Summary
레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.
Abstract
레이저와 로컬 microirradiation 라이브 세포에서 DNA 복구 관련 프로세스의 연구에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리가 로컬로 microirradiated chromatin에서 시간 또는 단백질 단백질 상호 작용을 통해 단백질 DNA 병 변에서 활동을 분석 하는 방법론 접근 방식을 설명 합니다. 우리 또한 세포 주기 세포 주기 의존적인 단백질 DNA 병 변에서 속도 론을 공부 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하 여 개별 단계를 인식 하는 방법을 보여 줍니다. 2 자외선 레이저를 사용 하 여의 방법론 설명 (355 nm, 405 nm) 다른 유형의 DNA 손상 유도 하는 것 또한 제공 됩니다. 만 405 nm 다이오드 레이저 셀 microirradiated 유사 분열을 통해 정상적으로 진행 하 고 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs) 없는 했다. 우리는 또한 어떻게 microirradiated 셀 관심의 내 생 단백질의 immunodetection를 수행 하기 위해 주어진된 시간에 고쳐질 수 있다 보여줍니다. 또한 생물 방법 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광) 및 FLIM (형광 일생 화상 현미경 검사 법)를 포함 하 여 자연 발생 된 셀에서의 사용 설명 DNA 수 선 연구, DNA 손상 포커스. 우리는 또한 단백질 단백질 상호 작용의 실험 연구에 FLIM-무서 워 (형광 공명 에너지 전송)의 응용 프로그램을 보여줍니다.
Introduction
구성 된 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, 및 단일 가닥 DNA 변의 모양을 이끌어 DNA 손상 또는 더블-스트랜드 나누기1,2. Γ 광선은 높은 에너지와 높은 penetrance 이온화 방사선의 형태, 따라서 방사선의이 소스는 방사선 치료3에서 널리 이용 된다. 다른 한편으로, 실험적으로 UV 레이저 모방 자연 UV 빛에 노출으로 인 한 DNA 손상을 유도 한다. 현미경 방법으로 UVA microirradiation은 개별 살아있는 세포에서 DNA 손상 연구 실험 도구를 나타냅니다. Microirradiation은 염색체 지구4,5의 조직 공개 40 년 전에 처음으로 사용 되었다. 이 기술은 매우 중 confocal 현미경의 기능 특성 또는 현대 nanoscopy의 기술적인 한계에 종속 됩니다. DNA 병 변을 유도 하 세포 5' bromodeoxyuridine (BrdU) 또는 Hoechst 33342 UV 조사 전에 presensitized 수 있습니다. Bártová 외. 6 이전 presensitization 단계를 설명 하 고 최근 우리 세포 죽음, 또는 apoptosis를 피하기 위하여이 microirradiation 기술에 최적화 된. 예를 들어 (Hoechst 33342 presensitization) 없이 405 nm 자외선 레이저를 사용 하 여 53BP1-긍정적인 이중 가닥 틈 (DSBs)의 유도 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs)의 비용으로 리드. 다른 한편으로, UV microirradiation와 함께 presensitization 단계 유도 CPDs과 DSBs의 매우 높은 수준을 동시에7,8. 이 방법은 단일 DNA 수 선 통로의 연구에 적용 하기가 어렵습니다.
Microirradiation, 단백질 모집, 활동, 및 살아있는 세포 병 변 DNA에서 상호 작용 분석 가능 하다. 이 방법의 예로 Luijsterburg 그 외 여러분 에 의해 출판 되었음 9 섬으로 단백질 1β, 그리고 우리에 대 한 최근 pluripotency 요소 Oct4 Cajal 몸, coilin와 관련 된 단백질 DNA UV 유도 된 병 변6,10모집은 처음으로 나타났다. 단백질이 DNA 병 변에서 활동 또한 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광)11,,1213 를 사용 하 여 공부 될 수 있다 또는 (형광 공명 에너지 전송) 기술14 무서 워 ,15. 이러한 방법은 병 변 DNA 또는 단백질 단백질 상호 작용 단백질의 간단한 확산을 가능성이 있다. 단백질의 추가 특성에 대 한 유용한 도구가입니다 FLIM (형광 일생 화상 현미경) 또는 그것의 함께 무서 워 기술 (무서 워-FLIM)16. 이 메서드는 셀을 안정적으로 생활 또는 형광 분자17에 의해 표를 붙인 관심사의 단백질을 뚜렷이 표현 프로세스의 연구를 사용. 여기, GFP 태그 p53 단백질 및 그것의 상호 작용 협동자, mCherry 태그 53BP1, DNA 손상 응답18,19 에 있는 중요 한 역할에 대 한 지 수 감퇴 시간 (τ)의 예가 표시 됩니다. 매개 변수 τ FLIM 계산에서 제공 하는 형광 색소의 일생은 주어진된 형광 염료, 그것의 바인딩 능력 및 그것의 세포질 환경에 대 한 특정 이다. 따라서,이 방법은 표시할 수 있습니다 우리 단백질 부분 모집단, 그들의 바인딩 능력, 및 그들의 기능 속성 사이의 구분 후, 예를 들어 DNA 손상.
여기, 우리의 실험실에 시간 특정 단백질 모집, 속도 론, 확산, 및 microirradiated chromatin의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 데 사용 되는 고급 현미경 기술의 방법론 접근의 개요 제공 됩니다. 살아있는 세포에서 로컬 DNA 변의 유도 및 UV 레이저에 의해 발생 하는 로컬 유발된 DNA 병 변에서 DNA 손상 관련 이벤트의 연구에 대 한 유용한 방법론의 설명에 대 한 단계별 방법을 제공 합니다.
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Protocol
1. 재배의 셀 라인
- 헬러 파생 셀 라인
참고: 사용 헬러 자 궁 경부 암 세포: 히스톤 H2B 안정적으로 표현 하거나 HeLa 세포 GFP 또는 헬러 Fucci 셀 RFP Cdt1 표현 태그 g 1와 이른 S 단계 및 GFP geminin S/g 2-M 단계 ( 그림 1)에서- 모든 헬러 파생 셀 라인의 경작, 사용 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% CO 2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 적절 한 항생제와 보충. 대체 매체 2-주 당 3 번.
- 문화 매체를 제거 하 고 씻어 트립 신 억제제를 포함 하는 혈 청의 모든 흔적을 제거 하기 위해 1 x PBS를 사용 하 여 셀. 실 온에서 생물 학적 후드에이 단계를 수행.
- 셀 레이어 커버 prewarmed 트립 신-EDTA 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 셀 계층 분산 (일반적으로 3-5 분) 때까지 37 ° C. Trypsinize 세포에서 세포를 유지.
- 트립 신-EDTA, 비활성화를 prewarmed 완전 한 성장 매체의 3 mL를 추가 하 고 부드럽게 여러 번 pipetting으로 매체를 분산.
참고:이 절차 수행 해야 생물 학적 후드에서 오염 물질에서 연산자를 보호 하 고 최적의 세포 배양 조건을 유지 하기 위해. - Count 셀 자동 셀 카운터 또는 Bürker 챔버를 사용 하 여. 새로운 요리에 세포 현 탁 액 1 × 10 5 셀/mL를 피펫으로 5ml를 희석. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
- 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs), D3 셀 라인의
- 셀에 문화 mESCs 문화 요리 0.2% 젤라틴 및 mESC 유지 보수 매체와 코팅. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
참고: 50 mL aliquots에 mESCs 재배/유지 보수 매체를 준비 하 고 2-8 ° C에서 최대 2 주 동안 그것을 저장 것이 좋습니다. MESC 매체 포함 75 mL ES 세포 FBS, 5 mL 페니실린 G와 스, 5 mL 비 필수 아미노산 (10mm) (최종 농도 0.1 m m), 50 µ L 마우스 백혈병 억제 인자 (mLIF; 100 µ g/mL) (최종 농도 10 ng/mL), 430 µ MTG (1-L Thioglycerol; DMEM에 1: 100 희석) (최종 농도 100 µ M)과 높은 포도 당 DMEM 매체를 500 mL. - MESC 재배 매체 문화 접시에서 발음 및 1 x PBS와 한 번 셀 린스.
- 0.5 mL 트립 신-EDTA를 추가 하 고 셀 접시에서 분리할 때까지 그냥 37 ° C에서 품 어. 그런 다음은 트립 신 15% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 mESC 재배 매체의 2 mL로 세포 세척 하 여 비활성화.
- 문화 접시에서 나머지 셀을 꺼내 려 하는 피 펫을 사용.
참고: 그것은 단일 세포를 얻기 위해 중요 한 세포 덩어리는 세포의 분화 촉진 하기 때문에. - 분할 세포 mESC 유지 보수 매체와 gelatinized 요리에 1시 10분.
참고: mESC 세포의 밀도가 너무 낮은 경우에, 그들은 성장 하지 않는다. 차별화 추진 밀도가 너무 높은 경우. - 확인 mESCs 4 개의 새로운 요리에 한 페 트리 접시에서 세포를 분할 하 여 두 번째 매일 mESC 통로 수행 하 여 미 분화 상태로 유지 됩니다. MESC 식민지 100 배 또는 200 배 확대, 거꾸로 현미경으로 검사 하 고, 증거가 있다 자발적인 mES의 세포 분화, Oct4 단백질 소모를 평가 하는 서쪽 오 점 수행.
참고: 최적의 셀 뿌리고, 함께 체 외에 mESCs의 자발적인 차별화 감소 될 수 있다.
- 셀에 문화 mESCs 문화 요리 0.2% 젤라틴 및 mESC 유지 보수 매체와 코팅. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
2. 세포 Transfection
- 종자 세포 gridded 현미경 요리 실험 하기 전에 48 h (직경 35 m m) 페 트리 접시에 그들의 좌표에 따라 microirradiated 셀을 찾기 위해.
참고:이 예제는 microirradiation에는 첫 번째 실험 단계 이며 immunostaining은 두 번째 ( 그림 2A).- 시드를 사용 하 여 5 × 10 4 셀/mL의 농도 헬러 파생 셀 라인 (또는 1 × 10 4 셀/mL D3 mES 셀). 요리 당 2 mL 전체 매체 사용 합니다. 재배와 microirradiation, 동안 37 ° C, 5% CO 2는 온도 또는 재배 실에 셀 유지.
- 자동 셀 카운터를 사용 하 여 계산 셀.
참고: 셀의 높은 농도 사용 하지 마십시오. D3 mESCs의 밀도가 포장된 식민지, 특히의 경우 높은 세포 밀도 immunostaining 후 로컬 microirradiated 세포의 식별 방지.
- 다음과 같이 선택의 플라스 미드 DNA 및 transfection 시 약 준비. 선택 된 플라스 미드 DNA의 2-3 µ g를 사용 하 여 솔루션을 준비 (자세한 내용은 테이블의 자료 참조)와 150 µ L 1 x PBS. 솔루션 B 150 µ L 1 × PBS에 3.5 µ L transfection 시 약을 사용 하 여 준비 합니다. 각 솔루션 주의 pipetting으로 잘 혼합 되도록.
참고: DNA와 transfection 시 약의 최적 비율 실험적으로 결정 되어야 각 셀 라인 및 개별 플라스 미드. - 뚜렷이 transfected 삶의 실험 관찰 하기 전에 h 24에 셀 결합 솔루션 및 솔루션 B vortexing 없이. 15-20 분 동안 실내 온도에 결합 된 솔루션을 품 어. Dropwise 방식에서 균질 분산이 현미경 접시에 성장 셀 레이어에 transfection 혼합물 (300 µ L, 2.2에서 설명한 점으로) 완료. 37 ° C에서 4-6 시간, 5% CO 2
- 품 셀은 신선한 매체 transfection 혼합물을 다음 바꿉니다. 표준 조건 하에서 세포를 배양.
참고: 405 nm 레이저를 사용할 때 셀 모든 시 약을 presensitize 하지 않습니다 하지만 355 nm 레이저를 사용할 때 수행 10 µ M 5-브로 모-2와 셀 presensitization '-의하여-uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization 시간 세포 유형과 세포 주기의 길이에 따라 달라 집니다. 헬러 세포 추가 BrdU 로컬 microirradiation 전에 16 ~ 20 h. MESCs, 경우 추가 BrdU microirradiation 전에 6 ~ 8 h.
3. 로컬 DNA 변과 Confocal 현미경 검사 법의 유도
- 접시 현미경 스테이지에 놓고 접시에 선택한 셀의 위치를 기록, 셀 좌표 추가 분석을 위해 필요한 것입니다 ( 그림 2A -c).
- 숫자 또는 문자 ( 그림 2A d-f, 광고 표시 패널 Ae와 Af 확대는 셀의 위치에에서 화살표) 광장에서 transfected 셀을 찾을. 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀의 이미지를 가져오고는 셀 및 레이블이 광장 ( 그림 2A)의 위치를 식별 하기 위해 형광 이미지를 획득.
- 조사 하기 전에 이미지 수집, confocal 현미경에 연결 된 흰색 빛 레이저 (WLL) (1 nm 단위로 470-670 nm) (또는 다른 사용 가능한 레이저는 conf에 연결 사용로컬 현미경).
- 다음 설정을 사용 하 여: 512 × 512 픽셀의 해상도, 픽셀 크기 64 nm, 400 Hz, 양방향 모드 (두 방향으로 스캔), 평균 세트 8, 8 x 12 엑스 줌
참고: 선 평균이 나타냅니다 주어진된 수를의 검사; 같은 줄의 다음 줄으로 계속 하기 전에 여러 번 검색 합니다. 모든 라인의 스캔 이미지의 마지막 프레임을 생산 반복. - 이미지 관찰 및 인수 사용 하 여 63 × 오일 목표 1.4의 조리개 수치와 및 형광 이미지를 순차적으로 취득. 적절 한 소프트웨어의 순차 스캔 모드를 사용 하 여 두 개의 형광 사이 크로스 토크 제거.
참고: 모든 현미경 소프트웨어 소위 순차 스캔 모드의 설정을 수 있습니다. 연산자는 형광을 확보 여부를 선택할 수 있습니다 ' 정보 동시에 (예를 들어, 빨강-녹색-파랑 형광에서) 언급 했 듯이 여기에, 개별적으로 또는 (순차적으로), 형광 색소에 의해 형광 색소. GFP에 대 한 최대 여기/방출 395/509는 일반 정보를 고려 및 mCherry에 대 한 최대 여기/방출은 587/610 nm ( 그림 2B에서 여기에서 사용 하는 형광을 참조). 이 정보에 따라에 적당 한 흥분 및 원하는 형광 방출 필터 선택 하십시오. 필터 선택과 절차를 스캔 각 confocal 현미경 최적화 해야 합니다. - DNA 변의 스캔 모드, 64 사용 하 여 선 유도 WLL 끄고 (에서 ' 수집 ' 모드), 외부 자외선 소스에 전환 (에 " UV 레이저 " 버튼), 관심 (ROI)의 영역 설정 (에서 ' 수집 ' 모드), 355 nm를 설정 100% 전원 레이저 또는, 또는, 405 nm 레이저 소스를 사용 하 여.
참고: 일반적으로, 레이저 파워 이미지 수집 모드에서 적절 한 레이저 조정 버튼으로 조정 됩니다. - 로컬 microirradiation 근처 UVA 스펙트럼에서 방출 하는 레이저를 사용. 투자 수익; 외부 레이저 강도 조절 하는 이미지 수집 모드에서 0으로 배경을 설정 하는 핵에 있는 투자 수익의 microirradiation 및 캡처 이미지 경우 셀 제대로 반구, GFP 히스톤 H2B의 신호, 사라지고, 방사선 조사 후 즉시 mCherry 태그 PCNA 단백질 DNA 병 변에 보충 수는 예를 들어 ( 그림 2B와 비디오 1 ).
참고: DNA 상해 confocal 섹션도 3 차원 (3D) 프로젝션 (참조 3D 회전 및 x-y, x-z, y z 예측 그림 2C와 비디오 2)에 표시 한 투자 수익에 유도 한다. 에 대 한 설명은 355 nm 405 nm 레이저에 대 한 완전 한 기술적인 매개 변수, 참조 Stixová 외. 7 - 후 ROI를 반구, 끄고 외부 자외선 소스, ROI를 끄고는 WLL에 스위치, 8, 스캔 라인 변경 및 방사선에 대 한 다른 셀을 찾을. ROI 선택 단추 사용 하 여 해당 소프트웨어에서 ' s 이미지 수집 모드.
참고: mCherry PCNA 2와 20 분 ( 그림 2B) 사이의 DNA 병 변에서 최대 축적 피크를 있다. 외 인 단백질 수준에서 결과 확인 하려면 로컬 microirradiation 후 즉시 얼룩 면역 형광 검사 진행. 관심에 따라 방사선 조사 시간 간격을 선택 합니다. - 확인 외 인 단백질의 축적 microirradiated 세포의 대다수에서 검출 될 수 있다. 이 확인에 대 한 기준을 사용 하 여 다음 단계에서.
- 확인 정도 transfected 세포 외 인 단백질의 아무 overexpression입니다. 가능한 솔루션으로, 형광 성 단백질 (예를 들어, mCherry-PCNA 또는 mCherry 53BP1)의 약한 식만 있는 셀 선택.
- 평가 WLL 노출 이미지 취득에 사용의 phototoxicity.
참고: phototoxicity 테스트, 장기간된 레이저 microirradiation transfected 세포 노출과 그림 3A에서와 같이 세포 유사 분열을 진행 확인 -B. 가능한 솔루션으로, 스캔 시간 및 셀 당 confocal 조각 수 절감, 최적의 축 단계 (0.3 µ m 권장)의 선택에 의해 3D 스캐닝 최적화 하 고 레이저를 설정 ' 그것의 최소한 s 힘. 또는, phototoxicity 재배 매체에 용 해 되는 Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic 산, 수용 성 비타민 E 아날로그)를 사용 하 여 제거할 수 있습니다. DNA 손상 관련 실험에 대 한 자외선에 대 한 그것의 보호 효과 Trolox의 사용 하 여 권장 되지 않습니다. - 355 nm 레이저 조사, 경우 확인 BrdU BrdU 법인에서 적절 한 BrdU 탐지 항 체를 사용 하 여 충분 한 통합 키트 (재료의 표 참조). BrdU는 세포 주기의 S 단계 동안 DNA에 통합 되어, 이후 셀의 대다수 presensitization 동안 S-단계를 통해 진행 해야 합니다. 고려은 셀 세포 주기의 길이 가능한 솔루션으로 서 특정.
- 분석 여부는 DNA 복구 관심의 단백질 phase(s) 특정 세포 주기에서 DNA 장애를 인식 하는 기능이 있다. 가능한 해결책: DNA 병 변 선택 된 단백질의 신규 모집은 특정 세포 주기 단계 (G1/S/G2) 제한 확인, 헬러 Fucci 셀을 사용 합니다. 이러한 셀이 GFP 태그 geminin S/g 2-M 세포 주기 단계 22 ( 그림 1)를 표현 하는 G1 및 이른 S 단계 RFP Cdt1.
- Apoptosis, 세포 죽음을 피하기 위해 적절 한 레이저 소스를 선택 하 고 전원 설정 23 레이저. 세포 반구 유의 유사 분열을 진행 해야 합니다 ( 그림 3A -B, 비디오 3).
참고: 원하지 않는 apoptosis Annexin V 양성, caspase 3, 또는 lamin B 분열 하 여 검색할 수 있습니다. 형태학 상 수준에 세포 분리 및 apoptotic 시체의 형성을 표시 됩니다.
4. 면역 형광 검사 얼룩
- 1 × PBS 짧게 (현미경 요리에서 성장) 셀 레이어를 헹 구 고 rinsing 후, 실 온에서 4% 포름알데히드 (헬러 파생 셀 라인)에 대 일 분 또는 20 분 (대 한 D3 ES 세포)를 사용 하 여 셀을 수정. 1 × PBS 가진 접시 린스.
주의: 포름알데히드 심각한 눈 손상의 원인, 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수 이며 또한 잠재적인 발암 물질; 따라서, 포 름 알 데히드와 모든 실험 단계 추출기 후드에서 수행 되어야 합니다.
참고: 불필요 한 표백 형광 신호를 방지 하려면 저장 요리 어두운 챔버에 면역 형광 염색에 필요한 보육 시간 동안. - 0.1% 트라이 톤 X-100 H 2 O 8 분에 녹아 세포를 permeabilize 고 다음 0.1%와 0.1% 사포닌을 포함 하는 1 × PBS와 12 분에 대 한 셀을 품 어 트라이 톤 X-100. 부 화, 후 씻어 1 × PBS 15 분에 대 한 두 번 셀
- 1 × 난다 바인딩을 선택 된 항 체를 차단 하는 60 분에 대 한 PBS에에서 1 %BSA 품 셀. 부 화 후 15 분 동안 1 × PBS에에서 세포를 씻어.
- Dilute 1: 100 (또는 1: 200)의 비율로 1 차적인 항 체 (이 단계 o 되어야 합니다개별 항 체에 대 한 ptimized) 1 × PBS에서에서 1 %BSA 접시, 당 25 µ L이 솔루션을 사용 하 고 커버는 coverslip로 셀. 솔루션 4 하룻밤 습도 챔버에 1 차적인 항 체를 포함 하는 셀을 품 어 ° c.
- 다음 날에 씻어 1 × 2 시간 5 분 대 한 PBS에 셀
- 1: 100 (또는 양자 택일로 1: 200) 1 × PBS, 1 %BSA이 솔루션의 100 µ L를 사용 하 여 요리, 당의 비율에서 이차 항 체를 희석 하 고 커버는 coverslip로 셀. 60 분에 대 한 2 차 항 체를 포함 하는 솔루션으로 셀을 품 어. 부 화, 후 씻어 1 × 3 시간 5 분 대 한 PBS에에서 셀
- 장착 매체의 드롭 coverslip 탑재 하 고 매니큐어와 현미경 관찰 동안 건조 하 고 움직임을 방지 하기 위해 접착제 coverslip 인감. 4 어둠 속에서 요리를 저장 ° c.
5. 형광 일생 이미지 (FLIM) 현미경
- 시작은 FLIM 소프트웨어. 열기는 " 스위트 " 소프트웨어의에 스위치는 " FLIM " 모드. WLL 펄스 모드에서 작동할 다는 것을 확인.
참고: 연산자는 펄스 모드를 도달 하는 하드웨어 단추를 전환 해야 합니다. - 지역 microirradiation, 동안으로 동일한 방향에서 현미경 스테이지 (섹션 4에에서 스테인드) 스테인드 세포를 포함 하는 접시 놓고 페 트리 접시에 격자에 비친된 셀을 찾을 합니다. Confocal 현미경 이미지 수집 수행.
참고: 다음 설정을 사용 하 여: 1024 × 1024 픽셀, 400 Hz, 양방향 모드, 16 라인 엑스 12 8 x 줌 - FLIM 측정을 시작 하기 전에 예비 테스트 클릭 하 여 지 수 감퇴의 실시간 기록 표시를 수행 " 설치 FLIM "와 " 인수 "를 눌러 " 실행 FLIM 테스트 ". 다음과 같이 두 가지 주요 매개 변수를 평가 하 여 샘플 FLIM 매개 변수를 최적화 합니다.
- 여기 파장 WLL의 반복 속도 조정 샘플의 수명에 최적화 (아래 참고 참조). 공초점 현미경 소프트웨어에서 적절 한 단추를 일반적으로 불리는와 레이저 강도 조정 " 레이저 조정 설정 "에 ' 이미지 수집 ' 메뉴. 다음, FLIM 소프트웨어를 사용 하 여 감퇴 곡선 (또는 모든 광자 수를 보여주는 히스토그램) 계산 ( 그림 4A 참조 -B).
참고: 여기에 대 한 펄스 모드로 WLL을 사용 합니다. 소프트웨어를 갖추고 있어야 합니다 펄스 선택 WLL, 반복 속도 선택할 수에 대 한 (80, 40, 20, 또는 10 MHz). GFP, 형광 기증자의 경우 흥분 파장은 488 nm. 감퇴 곡선 FLIM 소프트웨어 작업 영역을 사용 하 여 기록 됩니다. 매개 변수 (τ D, τ 다) 지 수 감퇴 시간 표시 (예, 형광 색소 평생); 매개 변수 (A) 형광 색소 감퇴의 진폭을 나타냅니다 (FLIM p53 GFP 태그와 mCherry 태그 53BP1 그림 4A에 대 한 데이터의 예를 참조 -B). - 는 소프트웨어 수집 도구 (선택 반복 속도 모드)를 사용 하 여 카운트 반복 속도 확인 합니다. 샘플;에 밝은 픽셀을 선택 밝은 픽셀에 대 한 곡선 전체 형광 강도의 10% 미만 이어야 합니다.
- 여기 파장 WLL의 반복 속도 조정 샘플의 수명에 최적화 (아래 참고 참조). 공초점 현미경 소프트웨어에서 적절 한 단추를 일반적으로 불리는와 레이저 강도 조정 " 레이저 조정 설정 "에 ' 이미지 수집 ' 메뉴. 다음, FLIM 소프트웨어를 사용 하 여 감퇴 곡선 (또는 모든 광자 수를 보여주는 히스토그램) 계산 ( 그림 4A 참조 -B).
- 클릭 " 측정 "를 누르고 " 실행 FLIM ".
6. 기증자 수명을 FLIM 스크립트 및 효율 계산 무서 워를 사용 하 여
- 무서 워 FLIM 소프트웨어를 시작 하 고 열은 ' 기증자 ' 작업 영역.
- 선택은 " 분석 " / " 이미지 " 메뉴에서 탭을 클릭 하 여 FLIM 스크립트 시작 " 시작 ". 최적의 무서 워 FLIM 설정에 대 한 잘 알려진 상호 작용 단백질 파트너 사용.
참고: 잘 알려진 상호 작용에 대 한 무서 워 FLIM 효율 파트너 GFP p53 그리고 mCherry 53BP1 (34.1 ± 2.3) % ( 그림 4C). - 기증자 방출 채널 (채널 1 또는 2) 및 보도를 사용 하 여 " 계산 빠른 FLIM ".
참고: 이미지 및 그래프 모두 업데이트 됩니다. - 에 무서 워 FLIM 소프트웨어 강도 규모 설정 (0-4000 카운트)와 평생 스케일 (0-5 ns) 소프트웨어에서 수동으로. 이 방법의 셀을 시각화 하 고 무서 워 FLIM 측정 설정.
참고:이 설정은 제거 세포 인구에서 개별 셀 간에 형광 강도 차이. - 부패 형태로 피팅 모델 선택.
참고: 좋습니다 n 지 수 reconvolution와 다양 한 모델 매개 변수 " n ". 최적의 맞춤은 다음 기준:는 장착 잘 감퇴 곡선 그리고 χ 2 오버레이 곡선-값이 1 ( 그림 4B). - 선택은 " 임계값 " / " 사용 임계값 " 75 임계값을 설정 하 고. 시작 " 맞는 초기 ".
참고: SPT64 소프트웨어 계산 무서 워의 부재의 평균 기증자 수명 (" 진폭이 중된 평균 수명 ", τ Av.Amp)
7. FLIM 무서 워 스크립트를 사용 하 여 무서 워 효율
- 기증자 또는 수락자 작업 영역을 선택 하 고 다음을 엽니다 " 분석 " | " 이미징 " | " 일생 초조해 이미지 ".
- 액티브 채널로 기증자를 선택 하 고 픽셀 비 닝 광자 수/픽셀에 따라 조정. 그런 다음 실행 하는 소프트웨어 모드 라는 " 계산 FastFLIM ". 이미지에서 광자 수/픽셀 낮은 경우 픽셀 Binning 4 포인트 증가.
- 강도 0으로 설정-200 개수와 평생을 0-5 ns.
- 활성화 " 사용 임계값 " 75의 임계값을 입력 하십시오.
- 피팅 모델을 설정 " 멀티 exp. 기증자 ", 모델 매개 변수를 입력 " n ", 입력 τ τ D로 Av.Amp (단계 6.6) 활성화 및 " 초기 맞는 ".
- 설정 매개 변수 Bkgr 12 월, IRF, 변화와 Bkgr 마크를 제거 하 여 상수 값을 IRF.
참고: 가능한 일정 하 게 유지 하는 매개 변수의 대부분을 설정 합니다. 이 방법은 통계 동요를 감소 시킨다. 이 경우에, 누르지 마십시오 " 맞는 초기 " 다시. 다음 언급 한 매개 변수 설명: IRF 악기 응답 기능, BkgrDec = 지 수 맞추기, ShiftIRF에서에서 배경 = = 지 수 reconvolution 적합, BkgrIRF에서에서 IRF 근무 적합 지 수 reconvolution에서 IRF 배경 =. 모든 세 개의 매개 변수가 계산 되 고 추가 분석을 위해 소프트웨어를 사용 하 여 해결할 수 있습니다. - 보도 " 계산 FRETŔ는 무서 워 (FLIM 이미지 영역에서 플롯) 이미지와 무서 워 효율 히스토그램 계산 되 고 무서 워 거리 히스토그램 플롯 ( 그림 4C). 이미지 분석 완료 되 면를 누릅니다 " 저장 결과 ".
참고: 동안 무서 워 실험 그것은 형광 단백질 가역 전환 (밝은) 형광 비 형광 (어둠) 했으며 전시를 해야 하. 이 특성 불린다 " 깜박임 ", 무서 워 효율 (이 효과 대 한 설명 Vogerl 그 외 여러분에 의해 제공 된이 현상으로 영향을 24).
8. FRAP 분석
- 장소를 표시현미경 단계에 h 관심, 붙일 태그가 단백질 표현 transfected 세포 찾아서 표준 현미경 램프와 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 수집을 수행 (참조 그림 2Aa-b)와 형광 현미경 모드입니다.
- Confocal 현미경 (또는 선택 된 형광 색소에 따라 선택의 레이저)에 연결 된 흰색 빛 레이저 (WLL)를 사용 하는 이미지 수집에 대 한. 다음 설정을 사용 하 여: 512 × 512 픽셀, 1000 Hz, 양방향 모드, 선 평균 1, 8 x 12 엑스 줌
- (~ 10% 레이저 전력)에서 적어도 15 prebleaching 이미지와 이미지 수집 메뉴에 관심 (ROI)의 영역을 정의.
- Photobleaching 실험, 아르곤 레이저를 사용 하 여 (488 nm). 다음 설정을 적용: 프레임 해상도 512 × 512 픽셀, 1000 Hz, 양방향 모드, 엑스 10 8 x 줌
참고: 488에서 일 하는 아르곤 레이저에 의해 흥분 수 형광 GFP, RFP, mCherry, 등 또는 514 nm. - 는 FRAP 소프트웨어 모드 선택의 현미경의 사용. 아르곤 레이저를 설정 하는 동안 photobleaching, ' 레이저 조정 버튼을 사용 하 여 최대 s 힘. 10% 레이저 전력에서 0.256 s 간격으로 이미지 수집 수행.
참고: 단계를 postbleaching에 대 한 선택의 confocal 현미경의 표준 이미지 수집 모드 사용. Photobleaching 후- 모니터 형광 복구 시간 (최대 45-50 s 표백 절차 후).
참고: 그림 4D 같이 53BP1 mCherry 태그에 대 한 photobleaching 후에 복구 시간 자발적인 DNA 병 변 및 UVA-방사선-유도 foci에서 구분 됩니다. mCherry-53BP1 UVA 병 변에서 자발적으로 발생 하는 DNA 복구 foci;에서 mCherry 53BP1 축적에 비해 빠르게 복구 참조 그림 4D 및 Foltankova 외. 25
- 모니터 형광 복구 시간 (최대 45-50 s 표백 절차 후).
- 현미경 소프트웨어 (또는 선택의 소프트웨어)에서 스프레드시트 데이터를 내보낼 및 통계 분석을 수행.
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Representative Results
고급 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여, DNA 병 변에서 mCherry 태그의 53BP1 및 mCherry PCNA 단백질의 축적을 관찰 합니다. 분석은 살아있는 세포의 지역 microirradiation에 의해 수행 되었습니다. 우리는 초기 S, g 1을 확인 하는 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하는 개별 세포 주기 단계에서 DNA 복구 관련 단백질의 핵 배포 패턴을 인식 하 고 셀의 G2 단계 주기 (그림 1). 우리는 Suchankova 외 에 출판 Fucci 세포 모델의 생물 학적 응용 26 그 53BP1의 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 동안이 단백질의 기능에 연관 되었다, 세포 주기 G1, S, G2 단계에서 로컬로 유발된 DNA 장애에 채용 되었다 표시를 선도 하는 주요 메커니즘 중 하나 이중 가닥 브레이크 수리입니다. 다른 한편으로,이 실험적인 시스템 보여 PCNA 단백질 상 동 재조합 복구 통로 (HRR)에 연결 된 세포 주기 27의 후반 S와 G2 단계에서 DSBs 인식 개별 세포 수준. DNA 수 선 기계에 대 한 연구, 대 한 우리는 또한 세포 배양 UV 레이저 (그림 3)에 노출 된 후 유사 분열을 계속 수 있도록 방사선 조건 최적화. Microirradiated 세포 유사 분열을 겪고,이 실험 조건에서 상대적으로 생리 적인 방식과 셀 DNA 수리 진행 하지 의해 부상 되어 높은 농도에 있는 apoptosis를 유도 레이저 증명. 여기, 우리는 또한 DNA 수 선 단백질의 특성을 무서 워 FLIM 분석을 적용 하는 방법을 보여줍니다. 이 고급 기술은 세포 핵에 지방 단백질-단백질 상호 작용, 또는 양자 택일로, 핵소체, 핵 lamina 또는 섬으로의 클러스터 같은 nucleolar 지역에 있는 단백질 상호 작용 연구를 수 있습니다. 초보자를 위한이 기술에, 우리는 p53 및 53BP1와 같은 잘 알려진 상호 작용 단백질 파트너를 사용 하 여이 무서 워 FLIM 기술을 최적화 하는 것을 권장 하 고 싶습니다 (그림 4A-C). 일반적으로, 단백질 단백질 상호 작용의 지식 단백질 복합물 복제, 유전자 활성화, 침묵, 또는 DNA 복구 같은 프로세스를 통제 하는 방법을 이해 이끌어 낸다. 또한, 단백질 동역학의 연구에 대 한 매우 유용한 도구 로컬 단백질 보급 및 이동성 (그림 4D)의 특성을 보여주는 FRAP 방법입니다. 함께 찍은, 여기 우리가 제공 DNA에 고급 confocal 현미경 검사 법 기술을 적용 하기 위한 방법론 지침 연구를 복구 합니다.
그림 1: DNA 수리 foci의 형성 세포 주기의 S/g 2 단계에서 g 1/이른 S 단계에 GFP geminin (녹색) RFP cdt1 (레드)를 표현 하는 헬러 Fucci 셀에 공부 될 수 있다. 53BP1 단백질 (블루;에 대 한 긍정적인 저절로 발생 DNA 병 변 알 렉 사 405 얼룩), (빨강), g 1은에 공부 했다 초기 S (오렌지, RFP cdt1의 GFP geminin 식), 및 세포 주기의 G2 (녹색) 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시간이 지남에 DNA 병 변에서 PCNA mCherry 태그의 모집. (A) mCherry-(레드), PCNA 표현 하는 셀 선택된 영역 (회색)에서 gridded 현미경 요리에 위치 하 고 있었다. 고정 immunostaining 후에, 방사능된 셀 (노란색 화살표) 있었다 (예를 들어 회색 편지 K를 참조) 등록 된 좌표에 따라 (Aa-c). 노란색 프레임 및 화살 (광고) 표시 셀 microirradiated과에 확대 패널 Ae-f. (B) (레드) mCherry-PCNA의 축적은 안정적으로 GFP 태그 히스톤 H2B (녹색)을 표현 하는 HeLa 세포에서 연구 했다. 셀 로컬 microirradiation 최대 35 분 후 즉시 모니터링 했다 ( 비디오 1참조). (C) Microirradiated 셀 3D confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다 그리고 비록 유일한 단백질 축적 DNA 병 변 (예, mCherry-53BP1)에서 모든 3 개 차원 (x-y, x-z부터, 그리고 y-z)에서 발견 세포 핵의 중앙부는 microirradiated ( 그림 2C에서 비디오 2 3D 예측 3D 셀 회전 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 405 nm 레이저 다이오드, 세포 microirradiated 세포 주기를 통해 정상적으로 진행. (A) 조사 405 nm 다이오드 레이저를 사용 하 여, 후 HeLa 세포 (안정적으로 표현 GFP 히스톤 H2B; 녹색) 받 다 유사 분열 ( 비디오 2참조). 노란색 화살표와 프레임 선택한 셀에 비친된 투자 수익을 나타냅니다. 흰색 프레임 표시 유사 분열입니다. (B) 같은 실험 조건 하에서 비친된 세포 유사 분열 또한 관찰 되었다 시간 경과 현미경 안정적 GFP H2B (녹색)을 표현 하 고 뚜렷이 표현 (레드) mCherry-PCNA HeLa 세포에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: FLIM 무서 워 FLIM 분석 GFP p53 및 mCherry 53BP1. 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) FLIM 및 형광 복구 후 Photobleaching의 응용 프로그램에 의해 감지다양 한 DNA 병 변에서 (졸라). ( A-C) 평균 (n = 10) GFP 태그 p53 부재와 수락자 (mCherry-53BP1)의 존재에 전체 nonreplicating 헬러 세포 핵에 측정의 수명. (A) 대표 형광 감퇴 곡선 및 오차 정도 GFP-p53 (기증자 전용 τD) 또는 GFP p53 및 mCherry 53BP1를 표현 하는 HeLa 세포에서 공부 (기증자-수락자, τDA). (B) 평균 수명 (τ1 τ-3) 및 (a) GFP p53 및 (b) mCherry 53BP1의 진폭 (1 -3) 전체 HeLa 세포 핵에 측정. Χ2 값도 계산 하 고 표시 됩니다. 잘 알려진 상호 작용에 대 한 무서 워 효율의 (C) 요약 파트너 GFP p53 및 mCherry 53BP1. 스케일 바 = 4-5 µ m. 무서 워 FLIM 결과 표시 ~ 35% 무서 워 효율 p53 GFP 태그와 mCherry 태그 53BP1 파트너 잘 알려진 상호 작용에 대 한. (D) MCherry-53BP1의 복구 활동은 저절로 발생 DNA 병 변 (녹색 곡선)과 DNA UVA 유도 된 병 변 (파란색 곡선)에서 공부 했습니다. DNA 병 변에서 mCherry 배경 (mCherry-53BP1 단백질의 단백질의 분산된 형태)의 수준에 표백 했다 그리고 배경 형광은 각 값에서 뺍니다. Data, mCherry-53BP1의 상대 형광 강도 표시 수단 ± 표준 오류로 표시 됩니다. 스튜던트 t-검정 밝혀 DNA 변의 두 형식 간의 통계적으로 유의 한 차이 (* p 0.05를 보여줍니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: mCherry 태그 PCNA 단백질 (레드 형광) 병 변은 DNA의 모집 HeLa 세포 안정적으로 표현 GFP 태그 히스톤 H2B (그린 형광) 지역 microirradiation에 의해 유도 된. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 2: HeLa 세포에서 현지 microirradiation에 의해 유도 된 DNA 병 변에서 mCherry 태그 53BP1 단백질 (레드 형광)의 축적. 세포 핵 공간에서 셀 회전의 시각화를 가능 하 게 하는 소프트웨어 모드를 사용 하 여 3D 공간에 표시 됩니다. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 3: Microirradiated 헬러 세포 안정적 GFP 태그 히스톤 H2B 표현 (형광 녹색) 유사 분열 진행. 조사 지역 GFP H2B (검은 영역은 셀 핵 안에 비친된 스트립)의 고갈에 의해 특징입니다. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
현미경 검사 법 기술 연구 실험실에서 기본 도구를 나타냅니다. 여기, 단백질 모집의 연구에 대 한 사용 하는 방법에 대 한 간략 한 설명을 하 고 속도 론 DNA 병 변에서 선물 된다. 우리는 특히 살아있는 세포의 지역 microirradiation의 분야에서 우리의 실험 경험을 언급 하 고 우리가 FRAP 및 단백질-단백질 상호 작용 수락자 표백 무서 워28 에 의해 DNA 병 변 및 그것의 첨단에 의해 단백질 활동의 연구를 토론 수정 무서 워-FLIM (그림 4A-D). 여기에 표시 된 메서드는 DNA 복구 프로세스, 특히 단백질 활동 생활 셀룰러 시스템에서의 진정한 이해를 위한 필수 도구 고급 confocal 현미경6,,78, 검사 28. 이 방법은 조직 또는 종양 세포 형태학을 특성화에 방사선 치료의 효과 함께 미래 의학에 엄청난 유틸리티의 있습니다. 이 메서드를 최적화 하려면 우리 싶습니다 잘 알려진 상호 작용 단백질 파트너와 함께 시작 하는 것이 좋습니다 그림 4C와 같이.
그것은 잘 알려진 병 변 DNA에 단백질 모집은 매우 역동적이 고 시간에 따라; 따라서, 셀 방사선 조사 후 시간 경과 confocal 현미경 검사 법의 응용이 기초 과학의 분야에서 뿐만 아니라 클리닉26에 필요 합니다. 로컬 유도 DNA 병 변 레이저 microirradiation9,,2829 인 대표 게놈 영역 단백질 모집, 단백질-단백질, 또는 단백질-DNA 바인딩 공부 수은 상호 작용입니다. 이 방법의 출발점은 내 생 수준에 적절 한 항 체에 의해 외 인 단백질의 신규 모집을 확인 해야 합니다. 다음, 같은 실험의 중요 한 단계는-transfected 세포 거짓 양성 결과;를 제공할 수 있습니다. 따라서, 최선의 결정 안정적으로 관심의 붙일 태그가 단백질을 표현 하는 셀 라인을 설정할 것 이다. 또한, 이미지 취득에 사용 하는 레이저의 phototoxic 영향으로 검색 조건을 최적화 해야 합니다 또는 Trolox 복합 셀 재배 매체에 녹아 야 한다. 또한 제거 presensitization 단계 전에 조사 하는 것이 좋습니다. 로컬 microirradiation 후 세포 유사 분열 (그림 3A-B 를 받게 되도록 DNA 수리 진행 해야 합니다 및 비디오 3). 후 레이저 조사 최적의 DNA의 보기에서 덜 중요 한 과정은 apoptosis 유도23복구. 그것은 또한 분명 어떤 DNA 수 선 단백질만 특정 세포 주기 단계 (예를 들어, Bártová 그 외 여러분 에서 DNA 손상 인식 30). 따라서, interphase의 개별 단계에서 셀을 보여주는 헬러 Fucci 셀룰러 시스템의 사용의 DNA 손상 응답에 대 한 유용한 도구입니다. 또한, 세포 주기 단계 PCNA 단백질31의 핵 배포 패턴에 따라 인식 될 수 있습니다.
그것은 잘 알려진 FRAP 무서 워 방법 DNA 병 변7,,832로 보충 된 단백질의 특성 조사를 위한 매우 유용한 도구를 나타냅니다. 또한, FLIM 기법32 단백질 DNA 병 변에서 축적의 동적 구조적 변화에 대 한 정보를 알아낼 수 있습니다. FLIM 직접; 동적 세포질 과정을 측정 하기 때문에이 메서드를 사용 하 여 중요 하다. 따라서, 정상 상태 형광 강도 시간이 지남에 따라 측정 됩니다. FLIM 접근 증가 배경 형광을 제거 하 여 이미지 대비. 이것은 기존의 수락자 표백 무서 워 비교 마세요 FLIM 측정의 이점이 다입니다. 형광 수명 측정 FLIM 붙일 태그가 단백질의 분수에 대 한 정보를 제공 하 고 어떻게 heterogenic 프로브를 보여 환경 조건 때문. FLIM은 또한 최고 그리고 생활에 있는 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 무서 워를 수행에 가장 신뢰할 수 있는 생물 접근 세포32,33.
모든 설명된 방법을 특히 radiotherapeutic 접근에 대 한 중요 한 인간 세포에 있는 DNA 손상 응답의 새로운 메커니즘을 가능성이 있다 함께 찍은. 예를 들어 multiphoton FLIM multiphoton 단층 촬영34이라고 어디 의학, 고해상도 이미지를 적용 되었습니다. 이 매우 정교한 현미경 방법 조직화 학적인 샘플을 사용 하 여 암 진단에 대 한 클리닉에 적용 하 고 높은 해상도 분석 수 있습니다. FLIM 방법 또한 그들의 autofluorescence에 따라 종양 세포 표면에 대 한 정확한 분석을 제공할 수 있습니다. FLIM 무서 워 방법의 1 개의 불리는 매우 정교한 소프트웨어 배경, 현미경 연산자에 의해 완전히 이해 해야 합니다. 더 FLIM 데이터의 생물학 관련성 일반적 및 DNA 복구 프로세스에서 것입니다 확실히 밝혀 지 게 가까운 장래에.
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Disclosures
저자 아무 충돌 다는 것을 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품의 체코 공화국, 프로젝트 P302-12-G157 부여 기관에 의해 지원 되었다. 실험 또한 체코 노르웨이어 연구 프로그램 CZ09, 노르웨이 자금, 그리고 교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국에 의해 감독에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 7F14369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin - EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
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