microscopie maillées (diamètre 35 mm) afin de trouver des cellules selon leurs coordonnées sur la boîte de Pétri microirradiated.
Remarque : Il s’agit d’un exemple dans lequel microirradiation est la première étape expérimentale et immunostaining est la seconde ( Figure 2 a).- Pour semis, utiliser une concentration de 5 × 10 4 cellules/mL pour les lignées cellulaires dérivées de HeLa (ou 1 × 10 4 cellules/mL pour les D3 mES cellules). Utiliser jusqu'à milieu complet de 2 mL par plat. Au cours de la culture et de la microirradiation, maintenir les cellules dans une chambre de thermostat ou de la culture à 37 ° C et 5 % de CO 2.
- Comte de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatique.
Remarque : N’utilisez pas une concentration plus élevée des cellules. Surtout dans le cas des colonies denses de D3 mESCs, densité cellulaire élevée empêche l’identification localement microirradiated cellules après immunomarquage.
- Préparer le plasmide ADN et transfection réactif de choix comme suit. Préparer la Solution A à l’aide de 2-3 µg d’ADN de plasmide sélectionné (voir la Table des matières pour plus de détails) et 150 µL de PBS 1 x. Préparer la Solution B à l’aide de 3,5 µL de réactif de transfection dans 150 µL de PBS 1 x. S’assurer que chaque solution est bien mixée par pipetage prudent.
Nota : Le ratio optimal d’ADN et transfection réactif doit être déterminé empiriquement pour chaque lignée cellulaire et le plasmide individuel.
Cellules - à 24 h avant l’observation expérimentale de vivre transfectée transitoirement, combiner solution A et solution B sans agitation. Incuber les solutions combinées à température ambiante pendant 15-20 min. D’une manière goutte à goutte, homogènement disperse ce remplir de mélange de transfection (300 µL, comme décrit au point 2.2) sur la couche de cellules qui poussent dans la parabole de microscopie.
- Les cellules incuber à 37 ° C et 5 % CO 2 pendant 4 à 6 h, puis remplacez le mélange de transfection avec un milieu frais. Cultiver des cellules dans des conditions normalisées.
Remarque : Lorsque vous utilisez un laser de 405 nm, presensitize pas les cellules avec un réactif, mais lorsque vous utilisez un laser 355 nm, effectuer des presensitization de la cellule avec 10 µM 5-bromo-2 ' - désoxy - uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization temps dépend du type de cellule et de la durée du cycle cellulaire. Pour les cellules HeLa, ajouter BrdU 16 à 20 h avant microirradiation locale. Dans le cas de mESCs, ajouter BrdU, 6 à 8 h avant microirradiation.
3. Induction de lésions locales de l’ADN et la microscopie confocale
- Placer le plat sur la platine du microscope et d’enregistrer la position des cellules sélectionnées sur le plat, les coordonnées de la cellule seront nécessaire pour une analyse ultérieure ( Figure 2 a a-c).
- Trouver des cellules transfectées dans un carré étiqueté avec un numéro ou la lettre ( Figure 2 a d-f, flèches en spectacle annonce l’emplacement de la cellule agrandie en panneaux Ae et Af). Obtenir une image de l’ou les cellules à l’aide de la microscopie en champ clair et acquérir une image de fluorescence afin d’identifier la position de l’ou les cellules et la place marquée ( Figure 2 a).
- Pour l’acquisition d’image avant l’irradiation, utiliser un laser de lumière blanche (WLL) (470-670 nm par incréments de 1 nm) connecté à la microscopie confocale (ou un autre laser disponible relié à la confmicroscope OCAL).
- Utiliser les paramètres suivants : 512 × 512-pixels, pixels taille 64 nm, 400 Hz, mode bidirectionnel (balayage dans deux directions), ligne moyenne la valeur 8, zoom 8 x à 12 x.
Remarque : Ligne moyenne représente un certain nombre d’analyses ; la même ligne est scannée plusieurs fois avant de continuer à la ligne suivante. Répété des scans de toutes les lignes de produisent la dernière image de l’image. - D’observation de l’image et d’acquisition, utiliser un objectif à huile 63 × avec une ouverture numérique de 1,4 et séquentiellement acquérir des images de fluorescence. Éliminer la diaphonie entre les deux fluorochromes en utilisant le mode balayage séquentiel du logiciel approprié.
Remarque : Tous les logiciels de microscope permettent le réglage d’un soi-disant mode balayage séquentiel. L’opérateur peut choisir d’acquérir les fluorochromes ' informations simultanément (par exemple, en fluorescence rouge-vert-bleu) ou, comme mentionné ici, individuellement (séquentielle), le fluorochrome par fluorochrome. Prendre en compte les renseignements généraux que l’excitation/émission maximale pour GFP est 395/509 nm et l’excitation/émission maximale mCherry est 587/610 nm (voir fluorochromes utilisés ici dans la Figure 2 b). Basé sur ces informations, sélectionnez excitation convenable et filtres d’émission pour les fluorochromes désirées. Sélection du filtre et la numérisation des procédures doivent être optimisés pour chaque microscope confocal. - Pour l’induction des lésions de l’ADN, utilisation 64 ligne numérisation mode, éteignez la CMU (en ' acquisition ' mode), allumez la source UV externe (sur " laser UV " bouton), définir la zone d’intérêt (ROI) (en ' acquisition ' mode) et définissez le 355 nm laser à 100 % de puissance ou, sinon, utiliser une source de laser de 405 nm.
Remarque : Généralement, puissance du laser est ajustée par le bouton de réglage du laser approprié en mode acquisition image. - Pour les microirradiation locales, utilisent des lasers émettant dans le spectre UVA proche. Pour microirradiation du ROI dans le noyau et pour capturer une image, mettre un fond à zéro en mode acquisition image pour réguler l’intensité du laser en dehors du ROI ; Si la cellule est irradiée correctement, le signal de GFP-histone H2B disparaîtra et que, par exemple, protéine PCNA mCherry-étiquetée est recruté pour les lésions de l’ADN immédiatement après l’irradiation ( Figure 2 b et vidéo 1 ).
Remarque : Une lésion de l’ADN induite par le roi d’un confocale section apparaît également dans la projection en trois dimensions (3D) (voir rotation 3D et le XY, x-z, projections, y-z sur la Figure 2 et vidéo 2). Pour une description des paramètres techniques complets de lasers à 355 nm et 405 nm, voir Stixová et al. 7 - après le ROI a été irradiée, éteignez la source UV externe, éteignez le retour sur investissement, allumer la CMU, changer la ligne de balayage à 8 et trouver une autre cellule pour l’irradiation. Pour le choix du ROI, utilisez le bouton applicable dans le logiciel ' mode d’acquisition image s.
Remarque : mCherry-PCNA a un pic d’accumulation maximale à des lésions de l’ADN entre 2 et 20 min ( Figure 2 b). Pour vérifier le résultat sur les niveaux de la protéine exogène, aller de l’avant avec l’immunofluorescence souillant immédiatement après les microirradiation locale. Sélectionnez l’intervalle de temps d’irradiation selon intérêt. - Vérifier qu’une accumulation de protéines exogènes peut être détectée dans la plupart des cellules microirradiated. Pour cette vérification, utilisez les critères dans les étapes suivantes.
- Vérifier qu’il n’y a aucune la surexpression de la protéine exogène dans les cellules transfectées transitoirement. Comme une solution possible, choisissez des cellules avec seulement une faible expression de la protéine fluorescente (par exemple, mCherry-PCNA ou mCherry-53BP1).
- Évaluer la phototoxicité de l’exposition WLL utilisée pour l’acquisition d’images.
Remarque : Pour le test de phototoxicité, exposer les cellules transfectées à laser prolongée microirradiation et vérifiez que les cellules procède à la mitose comme illustré à la Figure 3 a -B. Comme une solution possible, réduire le temps et du nombre de tranches confocale par cellule balayage, optimiser la numérisation 3D de sélection de l’étape axiale optimale (0,3 µm est recommandé) et régler le laser ' s de puissance à son minimum. Par ailleurs, phototoxicité peut être éliminée à l’aide de Trolox (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic, un analogue hydrosoluble de la vitamine E) dissous dans le milieu de culture. Pour des expériences liées à l’ADN-dommage, il n’est pas recommandé d’utiliser de Trolox en raison de son effet protecteur contre les rayons UV. - En cas d’irradiation avec un laser 355 nm, vérifier suffisamment incorporation de BrdU utilisant un anticorps de détection BrdU approprié de l’incorporation de BrdU nécessaire (voir la Table des matières). Puisque BrdU est incorporée dans l’ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire, la majorité des cellules doit procéder par le biais de la phase S au cours de la presensitization. Comme une solution possible, envisager la longueur du cycle cellulaire, qui est de type cellulaire spécifique.
- Analyser si la réparation de l’ADN protéines d’intérêt ont la capacité de reconnaître les lésions de l’ADN spécifique cycle cellulaire ou phases. Une solution possible : Pour vérifier que le recrutement des protéines sélectionnées aux lésions de l’ADN est limité aux phases du cycle de cellules spécifiques (S/G1/G2), utiliser les cellules HeLa-Fucci. Ces cellules expriment DP-Cdt1 dans le G1 et les premières phases S et geminin GFP-étiquetée dans le cycle cellulaire S/G2-M phases 22 ( Figure 1).
- Pour éviter l’apoptose, la mort des cellules, sélectionnez une source laser approprié et laser de réglage de puissance 23. Gardez à l’esprit que l’irradiation des cellules devrait se rendre à la mitose ( Figure 3 a -B, Video 3).
NOTE : L’apoptose indésirables peut être détectées par annexine V positivité, caspase 3 ou un clivage B Laget. Sur le plan morphologique, détachement de cellules et la formation de corps apoptotiques sera visible.
4. Immunofluorescence souillant
- rincer brièvement la couche de cellules (de plus en plus dans les plats de microscope) 1 × PBS et après le rinçage, fixer les cellules à l’aide de 4 % de formaldéhyde pendant 10 min (pour les lignes cellulaires HeLa dérivées) ou 20 min (pour les cellules D3 ES) à la température ambiante. Rincer le plat avec 1 × PBS.
Mise en garde : Formaldéhyde provoque des lésions oculaires graves, peut-être causer une réaction allergique cutanée et est également un carcinogène potentiel ; ainsi, toutes les mesures expérimentales avec le formaldéhyde doivent être effectuées dans une hotte aspirante.
Remarque : Pour éviter le blanchiment inutile des signaux fluorescents, stocker le plat dans une chambre noire au cours de la période d’incubation nécessaire pour immunofluorescence souillant. - Permeabilize des cellules avec 0,1 % Triton X-100 dissous dans H 2 O pendant 8 min et puis incuber les cellules pendant 12 min avec 1 × PBS contenant 0,1 % de saponine et 0,1 % X-100 Triton. Après incubation, laver les cellules de 1 × PBS deux fois pendant 15 min.
- Incuber les cellules avec 1 % de BSA à 1 × PBS pendant 60 min pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps sélectionnés. Laver les cellules dans 1 × PBS pendant 15 min après incubation. L’anticorps primaire
- diluer à raison de 1/100 (ou 1 : 200) (cette étape doit être optimized des anticorps individuels) à 1 % de BSA à 1 × PBS, à l’aide de 25 µL de cette solution par plat et couvrir les cellules avec une lamelle. Incuber les cellules avec la solution contenant l’anticorps primaire dans une chambre humidifiée toute la nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, laver les cellules de 1 × PBS deux fois pendant 5 min.
- , Diluer l’anticorps secondaire à un ratio de 1/100 (ou 1 : 200) à 1 % de BSA à 1 × PBS, à l’aide de 100 µL de cette solution par plat et couvrir les cellules avec une lamelle. Incuber les cellules avec la solution contenant l’anticorps secondaire pendant 60 min. Après incubation, laver les cellules de 1 × PBS trois fois pendant 5 min.
- Monter la lamelle avec une goutte de milieu de montage et sceller la lamelle avec vernis à ongles ou de la colle pour empêcher le séchage et le mouvement pendant l’observation microscopique. Conserver le plat dans l’obscurité à 4 ° C.
5. La microscopie en fluorescence Lifetime Image (FLIM)
- début du FLIM logiciel. Ouvert le " Application Suite " du logiciel et mettez-le à la " FLIM " mode. Veillez à ce que la CMU ne fonctionne en mode pulsé.
Remarque : L’opérateur doit passer un bouton matériel pour accéder au mode impulsion. - Placer la capsule contenant les cellules colorées (teintés dans la section 4) sur la platine du microscope dans la même orientation que pendant les microirradiation locales et trouver les cellules irradiées selon les grilles sur la boîte de Pétri. Effectuer l’acquisition d’images de microscope confocal.
Remarque : Utilisez les paramètres suivants : mode de 1024 × 1024 pixels, 400 Hz, bidirectionnel, 16 lignes, zoom 8 x à 12 x. - Avant de commencer la mesure FLIM, effectuer un test préliminaire pour afficher un enregistrement en temps réel de décroissance exponentielle, en cliquant sur " Setup FLIM " et " Acquisition " et en appuyant sur " test de FLIM exécuter ". Optimiser les paramètres FLIM pour l’échantillon en évaluant les deux principaux paramètres comme suit.
- Optimiser le taux de répétition de la CMU avec la longueur d’onde d’excitation à l’écoute pour la durée de vie de l’échantillon (voir Note ci-dessous). Dans le logiciel de microscope confocal, ajuster l’intensité du laser avec la touche correspondante, qui est généralement appelée " paramètre de réglage au laser " dans la ' image acquisition ' menu. Puis, calculer une courbe de décroissance (ou histogramme représentant tous les comptages de photon) en utilisant le logiciel FLIM (voir Figure 4 a -B).
Remarque : Utiliser la CMU en mode impulsion d’excitation. Le logiciel doit être équipé d’un sélecteur d’impulsion pour WLL, qui permet de sélectionner le taux de redoublement (80, 40, 20 ou 10 MHz). La longueur d’onde d’excitation dans le cas du donneur de fluorescence, GFP, est 488 nm. La courbe de décroissance est enregistrée à l’aide de l’espace de travail logiciel FLIM. Le paramètre (τ D, τ DA) indique le temps de décroissance exponentielle (p. ex., durée de vie de fluorochrome) ; paramètre (A) représente l’amplitude de la décroissance du fluorochrome (voir les exemples de données FLIM pour p53 GFP-étiquetée et mCherry-le tag 53BP1 Figure 4 a -B). - Vérifier le taux de répétition de comptage à l’aide de l’outil d’acquisition de logiciels (mode de fréquence de répétition select). Sélectionnez les pixels les plus brillants de l’échantillon ; la courbe pour le pixel plus brillants doit être inférieure à 10 % de l’intensité de fluorescence globale.
- Optimiser le taux de répétition de la CMU avec la longueur d’onde d’excitation à l’écoute pour la durée de vie de l’échantillon (voir Note ci-dessous). Dans le logiciel de microscope confocal, ajuster l’intensité du laser avec la touche correspondante, qui est généralement appelée " paramètre de réglage au laser " dans la ' image acquisition ' menu. Puis, calculer une courbe de décroissance (ou histogramme représentant tous les comptages de photon) en utilisant le logiciel FLIM (voir Figure 4 a -B).
- Cliquez sur " mesure " et appuyez sur " exécuter FLIM ".
6. donneur vivant en utilisant un Script du FLIM et l’efficacité de calcul du FRET
- lancez le logiciel de la frette-FLIM et ouvrez le ' donneur ' workspace.
- Sélectionner le " analyse " / " Imaging " onglet dans le menu et lancez le script FLIM en cliquant sur " lancer ". Pour les réglages optimaux de frette-FLIM, recours à des partenaires de protéines qui interagissent bien connu.
Remarque : L’efficacité de la frette-FLIM d’interaction connue partenaires GFP-p53 et mCherry-53BP1 a (34,1 ± 2,3) % ( Figure 4). - Utiliser seulement le donateur d’émission canal (canal 1 ou 2) et la presse " calculer vite FLIM ".
Remarque : L’image et le graphique seront tous les deux être mis à jour. - Logiciel de la frette-FLIM, définir l’échelle d’intensité (0 - 4000 points) et l’échelle de la durée de vie (0 - 5 ns) manuellement dans le logiciel. Avec cette approche, visualiser les cellules d’intérêt et la valeur de la mesure de la frette-FLIM.
Remarque : Ce paramètre élimine les différences dans l’intensité de fluorescence parmi des cellules individuelles dans la population cellulaire. - Sous la forme de carie, choisissez le modèle de raccord.
Remarque : Nous recommandons reconvolution n-exponentielle et la sélection du paramètre de modèle " n ". Un ajustement optimal a les critères suivants : l’équipée superpositions de courbe, la courbe de décroissance bien et χ 2 - la valeur est égale à 1 ( Figure 4 b). - Sélectionner la " seuil " / " utilisation d’une manière " et régler le seuil de 75. Commencer " Initial Fit ".
Remarque : Le logiciel SPT64 calcule la durée de vie moyenne de bailleurs de fonds en l’absence de frette (" durée de vie moyenne pondérée Amplitude ", τ Av.Amp)
7. Efficacité de frette en utilisant le Script du FLIM-FRET
- Sélectionnez l’espace de travail de donneur/accepteur, puis ouvrez " analyse " | " Imaging " | " Image de vie ne vous inquiétez ".
- Sélectionner uniquement le donneur comme le canal actif et ajuster Pixel Binning selon le nombre de photons/pixel. Ensuite, exécutez le mode logiciel appelé " FastFLIM calculer ". Si le nombre de photons/pixel de l’image est faible, augmenter le Pixel Binning à 4 points.
- Régler l’intensité à 0 - 200 chefs d’accusation et de la durée de vie à 0 - 5 ns.
- Activer " utilisation d’une manière " et entrez un seuil de 75.
- Définir le modèle de raccord " Multi-exp. donneur ", entrez le paramètre de modèle " n ", entrer τ Av.Amp (étape 6,6) comme un τ D et activer " ajustement Initial ".
- Définir les paramètres Bkgr Dec, MAJ IRF et Bkgr IRF vers des valeurs de constante en supprimant la cocher.
Remarque : Définissez la majorité des paramètres reste constante autant que possible. Cette approche réduit les fluctuations statistiques. Dans ce cas, n’appuyez pas sur " Initial fit " à nouveau. Descriptions des paramètres mentionnés correspondent : IRF = fonction de réponse Instrument, BkgrDec = fond de l’ajustement exponentielle, ShiftIRF = IRF shift de reconvolution exponentielle s’insère, BkgrIRF = IRF fond de reconvolution exponentielle s’adapter. Les trois paramètres sont calculés et peut être fixés à l’aide du logiciel pour une analyse plus approfondie. - Presse " FRETŔ calculer une frette image (tracé dans la zone d’image FLIM) histogramme efficacité frette sont calculés et un histogramme de distance frette est tracé ( Figure 4). Lorsque l’analyse d’image est terminée, appuyez sur " résultat Save ".
Remarque : Au cours des expériences de la frette, il est nécessaire de considérer que les protéines fluorescentes pièce réversibles transitions entre fluorescent (lumineux) et États non fluorescent (sombre). Cette caractéristique est appelée " clignotant ", et de l’efficacité de la frette est affecté par ce phénomène (une explication de cet effet a été fournie par Vogerl et al. 24).
8. Analyse de la PAF
- lieu le dish sur la platine du microscope, isoler les cellules transfectées exprimant la protéine fluorescent étiquetée d’intérêt et effectuer une acquisition d’images à l’aide de microscopie en champ clair avec la lampe microscope ordinaire (voir Figure 2Aa-b) et modes de microscopie de fluorescence.
- Pour l’acquisition de l’image, utiliser le laser de lumière blanche (WLL) connecté à la microscopie confocale (ou un laser de choix, selon le fluorochrome sélectionné). Utilisez les paramètres suivants : 512 × 512 pixels, 1000Hz, bidirectional mode, moyenne ligne 1, zoom 8 x à 12 x.
- Acquisition d’au moins 15 images prebleaching (à la puissance du laser de ~ 10 %) et de définir la zone d’intérêt (ROI) dans le menu d’image acquisition.
- Pour des expériences de photoblanchiment, utiliser un laser à l’argon (488 nm). Appliquer les paramètres suivants : cadre résolution 512 × 512 pixels, 1000 Hz, mode bidirectionnel, zoom 8 x à 10 x.
Remarque : Les Fluorochromes dont GFP, mCherry et DP peuvent être excitées par un laser à argon travaillant à 488 nm ou 514 nm. - Utiliser le mode logiciel PAF du microscope de choix. Pendant le photoblanchiment, régler le laser argon ' puissance maximum à l’aide de la touche de réglage du laser. Effectuez l’acquisition d’images à des intervalles de s 0,256, à la puissance de laser de 10 %.
Remarque : Pour postbleaching les étapes, utilisez le mode d’acquisition image standard de microscope confocal de choix. Temps de récupération- fluorescence moniteur après photoblanchiment (jusqu'à 45-50 s après la procédure de blanchiment).
NOTE : Comme le montre la Figure 4, le temps de récupération après photoblanchiment pour 53BP1 mCherry-tag est distinct à des lésions de l’ADN spontanées et induite par l’UVA-irradiation des foyers. mCherry-53BP1 à des lésions UVA récupéré rapidement par rapport à des accumulations de mCherry-53BP1 à survenant spontanément de réparation de l’ADN des foyers ; Voir Figure 4 et Foltankova et al. 25
- fluorescence moniteur après photoblanchiment (jusqu'à 45-50 s après la procédure de blanchiment).
- Exporter les données du logiciel de microscope (ou logiciel de choix) dans une feuille de calcul et d’effectuer une analyse statistique.
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Representative Results
À l’aide de la microscopie confocale avancée, nous avons observé une accumulation de protéines 53BP1 et mCherry-PCNA mCherry à des lésions de l’ADN. Analyses ont été réalisées par microirradiation locale des cellules vivantes. Afin de reconnaître les patrons de distribution nucléaire des protéines ADN-réparation-connexe dans les phases du cycle de cellules individuelles, nous avons utilisé le système cellulaire Fucci, par lequel il est possible de déterminer le G1, S tôt, et cycle de phases G2 de la cellule (Figure 1). La demande biologique du modèle cellulaire Fucci que nous avons publié en Suchankova et al. 26 montre que 53BP1 a été recruté pour les lésions de l’ADN induites localement dans les phases G1, S et G2 du cycle cellulaire, qui a été associée à la fonction de cette protéine au cours de la fin non homologue rejoindre (NHEJ), l’un des principaux mécanismes conduisant à réparation de cassure double brin. En revanche, ce système expérimental nous a montré le niveau cellulaire individuel que la protéine PCNA, qui est liée à la voie de réparation de la recombinaison homologue (HRR), reconnaît DSBs dans les fin phases S et G2 du cycle cellulaire 27. Pour les études sur les machines de réparation de l’ADN, nous avons également optimisé conditions d’irradiation afin de s’assurer que les cultures de cellules a continué à subissent une mitose après exposition aux lasers UV (Figure 3). Microirradiated cellules en mitose prouvent que, dans ces conditions expérimentales, ADN réparation produit de manière relativement physiologique et les cellules n’ont pas été blessés par les lasers, qui, à des intensités plus élevées, induisent l’apoptose. Ici, nous montrons aussi comment appliquer l’analyse de la frette-FLIM pour la caractérisation des protéines de réparation de l’ADN. Cette technologie de pointe nous permet d’étudier les interactions entre protéines locales dans le noyau de la cellule ou, subsidiairement, des interactions de protéine dans les régions nucléolaires comme le nucléole, lamina nucléaire ou grappes d’hétérochromatine. Pour les débutants dans cette technologie, nous aimerions recommander optimisation cette technique de la frette-FLIM à l’aide de la célèbre partenaires protéiques interagissant comme p53 et 53BP1 (Figure 4 a-C). En général, une connaissance de l’interaction protéine-protéine conduit à comprendre comment des complexes de protéine régulent les processus tels que la réplication, activation de gènes, silencieux d’échappement ou réparation de l’ADN. En outre, un outil très utile pour l’étude de la cinétique de la protéine est la méthode FRAP, qui présente les caractéristiques de diffusion locale de protéine et de la mobilité (Figure 4). Pris ensemble, ici nous fournissons consignes méthodologiques pour l’application des techniques de microscopie confocale avancé dans l’ADN de réparation des études.
Figure 1 : Formation de foyers de réparation de l’ADN peut être étudiée en exprimant DP-cdt1 (rouge) dans les phases G1/début S et GFP-geminin (vert) dans les phases S/G2 du cycle cellulaire des cellules HeLa-Fucci. Lésions de l’ADN survenant spontanément la protéine 53BP1 (bleu ; Alexa 405 coloration), ont été étudiés dans le G1 (rouge), début S (orange ; expression de DP-cdt1 et GFP-geminin) et G2 (vert) des phases du cycle cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : recrutement de PCNA mCherry-tag à des lésions de l’ADN au fil du temps. (A) les cellules exprimant mCherry-PCNA (rouge), se trouvaient sur un plat de microscope maillées dans certaines régions (gris). Après fixation et immunomarquage, cellules irradiées (flèches jaunes) sont trouvaient selon les coordonnées enregistrées (voir la lettre grise K par exemple) (Aa-c). Le cadre jaune et flèches (Ad) montrent la cellule qui a été agrandie en panneaux Ae-f et microirradiated. (B) l’Accumulation de mCherry-PCNA (rouge) a été étudiée dans les cellules HeLa exprimant de manière stable GFP-étiquetée histone H2B (vert). Les cellules ont été suivis immédiatement après microirradiation locale jusqu'à 35 min (voir vidéo 1). (C) les cellules Microirradiated ont été analysés par microscopie confocale 3D et accumulation de protéines à des lésions de l’ADN (par exemple, mCherry-53BP1) a été trouvée dans les trois dimensions (x-y, - z, x et y-z), bien que seul la section médiane du noyau cellulaire a été microirradiated (voir rotation 3D-cellule en projections 3D Video 2 dans la Figure 2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : cellules microirradiated par une diode laser de 405 nm procéder normalement à travers le cycle cellulaire. (A) après l’irradiation à l’aide d’un laser à diode de 405 nm, les cellules HeLa (stablement exprimant GFP-histone H2B ; vert) subissent une mitose (voir aussi Video 2). Cadres et les flèches jaunes indiquent ROI irradié dans les cellules sélectionnées. Cadres blanc Voir la mitose. (B) dans les mêmes conditions expérimentales, mitose dans les cellules irradiées a été également observée par microscopie de laps de temps dans les cellules HeLa exprimant de manière stable GFP-H2B (vert) et transitoirement exprimant mCherry-PCNA (rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse FLIM et frette-FLIM de GFP-p53 et mCherry-53BP1. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) détectés par FLIM et l’application de récupération de Fluorescence après photoblanchiment(FRAP) à diverses lésions de l’ADN. ( A-C) En moyenne (n = 10) durée de vie des GFP-étiquetée p53 en absence et en présence de l’accepteur (mCherry-53BP1), mesuré dans les noyaux de cellules HeLa ensemble il. Courbes de décomposition de fluorescence représentatif (A) et les résidus a étudié dans les cellules HeLa exprimant transitoirement GFP-p53 (donneur seule, τD) ou GFP-p53 et mCherry-53BP1 (donneur-accepteur, τDA). (B) moyenne durées de vie (τ1 τ -3) et (1 -3) des amplitudes de (un) GFP-p53 et (b) mCherry-53BP1 mesurés dans les noyaux des cellules HeLa entières. Χ2 valeurs ont aussi été calculés et sont indiqués. (C) résumé de l’efficacité FRET pour les partenaires qui interagissent bien connus GFP-p53 et mCherry-53BP1. Échelle des bars = 4-5 µm. frette-FLIM résultat montrant ~ 35 % frette d’efficacité pour interagir connus partenaires GFP-étiquetée p53 et mCherry-le tag 53BP1. (D) Cinétique de la récupération de mCherry-53BP1 a étudié à lésions survenant spontanément de l’ADN (courbe verte) et des lésions de l’ADN induite par l’UVA (courbe bleue). mCherry à des lésions de l’ADN a été blanchie au niveau de l’arrière-plan (forme dispersée de protéine de protéine de mCherry-53BP1) et la fluorescence de fond a été soustraite de chaque valeur. DATA, montré que l’intensité de la fluorescence relative de mCherry-53BP1, sont présentés comme le moyen ± écart-type. Test t de Student a révélé une différence statistiquement significative entre les deux types de lésions de l’ADN (* montre p ≤ 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : recrutement de protéine PCNA mCherry-étiquetée (fluorescence rouge) pour les lésions de l’ADN induites par les microirradiation locale en HeLa cellules exprimant stablement GFP-étiquetée histone H2B (fluorescence verte). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Accumulation de la protéine 53BP1 mCherry-tag (fluorescence rouge) à des lésions de l’ADN induite par le microirradiation locale dans les cellules HeLa. Le noyau de la cellule s’affiche dans l’espace 3D à l’aide d’un mode de logiciel qui permet la visualisation de la rotation de la cellule dans l’espace. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : Microirradiated HeLa cellules exprimant de manière stable GFP-étiquetée histone H2B (green fluorescence) passent par mitose. La région irradiée est caractérisée par l’épuisement des GFP-H2B (régions noires sont irradiées de bandes à l’intérieur des noyaux cellulaires). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Techniques de microscopie représentent des outils de base dans les laboratoires de recherche. Ici, une brève description des méthodes utilisées pour l’étude du recrutement de protéine et cinétique aux lésions de l’ADN est présentée. Nous avons particulièrement remarqué notre expérience expérimentale dans le domaine de la microirradiation locale des cellules vivantes, et nous discutons de l’étude de la cinétique de la protéine par interaction FRAP et protéine-protéine à des lésions de l’ADN par blanchiment accepteur frette28 et son avancé modification frette-FLIM (Figure 4 a-D). Les méthodes indiquées ici sont des outils indispensables pour une réelle compréhension des processus de réparation d’ADN, en particulier protéine cinétique dans les systèmes cellulaires vivants, tel qu’il est inspecté par des microscopes confocaux avancé6,7,8, 28. Ces méthodes sont d’une immense utilité pour la médecine future en ce qui concerne les effets de la radiothérapie sur les tissus ou caractériser la morphologie des cellules tumorales. Pour optimiser cette méthode, nous aimerions vous recommandons de commencer avec les partenaires de protéines qui interagissent bien connus, comme le montre la Figure 4.
Il est bien connu que le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN est très dynamique et dépendant du temps ; ainsi, l’application de la microscopie confocale Time-lapse après l’irradiation de la cellule est nécessaire non seulement dans le domaine des sciences fondamentales, mais aussi dans des cliniques26. Localement induites lésions de l’ADN due à laser microirradiation9,28,29 représentent des régions génomiques, où il est possible d’étudier la liaison aux protéines recrutement protéine-protéine et protéine-ADN et interaction. Le point de départ de ces méthodes est que le recrutement des protéines exogènes doit être vérifié par les anticorps appropriés au niveau endogène. Ensuite, l’étape critique de ces expériences est que les cellules transfectées trop peuvent fournir des résultats faussement positifs ; ainsi, la meilleure décision est d’établir des lignées de cellules exprimant de manière stable les fluorescent étiquetés protéines d’intérêt. En outre, en raison des effets phototoxiques des lasers utilisés pour l’acquisition d’images, soit les conditions pour la numérisation doivent être optimisées ou Trolox composé doit être dissous dans le milieu de culture cellulaire. En outre l’élimination de l’étape presensitization avant irradiation est recommandée. Après les microirradiation locales, réparation de l’ADN doit procéder tel que les cellules subissent une mitose ()Figure 3 a-B et vidéo 3). Induction de l’apoptose après que irradiation laser est un processus moins précieux de la vue d’ADN optimal réparation23. Il est également évident que certaines protéines de réparation de l’ADN reconnaissent des dommages à l’ADN que dans les phases de cycle de cellules spécifiques (p. ex., Bártová et al. 30). ainsi, l’utilisation du système cellulaire HeLa-Fucci, montrant les cellules dans les différentes phases de l’interphase, est un outil utile pour les études d’ADN endommagent la réponse. En outre, les phases du cycle cellulaire se distingues selon le mode de répartition nucléaire des protéine PCNA31.
Il est bien connu que les méthodes FRAP et frette représentent des outils très utiles permettant d’examiner les caractéristiques des protéines qui sont recrutés à des lésions de l’ADN7,8,32. En outre, le FLIM technique32 peut révéler des informations sur les changements de conformation dynamiques des protéines qui s’accumulent dans les lésions de l’ADN. L’utilisation de cette méthode est importante car FLIM mesure dynamiques processus cellulaires directement ; ainsi, l’intensité de fluorescence en état stationnaire est mesurée au fil du temps. FLIM approches augmentation de contraste de l’image en éliminant la fluorescence de fond. Il s’agit d’un avantage de la mesure de la frette-FLIM en comparaison avec frette d’accepteur-blanchiment conventionnel. Les durées de vie de fluorescence mesurées par FLIM fournissent des informations sur les fractions de protéines fluorescent étiquetées et montrer comment hétérogènes sondes sont dus à des conditions environnementales. Une approche biophysique plus fiable lorsque vous exécutez frette d’interaction protéine-protéine la vie cellules32,33et FLIM est aussi le meilleur.
Prises ensemble, toutes les méthodes décrites sont susceptibles de révéler de nouveaux mécanismes de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules humaines, qui est important surtout pour les approches radiothérapeutiques. Par exemple, FLIM multiphoton a été appliquée pour obtenir des images haute résolution en médecine, où elle est appelée tomographie multiphoton34. Cette méthode microscopique hautement sophistiquée peut être appliquée dans les cliniques pour le diagnostic du cancer à l’aide d’échantillons histochimiques et analysée avec une haute résolution. Méthodes FLIM peuvent en outre fournir une analyse précise de la surface des cellules tumorales selon leur autofluorescence. L’un des inconvénients de la méthode de FLIM-FRET sont son fond de logiciels très perfectionnés, qui doit être bien compris par l’opérateur de microscope. Outre la pertinence biologique des données FLIM, en général et dans le processus de réparation d’ADN, certainement se révélera dans un proche avenir.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Agence de Grant de la République tchèque, projet P302-12-G157. Expériences aussi appuyés par le Programme CZ09 recherche de tchèque-norvégien, qui est supervisé par le fonds norvégiens et par le ministère de l’éducation, jeunesse et du Sport de la République tchèque (numéro de licence : 7F14369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin - EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
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