Summary
激光 microirradiation 是研究活体细胞 DNA 修复的有效工具。一个方法的方法, 使用 UVA 激光诱导各种 DNA 病变显示。我们对维持正常细胞周期的局部 microirradiation 的方法进行了优化;因此, 辐照细胞通过有丝分裂进行。
Abstract
地方 microirradiation 与激光代表了一个有用的工具研究 DNA 修复相关的过程中活细胞。在这里, 我们描述了一种方法来分析蛋白质动力学在 DNA 损伤的时间或蛋白质-蛋白质相互作用的局部 microirradiated 染色质。我们还展示了如何识别细胞周期的各个阶段, 使用 Fucci 细胞系统来研究 DNA 损伤时细胞周期依赖性的蛋白质动力学。本文还介绍了使用两种紫外线激光器 (355 nm 和 405 nm) 诱导不同类型 DNA 损伤的方法。只有405纳米二极管激光器 microirradiated 的细胞进行正常的有丝分裂, 没有丁烷嘧啶聚。我们还展示了如何 microirradiated 细胞可以固定在一个特定的时间点来执行免疫内源性蛋白质的利益。对于 dna 修复研究, 我们另外描述了生物物理方法的使用, 包括 FRAP (漂白后的荧光恢复) 和电影 (荧光寿命成像显微镜) 的细胞自发发生的 dna 损伤灶。我们还展示了电影 (荧光共振能量转移) 在蛋白质-蛋白质相互作用实验研究中的应用。
Introduction
dna 损伤导致 dna 病变的出现, 包括丁烷嘧啶聚 (方案), 8-氧-78-氢-2 "-脱氧, 和单或双打破1,2。γ射线是以最高的能量和高显的电离辐射的形式, 因而辐射的来源在放射疗法被广泛使用3。另一方面, 实验性的紫外线激光引起的 DNA 损伤模仿自然暴露于紫外线。UVA microirradiation, 作为一种显微方法, 代表了一个实验工具, 研究 DNA 损伤的个体活细胞。Microirradiation 40 年前第一次使用, 以揭示染色体区域的组织4,5。该技术高度依赖于共焦显微镜的功能特性或现代 nanoscopy 的技术极限。为了诱导 DNA 损伤, 细胞可以 presensitized 5 的尿 (BrdU) 或赫斯特33342之前, 紫外线照射。Bártová et al.6以前描述了 presensitization 步骤, 最近我们优化了这种 microirradiation 技术, 以避免细胞死亡或凋亡。例如, 使用 405 nm 的 UV 激光器 (不含赫斯特 33342 presensitization) 会导致53BP1 阳性双断裂 (DSBs), 其代价是丁烷嘧啶聚。另一方面, presensitization 步骤与 UV microirradiation 相结合, 会导致高水平的方案和 DSBs 同时7,8。这种方法很难应用于单 DNA 修复通路的研究。
有了 microirradiation, 就有可能分析蛋白质的招募, 动力学, 和相互作用的 DNA 损伤活细胞。Luijsterburg et al.发布了此方法的一个示例9用于异蛋白 1β, 我们最近首次显示多因子 Oct4 和与卡哈尔体 coilin 相关的蛋白质, 被吸收到紫外线诱导的 DNA 损伤6,10。蛋白质动力学在这些脱氧核糖核酸损伤也可以研究使用 FRAP (荧光恢复在漂白以后)11,12,13或烦恼 (荧光共振能量转移) 技术14 ,15。这些方法有可能揭示蛋白质在 DNA 损伤或蛋白质-蛋白质相互作用中的简单扩散。一个有用的工具, 额外的表征蛋白质是电影 (荧光寿命成像显微镜) 或它的组合与烦恼技术 (烦恼-电影)16。这些方法能够研究在稳定或瞬时表达荧光分子标记的蛋白质的活细胞中的过程17。这里, 一个指数衰减时间 (τ) 的例子, GFP 标记的 p53 蛋白及其相互作用的伙伴, mCherry 标记 53BP1, 发挥重要作用的 DNA 损伤的响应18,19显示。参数τ, 电影计算提供的荧光的寿命, 是特定的荧光染料, 其结合能力, 及其细胞环境。因此, 这种方法可以显示我们之间的蛋白质亚群之间的区别, 他们的结合能力, 和他们的功能性质后, 例如, DNA 损伤。
这里, 在我们的实验室中使用的先进的显微技术的方法学方法的概要研究在 microirradiated 染色质部位的具体的蛋白质的招募、动力学、扩散和蛋白质-蛋白质相互作用提出。本发明提供了在活细胞中诱导局部 dna 损伤的 step-by 步骤方法, 并介绍了用于研究紫外线激光引起的局部 dna 损伤相关事件的方法。
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Protocol
1. 细胞系的培养
- hela 细胞系
注: 使用宫颈癌细胞: 用 GFP 或 hela-Fucci 细胞表达 RFP-Cdt1 的 hela 细胞稳定表达组蛋白 H2B在 G1 和早期的 S 阶段和 GFP-geminin 在 S/G2-M 阶段 ( 图 1 )。- 为培养所有 HeLa 细胞系, 使用 Dulbecco 和 #39; s 修饰的鹰和 #39 培养基 (DMEM), 在37和 #176 上补充10% 胎牛血清和适当的抗生素; C 在含 5% CO 2 的湿化气氛中。更换中等 2-3 次, 每星期.
- 删除培养基, 用1x 和 #160 冲洗细胞;P bs 以消除含有胰蛋白酶抑制剂的血清的所有痕迹。在室温下执行这一步骤在生化罩.
- 添加1毫升的 prewarmed 胰蛋白酶-EDTA 溶液, 以覆盖细胞层, 并保持细胞在37和 #176; c. 处理细胞直到细胞层被分散 (通常是 3-5 min).
- 添加3毫升的 prewarmed 完全生长培养基, 使胰蛋白酶-EDTA 钝化, 并通过轻轻移多次分散培养基.
注意: 此程序必须在生物危害罩中进行, 以保护操作员免受污染物的污染, 并保持最佳的细胞培养条件. - 使用自动单元格计数器或 B 和 #252 计数单元格, rker 室。稀释细胞悬浮到1和 #215; 10 5 细胞/毫升和吸管5毫升到一个新的菜。孵育细胞在37和 #176; C 和 5% CO 2 .
- 培养小鼠胚胎干细胞 (mESCs)、D3 细胞系
- 培养 mESCs 在细胞培养皿上涂上0.2% 明胶和制维护培养基。孵育细胞在37和 #176; C 和 5% CO 2 .
注: 在50毫升等分中准备 mESCs 培养/维护培养基, 并将其储存在 2-8 和 #176; 建议使用 C 最多2周。制培养基含有75毫升 ES 细胞 FBS, 5 毫升青霉素 G 和链霉素, 5 毫升非必需氨基酸 (10 毫米) (最终浓度0.1 毫米), 50 和 #181; 小鼠白血病抑制剂因子 (mLIF; 100 和 #181; G/毫升) (最终浓度 10 ng/毫升), 430 和 #181; l MTG (1-Thioglycerol;1:100 稀释在 DMEM) (最终浓度100和 #181; M) 和高糖 DMEM 培养基高达500毫升. - 从培养皿中吸取制培养培养基, 用1x 和 #160 冲洗细胞一次;P bs.
- 添加0.5 毫升胰蛋白酶-EDTA, 孵育在37和 #176; C 直到细胞开始分离的菜。然后, 用2毫升的制培养培养基补充15% 胎牛血清对胰蛋白酶进行灭活.
- 使用吸管将剩余的细胞从培养皿中取出.
注意: 获得单细胞是很重要的, 因为细胞团簇促进细胞分化. - 使用制维护介质将单元格1:10 分到糊盘上.
注意: 如果制细胞的密度太低, 它们生长不好;如果密度过高, 则促进分化. - 确保 mESCs 保持在一个未分化的状态, 通过每隔一天通过将细胞从一个培养皿中分裂成四个新的盘子来执行制通道。在100X 和 #160 下用倒置显微镜检查制菌落; 或200X 和 #160; 放大倍数; 如果有自发和 #160 的证据; mES 细胞分化, 执行西方杂交来评估 Oct4 蛋白的耗竭.
注: 与最佳细胞传代, 自发分化的 mESCs 在体外 可以减少.
- 培养 mESCs 在细胞培养皿上涂上0.2% 明胶和制维护培养基。孵育细胞在37和 #176; C 和 5% CO 2 .
2。细胞转染
- 种子细胞48小时前的实验格显微镜碟 (直径35毫米), 以找到 microirradiated 细胞根据其在培养皿上的坐标.
注意: 这是一个例子, 其中 microirradiation 是第一个实验步骤, 而免疫是第二步 ( 图 2A )。- 用于播种, 使用5和 #215 的浓度; 10 4 单元格/ml, 用于 HeLa 源细胞系 (或1和 #215; 10 4 单元/ml D3 mES 单元)。每道菜使用多达2毫升的完全培养基。在种植和 microirradiation, 保持细胞在恒温器或培养室在37和 #176; C 和 5% CO 2 .
- 使用自动单元计数器计数单元格.
注意: 不要使用更高浓度的细胞。特别是在 D3 mESCs 的密集的殖民地的情况下, 高细胞密度防止地方 microirradiated 细胞的识别在免疫以后.
- 制备质粒 DNA 和转染试剂的选择如下。使用 2-3 和 #181 准备 解决方案 A ; 选择的质粒 DNA g (参见 材料表 以了解详细信息) 和150和 #181; 1x 和 #160;P bs使用3.5 和 #181 准备 解决方案 B ; 在150和 #181 中转染试剂; l 1 和 #215; PBS。确保每个解决方案都经过仔细的移.
注: DNA 和转染试剂的最佳配比必须根据每个细胞系和单个质粒进行经验测定. - 在24小时前对瞬时转染活细胞进行实验观察, 并将溶液 a 与溶液 B 结合, 无涡流。在室温下孵育 15-20 分钟的组合溶液。以滴的方式, 均匀地分散这种完全转染混合物 (300 和 #181; 如点2.2 所述) 在显微镜皿中生长的细胞层.
- 37 和 #176 孵育细胞; C 和 5% CO 2 4-6 h, 然后用新鲜培养基取代转染混合物。在标准条件下培养细胞.
注: 当使用 405 nm 激光器时, 不要用任何试剂 presensitize 电池, 但使用 355 nm 激光器时, 用10和 #181 进行细胞 presensitization; M 5-溴-2 和 #39;-脱氧-苷 (BrdU) 7 , 8.Presensitization 时间取决于细胞类型和细胞周期的长短。对于 HeLa 细胞, 在局部 microirradiation 之前添加 BrdU 16 到20小时。在 mESCs 的情况下, 在 microirradiation 之前添加 BrdU 6 到8小时.
3。局部 DNA 损伤的诱导与共聚焦显微镜
- 将碟放在显微镜台上, 并记录选定的细胞在盘子上的位置; 需要进一步分析的单元坐标 ( 图2A a-c ).
- 在标有数字或字母的正方形中查找转染的单元格 ( 图 2A d-f , Ad 中的箭头显示在面板 Ae 和 Af 中放大的单元格的位置。使用明亮的现场显微镜获取细胞的图像, 并获取一个荧光图像, 以确定两个单元格 (s) 和标记的正方形 ( 图 2A ) 的位置.
- 在辐照前进行图像采集时, 使用与共焦显微镜连接的白光激光器 (470-670 nm) (1 nm) (或另一种可用的激光器连接至ocal 显微镜).
- 使用以下设置: 512 和 #215; 512 像素分辨率, 像素大小 64 nm, 400 Hz, 双向模式 (扫描两个方向), 线平均设置为 8, 缩放8x 到 12x.
注意: 线平均值表示给定数量的扫描;在继续下一行之前, 将扫描同一行多次。对所有线条的重复扫描会生成图像的最终帧. - 用于图像观察和获取, 使用63和 #215; 数值孔径为1.4 的油目标, 并依次获取荧光图像。通过使用相应软件的顺序扫描模式, 消除两个荧光之间的相声.
注: 所有显微镜软件都可以设置 so-called 顺序扫描模式。操作员可以选择是否获取荧光和 #39; 信息同时 ( 例如 , 在红绿蓝荧光) 或, 如这里所述, 单独 (顺序地), 荧光由荧光。考虑到对 GFP 的最大激发/发射为 395/509 nm 的一般信息, mCherry 的最大激发/发射为 587/610 nm (请参见在 图 2B 中使用的荧光)。根据这一信息, 选择合适的励磁和发射过滤器为理想的荧光。每个共焦显微镜必须优化过滤器选择和扫描程序. - 用于诱导 DNA 损伤, 使用64线扫描模式, 关闭电源 (in 和 #39; 获取和 #39; 模式), 打开外部 uv 光源 (在和 #34; uv 激光和 #34; 按钮), 设置感兴趣的区域 (ROI) (在和 #39; 收购和 #39; 模式), 并设置 355 nm激光到100% 功率或, 或者, 使用 405 nm 激光源.
注: 一般情况下, 激光功率由适当的激光调整按钮在图像采集模式下调整. - 对于本地 microirradiation, 使用在近 UVA 频谱中发射的激光器。对于 microirradiation 的 roi 和捕获图像, 在图像采集模式下设置背景为零, 以调节激光强度以外的 roi;如果细胞辐射正确, GFP-组蛋白 H2B 的信号将消失, 例如, mCherry 标记的 PCNA 蛋白将被招募到 DNA 损伤后立即照射 ( 图 2B 和 视频1).
注: 一个共焦部分的 ROI 引起的 DNA 损伤也出现在三维 (3D) 投影中 (参见 图 2C 和 视频 2 中的3D 旋转和 x-y、x-z、y z 投影)。有关 355 nm 和 405 nm 激光器的完整技术参数的说明, 请参阅 Stixov 和 #225; et al. 7 - 在 roi 被辐照后, 关闭外部 UV 源, 关闭 roi, 切换电源, 将线路扫描更改为 8, 并找到另一个用于照射的单元格。对于 ROI 选择, 请在软件和 #39 的图像获取模式中使用相应的按钮.
注: mCherry-PCNA 在 DNA 损伤的最大积累峰值在2和 20 min 之间 ( 图 2B )。为了验证外源蛋白水平的结果, 在局部 microirradiation 后立即进行免疫荧光染色。根据兴趣选择辐照时间间隔. - 验证在大多数 microirradiated 细胞中可以检测到外源蛋白的积累。对于此验证, 请使用以下步骤中的条件。
- 检查在瞬时转染的细胞中没有外源蛋白的过度表达。作为一种可能的解决方案, 选择只有微弱的荧光蛋白表达的细胞 ( 例如 , mCherry-PCNA 或 mCherry-53BP1).
- 评估用于图像采集的光的曝光率.
注: 对于光测试, 将转染的细胞暴露在长时间的激光 microirradiation 上, 并验证细胞进行有丝分裂, 如 图 3A -b 所示。作为一种可能的解决方案, 减少每个单元的扫描时间和共焦切片数, 通过选择最佳的轴向步长 (0.3 和 #181; 推荐 m) 优化3D 扫描, 并将激光和 #39 的功率降到最低。另外, 光可以消除使用 Trolox (6-羟基-25, 78-tetramethylchroman-2-羧酸, 水溶性模拟维生素 E) 溶解在培养培养基。对于 DNA 损伤相关的实验, 由于其对紫外线辐射的保护作用, 不推荐使用 Trolox. - 在使用 355 nm 激光照射的情况下, 通过 BrdU 结合套件中的适当 BrdU 检测抗体验证是否有足够的 BrdU 合并 (请参阅 材料表 )。由于 BrdU 在细胞周期的 s 阶段中被纳入 DNA 中, 大多数细胞必须在 presensitization 期间通过 s 阶段进行。作为一种可能的解决方案, 请考虑单元格类型特定的细胞周期长度.
- 分析是否有兴趣的 dna 修复蛋白能够识别特定细胞周期阶段的 dna 损伤。 可能的解决方案: 为了验证选择的蛋白质的招募被限制在特定的细胞周期阶段 (G1/S/G2), 使用 HeLa-Fucci 细胞。这些细胞表达 RFP-Cdt1 在 G1 和早期 S 阶段和 GFP 标记 geminin 在 S/G2-M 细胞周期阶段 22 ( 图 1 ).
- 为了避免凋亡、细胞死亡, 选择合适的激光源和激光电源设置 23 。请记住, 照射的细胞应该进行有丝分裂 ( 图 3A -b, 视频 3 )。 注意 : 不需要的细胞凋亡可以通过蛋白 V 阳性、酶 3 或 lamin B 检测。在形态学上, 细胞剥离和凋亡体的形成将是可见的.
4。免疫荧光染色
- 用1和 #215 冲洗细胞层 (在显微镜下生长); PBS 和漂洗后, 用4% 甲醛10分钟固定细胞 (用于 HeLa 细胞系) 或室温下20分钟 (用于 D3 ES 细胞)。用1和 #215 冲洗盘子; PBS.
警告: 甲醛引起严重的眼部损伤, 可能引起过敏性皮肤反应, 也是一种潜在的致癌物;因此, 所有的实验步骤与甲醛应执行的提取引擎罩.
注意: 为了避免不必要的荧光信号漂白, 在需要进行免疫荧光染色的潜伏期内, 将碟储存在暗室中. - Permeabilize 细胞与 0.1% X-100 溶解在 H 2 O 为8分钟, 然后孵化细胞为 12 min 与1和 #215; PBS 包含0.1% 皂甙和0.1% 海卫 X-100。孵育后, 在1和 #215 清洗细胞; PBS 两次, 15 min.
- 在1和 #215 中孵育 1% BSA 的细胞; PBS 为60分钟, 以阻止选定抗体的不结合。1和 #215 清洗细胞; PBS 15 分钟后孵化.
- 以 1:100 (或 1:200) 的比例稀释主抗体 (此步骤必须为 optimized 1% BSA 中的单个抗体) 在1和 #215; PBS, 使用25和 #181; L 此解决方案每道菜, 并覆盖细胞与片。在4和 #176 中, 在一夜间在湿润腔中孵育含有主抗体的溶液的细胞; C.
- 在第二天, 在1和 #215 中清洗单元格; PBS 两次, 5 分钟.
- 在1和 #215 中, 在 1% BSA 中以 1:100 (或 1:200) 的比例稀释第二抗体; PBS, 使用100和 #181; 每道菜的 L, 用片覆盖细胞。用含有第二抗体的溶液孵育细胞60分钟。孵育后, 在1和 #215 清洗细胞; PBS 三次, 5 min.
- 用一滴安装介质安装片, 用指甲油或胶水密封片, 以防止在显微镜观察过程中干燥和移动。在4和 #176 的黑暗中储存盘子; C.
5。荧光寿命图像 (电影) 显微镜
- 启动电影软件。打开和 #34; 软件的应用程序套件和 #34; 将其切换到 #34; 电影和 #34; 模式。确保在脉冲模式下运行.
注意: 操作员必须切换硬件按钮以达到脉冲模式. - 将含有染色细胞 (4 节染色的) 的碟放在显微镜舞台上与局部 microirradiation 相同的方向, 并根据培养皿上的网格找到照射的细胞。通过共焦显微镜进行图像采集.
注意: 使用以下设置: 1024 和 #215; 1024 像素, 400 Hz, 双向模式, 16 线, 缩放8x 到 12x. - 在开始电影测量之前, 执行初步测试以显示 real-time 的指数衰减记录, 方法是单击并 #34; 设置电影和 #34; #34; 购置和 #34; 压 #34; 运行电影测试和 #34;通过对以下两个主要参数进行评估, 优化了样品的电影参数。
- 通过调整到样本的生存期的激发波长来优化环路的重复率 (请参见下面的说明)。在共焦显微镜软件中, 用适当的按钮调节激光强度, 一般称为 #34; 激光调节设置和 #34; #39; 图像采集和 #39; 菜单。然后, 使用电影软件计算衰变曲线 (或显示所有光子计数的直方图) (请参见 图 4A -b )。 注: 使用脉冲模式的励磁。该软件必须配备一个脉冲拾取器的环路, 这允许选择的重复率 (80, 40, 20, 或10兆赫)。激发波长在荧光施主的情况下, GFP, 是488毫微米。衰减曲线使用电影软件工作区记录。参数 (和 #964; D , 和 #964; DA ) 显示指数衰减时间 ( 如 , 荧光寿命);参数 (A) 表示荧光衰变的振幅 (参见 图 4A -b 中的 GFP 标记 p53 和 mCherry 标记的53BP1 的电影数据的示例.
- 使用软件获取工具检查计数重复率 (选择重复率模式)。选择样本中最亮的像素;最亮像素的曲线必须低于总荧光强度的 10%.
- 单击和 #34; 测量和 #34; 按下 #34; 运行电影和 #34;.
6. 使用电影脚本和烦恼效率计算的供体寿命
- 启动电影软件并打开和 #39;D onor 和 #39; 工作区.
- 选择 #34; 分析和 #34;/和 #34; 图像处理和 #34; 菜单中的选项卡, 然后通过单击和 #34 启动电影脚本; 开始和 #34;。对于最佳的烦恼-电影设置, 使用已知的相互作用的蛋白质伙伴.
注意: GFP-p53 和 mCherry-53BP1 的著名交互合作伙伴的电影效率是 (34.1 和 #177; 2.3)% ( 图 4C ). - 仅使用捐助者发射通道 (通道1或 2), 然后按和 #34; 计算快速电影和 #34;.
注意: 图像和图形都将被更新. - 在电影软件中, 在软件中手动设置强度刻度 (0-4000 计数) 和寿命刻度 (0-5 ns)。通过这种方法, 可视化感兴趣的细胞, 并设置电影测量.
注: 此设置消除了细胞中单个细胞间荧光强度的差异. - 在衰变形式中, 选择管接头模型.
注: 我们推荐 n-指数 reconvolution 和模型参数和 #34 的选择; n 和 #34;最优拟合有以下条件: 拟合曲线覆盖衰变曲线以及与 #967; 2 值等于 1 ( 图 4B ). - 选择 #34; 阈值和 #34;/和 #34; 使用阈值和 #34; 并将阈值设置为75。开始和 #34; 初始拟合和 #34;.
注: SPT64 软件计算的平均捐赠寿命在没有烦恼 (和 #34; 振幅加权平均寿命和 #34;, #964; Av. Amp )
7。使用电影烦恼的脚本
- 选择捐赠者/受体工作区, 然后打开和 #34; 分析和 #34; #34; 成像和 #34; #34; 终身烦恼图像和 #34;...
- 仅选择作为活动通道的施主, 并根据光子数/像素调整像素分。然后, 运行称为和 #34 的软件模式; 计算 FastFLIM 和 #34;。如果图像中的光子数/像素较低, 则将像素分增加到4点.
- 将强度设置为 0-200 计数, 将生存期设为 0-5 ns.
- 激活和 #34; 使用阈值和 #34; 输入阈值 75.
- 将管接头模型设置为和 #34; 供方和 #34; 输入模型参数和 #34; n 和 #34; 输入和 #964; Av. Amp (步骤 6.6) 作为和 #964; D , 激活和 #34; 初始拟合和 #34;. 通过删除标记,
- 将参数 Bkgr 12月 、Shift Bkgr 和 公路联合会 设置为常量值.
注意: 将大多数参数设置为尽可能保持恒定。这种方法减少了统计波动。在这种情况下, 不要按和 #34; 初始拟合和 #34; 再次。被提及的参量的描述跟随: 公路联合会 = 仪器响应函数, BkgrDec = 背景从指数契合, ShiftIRF = 从指数 reconvolution 适合的, BkgrIRF = 公路联合会背景从指数 reconvolution 适合。所有三参数都是计算出来的, 可以使用该软件进行修正以进行进一步的分析. - 按 #34; 计算烦恼和 #34; 电影图像区域绘制的烦恼图像和烦恼效率直方图, 绘制了一个烦恼距离直方图 ( 图 4C )。当图像分析完成后, 按下 #34; 保存结果和 #34;.
注意: 在烦躁实验中, 有必要考虑荧光蛋白在荧光 (明亮) 和荧光 (暗) 态之间呈现可逆的转变。这个特性被称为和 #34; 闪烁和 #34; 和烦恼效率受此现象的影响 (Vogerl et al. 提供了此效果的解释 24 ).
8。FRAP 分析
- 放置 dish 在显微镜阶段, 发现转染的细胞表达荧光标记蛋白的兴趣, 并执行图像采集使用明亮的现场显微镜与标准显微镜灯 (见 图 2Aa -b) 和荧光显微镜模式。
- 对于图像获取, 请使用连接到共焦显微镜的白光激光器 (或选择的激光, 根据选定的荧光)。使用以下设置: 512 和 #215; 512 像素, 1000 Hz, 双向模式, 线平均 1, 缩放8x 到 12x.
- 获取至少 15 prebleaching 图像 (10% 激光功率), 并在图像获取菜单中定义感兴趣区域 (ROI).
- 用于漂白实验, 请使用氩激光 (488 nm)。应用以下设置: 帧分辨率512和 #215; 512 像素, 1000 Hz, 双向模式, 缩放8x 到 10x.
注: 荧光包括 GFP, mCherry, 和 RFP 可以兴奋的氩激光工作在 488 nm 或 514 nm. - 使用 FRAP 软件模式的显微镜选择。在漂白中, 使用激光调节按钮将氩激光和 #39 的功率设置为最大。0.256 秒和 #160 进行图像采集; 间隔10% 激光功率.
注: 对于 postbleaching 步骤, 采用标准的图像采集模式选择共焦显微镜。- 监视漂白后的荧光恢复时间 (漂白过程后可达45-50 秒).
注意: 如 图 4D 所示, 漂白 mCherry 标记的53BP1 在自发 DNA 损伤和 UVA 辐照诱导的病灶中的恢复时间是不同的。在自发发生的 DNA 修复灶中, mCherry-53BP1 在 UVA 病灶中迅速恢复, 与 mCherry-53BP1 积累比较;请参见 图 4D 和 Foltankova et al. 25
- 监视漂白后的荧光恢复时间 (漂白过程后可达45-50 秒).
- 将数据从显微镜软件 (或选择的软件) 导出到电子表格并进行统计分析.
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Representative Results
使用先进的共焦显微镜, 我们观察到 mCherry 标记的53BP1 和 mCherry PCNA 蛋白在 DNA 损伤的积累。对活细胞的局部 microirradiation 进行分析。为了识别 DNA 修复相关蛋白在单个细胞周期阶段的核分布模式, 我们使用了 Fucci 细胞系统, 通过它可以确定细胞周期的 G1、早期 S 和 G2 阶段 (图 1)。我们在 Suchankova et al.中发表的 Fucci 细胞模型的生物学应用26显示53BP1 在细胞周期的 G1、S 和 G2 阶段被招募到局部诱导的 DNA 损伤, 这与同源端连接 (NHEJ) 中的这一蛋白的功能有关, 这是导致双断裂修理。另一方面, 这个实验系统向我们表明, PCNA 蛋白, 这是链接到同源重组修复通路 (HRR), 承认 DSBs 在后期 S 和 G2 阶段的细胞周期27。对于 DNA 修复机械的研究, 我们还优化了辐照条件, 以确保细胞培养在接触紫外线激光后继续进行有丝分裂 (图 3)。Microirradiated 细胞有丝分裂证明, 在这些实验条件下, DNA 修复在相对生理的方式下进行, 而细胞没有受到激光的伤害, 这在更高的强度诱导凋亡。在这里, 我们还展示了如何将电影分析应用于 DNA 修复蛋白的表征。这种先进的技术使我们能够研究细胞细胞核中的局部蛋白-蛋白质相互作用, 或者在核仁区域, 如核仁、细胞核板或异簇的蛋白质相互作用。对于初学者在这项技术, 我们想建议优化这种烦恼-电影技术, 使用已知的相互作用的蛋白质合作伙伴, 如 p53 和 53BP1 (图 4A-C)。一般来说, 蛋白质-蛋白质相互作用的知识导致理解蛋白质复合体如何调节诸如复制、基因活化、沉默或 DNA 修复等过程。此外, 研究蛋白质动力学的一个非常有用的工具是 FRAP 方法, 它显示了地方蛋白质扩散和流动性的特征 (图 4D)。在这里, 我们提供了在 DNA 修复研究中应用先进的共焦显微镜技术的方法学指导。
图 1: 在细胞周期的 S/G2 阶段, 可以研究在 G1/early S 相和 GFP-geminin (绿色) 中表达 RFP-cdt1 (红色) 的 HeLa-Fucci 细胞中 DNA 修复病灶的形成.自发发生的 DNA 损伤阳性的53BP1 蛋白 (蓝色;Alexa 405 染色), 研究了 G1 (红色), 早 S (橙色; 表达 RFP-cdt1 和 GFP-geminin), 和 G2 (绿色) 的细胞周期的阶段。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 随着时间的推移, 在 DNA 损伤中招募 mCherry 标记的 PCNA。(a)表达 mCherry-PCNA (red) 的细胞位于选定区域 (灰色) 的格显微镜盘上。在固定和免疫后, 照射的细胞 (黄色箭头) 根据登记的坐标 (见灰色字母 K 为例) (Aa-c) 进行定位。黄色的框架和箭头 (Ad) 显示的细胞是 microirradiated 和放大的面板 Ae f。(B)在稳定表达 GFP 标记的组蛋白 H2B (green) 的 HeLa 细胞中研究了 mCherry-PCNA (red) 的积累。在本地 microirradiation 后立即监视单元格最多35分钟 (请参见视频 1)。(C) Microirradiated 细胞通过3D 共聚焦显微镜进行分析, 在所有三维度 (x-y、 x-z、和y z) 中发现了 DNA 损伤 (例如、mCherry-53BP1) 的蛋白质积累, 尽管仅细胞核的中段为 microirradiated (在图 2C中的视频 2 3D 投影中, 参见 3 d-细胞旋转)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 由 405 nm 激光二极管 microirradiated 的电池通常通过电池周期进行.(A)在使用 405 nm 二极管激光照射后, HeLa 细胞 (稳定表达 GFP-组蛋白 H2B; 绿色) 进行有丝分裂 (另请参阅视频 2)。黄色箭头和框架表示所选单元中的辐射 ROI。白框显示有丝分裂。(B)在相同的实验条件下, 在稳定表达 GFP-H2B (绿色) 和瞬时表达 mCherry-PCNA (red) 的 HeLa 细胞中, 也观察到照射细胞的有丝分裂。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 电影和烦恼-电影分析 GFP-p53 和 mCherry-53BP1.荧光共振能量转移 (苦恼) 的电影检测和应用荧光恢复后, 漂白(FRAP) 在不同的 DNA 病变. (A-c)平均 (n=10) 寿命的 GFP 标记 p53 在缺席和存在的受体 (mCherry-53BP1), 测量整个当时 HeLa 细胞核。(A) 在 HeLa 细胞中研究的具有代表性的荧光衰减曲线和残差瞬时表达 GFP-p53 (仅供者, τD) 或 GFP-p53 和 mCherry-53BP1 (施主-受体, τDA).(B) 平均寿命 (τ1 -τ3) 和振幅 (a) GFP-p53 和 (B) mCherry-53BP1 在整个 HeLa 细胞核内测量的 (1 -3)。χ2值也进行了计算并显示。(C) 对著名的交互合作伙伴 GFP-p53 和 mCherry-53BP1 的焦虑效率的总结。缩放条形图 = 4-5 µm. 电影结果显示〜35% 烦恼效率已知的互动合作伙伴 GFP 标签 p53 和 mCherry 标签53BP1。(D)在自发发生的 dna 损伤 (绿色曲线) 和 UVA 诱导的 dna 损伤 (蓝色曲线) 的 mCherry-53BP1 的恢复动力学研究。mCherry 在 DNA 损伤时被漂白到背景的水平 (mCherry-53BP1 蛋白质的分散形式), 并且从每个值中减去背景荧光。d本文以 mCherry-53BP1 的相对荧光强度为指标, 提出了一种标准误差。学生的 t 检验显示两种类型的 DNA 病变之间有统计学意义的差异 (* 显示 p ≤0.05)。请单击此处查看此图的较大版本.
视频 1: 招募 mCherry 标记的 PCNA 蛋白 (红色荧光) 到局部 microirradiation 诱导的 HeLa 细胞 DNA 损伤, 稳定表达 GFP 标记的组蛋白 H2B (绿色荧光).请单击此处下载此视频.
视频 2: mCherry 标记的53BP1 蛋白 (红色荧光) 在 HeLa 细胞局部 microirradiation 诱导的 DNA 损伤中的积累.细胞核在3D 空间中显示, 使用一种软件模式, 使空间中的细胞旋转可视化。请单击此处下载此视频.
视频 3: Microirradiated HeLa 细胞稳定表达 GFP 标记的组蛋白 H2B (绿色荧光) 进行有丝分裂.辐照区的特征是 GFP-H2B 的损耗 (黑色区域是细胞核内的辐射带)。请单击此处下载此视频.
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Discussion
显微镜技术代表了研究实验室的基本工具。在这里, 简要介绍了用于研究蛋白质的招募和动力学在 DNA 损伤的方法。我们特别注意到我们的实验经验, 在当地 microirradiation 的活细胞, 我们讨论的蛋白质动力学的 FRAP 和蛋白质相互作用的 DNA 病变受体漂白烦恼28及其高级修改烦恼-电影 (图 4A-d)。这里所示的方法是真正了解 DNA 修复过程的基本工具, 特别是活细胞系统中的蛋白质动力学, 如由高级共焦显微镜6、7、8检查, 28。这些方法在处理放疗对组织的影响或表征肿瘤细胞形态学方面对未来医学具有巨大的实用价值。为了优化此方法, 我们建议从已知的相互作用的蛋白质伙伴开始, 如图 4C所示。
众所周知, DNA 损伤的蛋白质招募具有高度的动态性和时间依赖性;因此, 在细胞照射后应用时移共焦显微镜不仅在基础科学领域, 而且在诊所26中都是必需的。局部诱导的 DNA 损伤由于激光 microirradiation9,28,29表示基因组区域, 在那里可以研究蛋白质的招募, 蛋白质蛋白, 或蛋白质-dna 结合和相互.这些方法的出发点是, 外源性蛋白的招募必须通过内源水平的适当抗体来验证。其次, 这些实验的关键步骤是 over-transfected 细胞可以提供假阳性结果;因此, 最好的决定是建立细胞系稳定表达的荧光标记蛋白的兴趣。此外, 由于用于图像采集的激光器的光效应, 必须对扫描条件进行优化, 或在细胞培养培养基中溶解 Trolox 化合物。另外去除 presensitization 步在辐照之前推荐。在局部 microirradiation 后, DNA 修复必须进行, 使细胞经历有丝分裂(图 3AB和视频 3)。从优化 DNA 修复的角度来看, 诱导细胞凋亡是一个不太有价值的过程23。也很明显, 一些 dna 修复蛋白只在特定的细胞周期阶段 (例如, Bártová et al.中识别 dna 损伤。30). 因此, 使用 HeLa-Fucci 细胞系统, 显示细胞在各个阶段的界面, 是一个有用的工具, 研究 DNA 损伤的反应。此外, 细胞周期阶段可以根据细胞核分布模式识别 PCNA 蛋白31。
众所周知, FRAP 和烦恼的方法是非常有用的工具, 以调查蛋白质的特征被招募到 DNA 损害7,8,32。此外, 电影技术32可以揭示在 DNA 损伤中积累的蛋白质的动态构象变化的信息。这种方法的使用是重要的, 因为电影测量动态细胞过程直接;因此, 稳态荧光强度是随着时间的推移而测量的。电影方法通过消除背景荧光来提高图像对比度。这是比较传统的受体漂白的烦恼电影测量的优点。电影测量的荧光寿命提供了有关荧光标记蛋白的分数的信息, 并显示了异探针是如何由于环境条件而进行的。电影也是最好的和最可靠的生物物理方法来为活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用而苦恼32,33。
在一起, 所有被描述的方法有潜力显露新的机制脱氧核糖核酸损伤反应在人的细胞, 是重要的特别对放射方法。例如, 多电影已应用于获取医学中的高分辨率图像, 它被称为多层析成像34。这种高度精密的显微方法可以应用于肿瘤诊断的临床, 并采用组织化学分析的方式进行高分辨率的检测。电影方法可以根据自身的荧光特性, 对肿瘤细胞表面提供精确的分析。电影方法的一个缺点是它的高度复杂的软件背景, 必须由显微镜操作员充分地了解。电影数据的进一步生物学相关性, 一般和 DNA 修复过程, 一定会在不久的将来显露出来。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了捷克共和国的赠款机构 P302-12-G157 项目的支持。由挪威基金监督的捷克-挪威研究方案 CZ09 和捷克共和国教育、青年和体育部 (赠款号: 7F14369) 也支持实验。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin - EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
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