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Biochemistry

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/56004
Automatic Translation
1,4, 1,2, 1,3, 1,3, 1,2
1Epigenetics Institute, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Graduate Group in Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

हम आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन को पहचानने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और यूवी मध्यस्थता photocrosslinking और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों को मैप करते हैं ।

Abstract

कोडिंग RNAs जीन अभिव्यक्ति, क्रोमेटिन संरचना, और डीएनए की मरंमत को विनियमित सहित कई परमाणु प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । ज्यादातर मामलों में, RNAs कोडिंग की कार्रवाई प्रोटीन जिसका कार्य बारी में है द्वारा मध्यस्थता है RNAs के साथ इन बातचीत द्वारा विनियमित । इसी के अनुरूप, नाभिकीय कार्यों में शामिल प्रोटीन की बढ़ती संख्या को आरएनए से बाइंड करने की सूचना मिली है और कुछ मामलों में इन प्रोटीनों की आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों को अक्सर श्रमसाध्य, उंमीदवार-आधारित तरीकों के माध्यम से मैप किया गया है ।

यहां, हम आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन्स और उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों का उच्च-प्रवाह, proteome-विस्तारित निष्पक्ष पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं । पद्धति सेलुलर आरएनए में एक photoreactive uridine एनालॉग के शामिल होने पर निर्भर करता है, यूवी मध्यस्थता प्रोटीन-आरएनए crosslinking द्वारा पीछा किया, और crosslinked के भीतर आरएनए-proteome पेप्टाइड्स प्रकट करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण. यद्यपि हम माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया का वर्णन, प्रोटोकॉल आसानी से प्रसंस्कृत कोशिकाओं की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

Introduction

RBR-आईडी पद्धति का उद्देश्य उपन्यास आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन्स (RBPs) की पहचान करना और उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों (RBRs) को, आरएनए-बाइंडिंग म्यूटेंट के डिजाइन की सुविधा के लिए और जैविक और जैव रासायनिक की जांच करने के लिए, पेप्टाइड-स्तर के रिज़ॉल्यूशन के साथ मैप करना है । प्रोटीन-आरएनए बातचीत के कार्य.

आरएनए जैव अणुओं के बीच अद्वितीय है के रूप में यह दोनों एक आनुवंशिक जानकारी ले जाने के दूत के रूप में कार्य कर सकते हैं और भी जटिल तीन में गुना और अधिक प्रोटीन के उन लोगों के लिए सदृश रासायनिक कार्यों के साथ आयामी संरचनाओं1,2. सबूत के एक बढ़ती शरीर पता चलता है कि RNAs (ncRNAs) विभिंन जीन विनियामक और epigenetic रास्ते में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है3,4,5 और, आमतौर पर, इन विनियामक कार्य संगीत कार्यक्रम में मध्यस्थता कर रहे है एक दिया आरएनए के साथ विशेष रूप से बातचीत कि प्रोटीन के साथ. विशेष प्रासंगिकता के, प्रोटीन बातचीत का एक सेट हाल ही में तीव्रता से अध्ययन लंबे ncRNA (lncRNA) Xist के लिए पहचान की थी, कैसे इस lncRNA मध्यस्थता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने के एक्स गुणसूत्र महिला कोशिकाओं में निष्क्रियता6,7 ,8. विशेष रूप से, इन Xist के कई-इंटरैक्ट प्रोटीन किसी भी विहित आरएनए-बाइंडिंग डोमेन9को शामिल नहीं करते हैं, और इसलिए उनकी आरएनए-बाइंडिंग गतिविधि को केवल उनके प्राथमिक अनुक्रम के आधार पर silico में नहीं लगाया जा सकता । यह देखते हुए कि हजारों lncRNAs किसी भी सेल10में व्यक्त कर रहे हैं, यह मान लेना उचित है कि उनमें से कई के साथ बातचीत के माध्यम से कार्य हो सकता है अभी तक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (RBPs) की खोज की है । एक प्रयोगात्मक रणनीति इन उपंयास RBPs की पहचान करने के लिए इसलिए बहुत ncRNAs के जैविक समारोह विदारक के कार्य की सुविधा होगी ।

पिछले प्रयास RBPs empirically की पहचान करने के लिए polyA + आरएनए सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)11,12,13,14,15के लिए युग्मित चयन पर भरोसा किया है । हालांकि इन प्रयोगों ख्यात RBPs की सूची में कई प्रोटीन जोड़ा, डिजाइन द्वारा वे केवल polyadenylated टेप करने के लिए बाध्य प्रोटीन का पता लगा सकता है । हालांकि, सबसे छोटे RNAs और कई lncRNAs polyadenylated नहीं हैं । 16 , 17 और उनके बातचीत प्रोटीन की संभावना इन प्रयोगों में याद किया गया होगा । एक ताजा अध्ययन प्रोटीन interactome डेटाबेस के लिए सीखने की मशीन लागू प्रोटीन की पहचान करने के लिए कि सह कई ज्ञात RBPs के साथ शुद्ध और पता चला कि इन आवर्तक RBP भागीदारों और आरएनए-बाध्यकारी गतिविधियों के अधिकारी के पास होने की संभावना थे18. हालांकि, इस दृष्टिकोण मौजूदा बड़े संपर्क डेटाबेस खनन पर निर्भर करता है और केवल प्रोटीन की पहचान कर सकते है कि सह जा सकता है ज्ञात RBPs के साथ गैर denaturing स्थितियों में शुद्ध, इस प्रकार विश्लेषण अघुलनशील से छोड़कर, झिल्ली एंबेडेड, और दुर्लभ प्रोटीन.

एक सदाशई RBP के रूप में एक प्रोटीन की पहचान अक्सर स्वचालित रूप से प्रोटीन-आरएनए बातचीत के जैविक और जैव रासायनिक समारोह के बारे में जानकारी नहीं निकलेगा । इस बिंदु को संबोधित करने के लिए, यह आम तौर पर वांछनीय है प्रोटीन डोमेन और एमिनो एसिड बातचीत में शामिल अवशेषों की पहचान इतना है कि विशिष्ट म्यूटेंट के लिए प्रत्येक उपंयास के संदर्भ में आरएनए बाध्यकारी समारोह का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है RBP19, 20. हमारे समूह और अंय लोगों द्वारा पिछले प्रयासों संयोजक प्रोटीन टुकड़े और हटाने म्यूटेंट का इस्तेमाल किया है आरएनए बंधन क्षेत्रों की पहचान (RBRs)19,20,21,22; हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण उच्च प्रवाह विश्लेषण के साथ श्रम गहन और असंगत हैं । हाल ही में, एक अध्ययन में एक उच्च प्रवाह वाले फैशन में आरएनए-बाइंडिंग गतिविधियों को जन स्पेक्ट्रोमेट्री23का उपयोग करते हुए मैप करने के लिए एक प्रायोगिक कार्यनीति बताई गई है; हालांकि, इस दृष्टिकोण एक डबल polyA + आरएनए चयन पर भरोसा है, और इस तरह RBP पहचान दृष्टिकोण ऊपर वर्णित के रूप में एक ही सीमाओं किया ।

हमने एक तकनीक विकसित की, जो कि आरएनए बाइंडिंग क्षेत्र पहचान (RBR-ID) है, जो प्रोटीन-आरएनए photocrosslinking और मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का शोषण करता है ताकि प्रोटीन और प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान की जा सके जो बिना जीवित कोशिकाओं में आरएनए के साथ इंटरैक्ट कर रहे हैं आरएनए polyadenylation स्थिति पर धारणा, इस प्रकार polyA-RNAs24के लिए बाध्य RBPs सहित । इसके अलावा, इस विधि crosslinking पर विशेष रूप से निर्भर करता है और प्रोटीन घुलनशीलता या पहुंच पर कोई आवश्यकताओं है और इस तरह झिल्ली (जैसे परमाणु लिफाफा) या खराब घुलनशील डिब्बों के भीतर आरएनए-बाध्यकारी गतिविधियों को मैप करने के लिए उपयुक्त है ( परमाणु मैट्रिक्स उदा ) । हम प्रायोगिक चरणों का वर्णन करने के लिए RBR माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESCs) के नाभिक के लिए आईडी लेकिन मामूली संशोधनों के साथ इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक किस्म के लिए उपयुक्त होना चाहिए, बशर्ते कि वे कुशलतापूर्वक संस्कृति से 4SU को शामिल कर सकते है मध्यम.

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. mESCs की संस्कृति और विस्तार

< p class = "jove_content" > नोट: माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को संस्कृति के लिए आसान कर रहे हैं और जल्दी से अपने तेजी से साइकिल चालन समय के लिए धन्यवाद जैव रासायनिक प्रयोगों द्वारा आवश्यक बड़ी संख्या के लिए विस्तार किया जा सकता है. Healthy mESCs डबल हर 12 ज.

  1. विस्तार mESC माध्यम में जिलेटिन प्लेटों पर वांछित संख्या में mESCs (नीचे देखें) एक ऊतक संस्कृति मशीन में रखा ३७ & #176; ग, 5% कं 2 , व & #62; ९५% आर्द्रा.
    नोट: पर्याप्त प्लेटें 3-5 जैविक प्रतिकृति के लिए + 4SU नमूना और-4SU नियंत्रण के लिए तैयार किया जाना चाहिए । १ १०-मुख्यमंत्री प्लेट ( यानी 5-10 लाख कोशिकाओं) प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए पर्याप्त से अधिक है.
  2. के लिए यम mESCs से बना है Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम (DMEM) 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 2 मिमी L-glutamine, 0.5 x पेनिसिलिन/streptomycin, 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, १०० & #181; एम बीटा-mercaptoethanol, १,००० यू /mL ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (लिफ), 3 & #181; m CHIR99021, 1 & #181; मी PD0325901.
  3. से पहले passaging mESCs, 10 सेमी प्लेट्स की वांछित संख्या तैयार करें ।
    1. पानी में ०.१% जिलेटिन की 4 मिलीलीटर जोड़ें सुनिश्चित करें कि प्लेट की पूरी सतह को कवर किया जाता है; कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए मशीन; जिलेटिन समाधान निकालें ।
  4. गद्यांश कोशिकाओं जब वे पहुँच ~ प्लेट प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं, आम तौर पर ~ ४८ ज निम्नलिखित टीका.
    नोट: mESCs घने कालोनियों में बढ़ने के रूप में, प्लेटें कभी भी monolayers ( जैसे HEK293 या 3T3 कोशिकाओं) में बढ़ने कि सेल लाइनों के लिए मनाया के रूप में १००% प्रवाह तक पहुंचने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । एक mESC थाली पारित किया जाना चाहिए जब ~ ५०% धाराप्रवाह और निश्चित रूप से पहले माध्यम पीले रंग बदल जाता है ।
    1. कोशिकाओं को अलग करने के लिए, घने mESC संस्कृतियों के साथ प्लेटें धो एक बार 1x फास्फेट में खारा (पंजाब) 2 मिमी EDTA के साथ पूरक, तो फिर ०.०५% trypsin DMEM में भंग और 5 मिनट के लिए मशीन के लिए वापसी प्लेट जोड़ें (३७ & #176; ग, 5% कं 2 , और & #62; ९५% आर्द्रा).
    2. मशीन से प्लेट हटाने और ऊपर और नीचे जोरदार कई बार pipetting द्वारा DMEM के बराबर मात्रा के साथ कोशिकाओं को स्थगित ।
    3. गणना कोशिकाओं hemocytometer का उपयोग कर और सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को एक एकल सेल निलंबन ( यानी कोई क्लस्टर्स), तो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेल मिश्रण ५०० x g केंद्रापसारक । निकालें supernatant और 1-2 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड DMEM.
      4. १०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर
    4. लगाना कोशिकाओं/सेमी 2 में mESC मीडियम ( यानी ~ ८००,००० सेल प्रति 10-cm प्लेट) में तैयार की गई जिलेटिन कोटेड प्लेट्स का प्रयोग स्टेप 1.3.1.
< p class = "jove_title" > 2. प्रोटीन का Crosslink & #8211; आरएनए लाइव सेल में बातचीत

< p class = "jove_content" > नोट: आरएनए-प्रोटीन crosslinking फोटो-activatable ribonucleoside एनालॉग 4-thiouridine (4SU) द्वारा मध्यस्थता है. 4SU ने अब अंतर्जात से अधिकतम अवशोषक किया है न्यूक्लियोटाइड और केवल आरएनए में शामिल किया जा सकता है; इसलिए मध्यवर्ती-तरंग दैर्ध्य UVB के लिए चुनिंदा crosslink आरएनए के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रोटीन < सुप वर्ग = "xref" > २५ , < सुप क्लास = "xref" > २६ . 4SU-इलाज कोशिकाओं के UVB उपचार 4SU से युक्त आरएनए और एमिनो एसिड के बीच आबंध crosslinks की ओर जाता है, Tyr के लिए एक रिपोर्ट वरीयता के साथ, टीआरपी, मिले, Lys, और Cys < सुप वर्ग = "xref" > 27 .

  1. चरण 1 में वर्णित के रूप में 10-सेमी प्लेट की आवश्यक संख्या के लिए mESCs का विस्तार करें ।
    नोट: पर्याप्त प्लेटें 3-5 जैविक प्रतिकृति के लिए + 4SU नमूना और-4SU नियंत्रण के लिए तैयार किया जाना चाहिए । १ १०-मुख्यमंत्री प्लेट ( यानी 5-10 लाख कोशिकाओं) प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए पर्याप्त है ।
  2. से पहले, 4SU सीधे मध्यम में ५०० & #181 की अंतिम एकाग्रता को जोड़ने के लिए प्लेटें तक पहुँचने; एम. छोड़-4SU नियंत्रण व्यंजन अनुपचारित.
  3. हिला प्लेटें धीरे माध्यम भर में 4SU homogeneously वितरित करने के लिए । उन्हें 2 ज के लिए एक ही ऊतक संस्कृति मशीन के लिए लौटें (३७ & #176; ग, 5% कं 2 , व & #62; ९५% आर्द्रता).
  4. एक बर्फ बाल्टी के लिए स्थानांतरण प्लेटें और मध्यम त्यागें ।
  5. ने प्लेट को धीरे से धोकर 5 मिलीलीटर बर्फ के साथ ठंडा कर लें ।
    नोट: धीरे कुल्ला या कोशिकाओं अलग हो सकता है.
  6. बर्फ के 2 मिलीलीटर-ठंडा पंजाबियों और एक UVB-उत्सर्जक बल्ब (३१२ एनएम) से सुसज्जित crosslinker में ढक्कन के बिना जगह प्लेट जोड़ें । 1 J/cm 2 .
    की एक ऊर्जा सेटिंग में विकीर्ण प्लेट्स नोट: यह महत्वपूर्ण है कि प्लास्टिक के ढक्कन हटा रहे हैं या वे यूवी प्रकाश से कोशिकाओं को ढाल और crosslinking को रोकने हो सकता है.
  7. सेल भारोत्तोलकों का उपयोग कर कोशिकाओं को इकट्ठा करने और शंकु ट्यूबों में बर्फ ठंडा पंजाबियों के लिए स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक, 4 & #176; C.
  8. 2 मिमी EDTA और ०.२ मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) के साथ 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पंजाब में supernatant और reसस्पैंड सेल गोली निकालें.
  9. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती । 10-सेमी और 15 सेमी प्लेटों से क्रमश: 5-10 और 10-20 लाख कोशिकाओं की अपेक्षा करें ।
  10. केंद्रापसारक पर २,००० x जी के लिए 5 मिनट, 4 & #176; ग.
    नोट: छर्रों कोशिकाओं को तुरंत चरण 3 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या वे तरल नाइट्रोजन में फ्लैश जमे हुए किया जा सकता है और पर संग्रहित-८० & #176; ग अनिश्चित काल तक । यह एक संभावित रोक बिंदु है ।
< p class = "jove_title" > 3. अलगाव नाभिक

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: नाभिक cytoplasmic प्रोटीन को हटाने और परमाणु प्रोटीन की कवरेज बढ़ाने के लिए अलग-थलग पड़ जाते हैं । इस कदम के लिए सेलुलर भिंन के अंय रूपों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है विभिंन सेलुलर डिब्बों में RBPs अध्ययन ।

  1. तैयार करें आइस कोल्ड बफर ए (10 एमएम Tris-एचसीएल नं० ७.९, 4 & #176; सी, १.५ एमएम MgCl 2 , 10 एमएम KCl) । निष्कर्षण के लिए १०,०००,००० कोशिकाओं (चरण २.९ में गिना जाता है) के अनुसार कम से २.५ मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    नोट: एक (जैसे एक ५०० मिलीलीटर की बोतल) बफर के स्टॉक्स अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और 4 & #176; C 6 महीने के लिए पर संग्रहीत ।
    1. का उपयोग करने से पहले, ०.५ mm dithiothreitol (डीटीटी) और ०.२ mm PMSF के लिए वांछित राशि (२.५ मिलीलीटर प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं) को आइस-कोल्ड बफर ए
      2. में जोड़ें
  2. धोने कोशिकाओं 2 मिलीलीटर बफर एक प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं का उपयोग कर । स्पिन पर 5 मिनट के लिए २,५०० x g पर 4 & #176; C.
  3. त्याग supernatant, बफर जोड़ें एक गैर ईओण का ०.२% के साथ पूरक-denaturing डिटर्जेंट, जैसे octyl-phenoxy-polyethoxy-इथेनॉल ( सामग्री की तालिका देखें ), ५०० & #181; एल प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं. 4 & #176 पर 5 मिनट के लिए घुमाएं; C.
  4. 5 min.
    5. के लिए २,५०० x g पर केंद्रापसारक
  5. निकाल supernatant; गोली कोशिका के बरकरार नाभिक विहीन शामिल हैं ।
    नोट: नाभिक के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है चरण 4 या फ़्लैश-जमी में तरल नाइट्रोजन और संग्रहित पर-८० & #176; ग अनिश्चित काल तक । यह एक संभावित रोक बिंदु है ।
< p class = "jove_title" > 4. Lysis नाभिक

< p class = "jove_content" > नोट: Crosslinked नाभिक प्रोटीन और प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स रिलीज़ करने के लिए एक मास लीजड-संगत बफ़र में स्पेक्ट्रोमेट्री हैं ।

  1. जोड़ lysis बफर (9 मीटर यूरिया, १०० एमएम Tris-एचसीएल नं० ८.०, 24 & #176; सी), २०० & #181; एल प्रति १०,०००,००० कक्ष । Sonicate को कतरनी क्रोमेटिन का उपयोग कर एक 1/8 & #34; 5-10 s.
    2. के लिए ५०% आयाम सेटिंग पर जांच
  2. 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर स्पिन और गोली से बचने के लिए १७५ & #181; supernatant के एल.
    नोट: १०० & #181; l का उपयोग अगले RBR-ID चरणों के लिए किया जाएगा और शेष ७५ & #181; l के lysate पर संग्रहित किया जा सकता है-८० & #176; C for बाद में उपयोग और/या पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए.
  3. ब्रैडफोर्ड परख या समान तकनीक के माध्यम से प्रोटीन एकाग्रता उपाय < सुप वर्ग = "xref" > २८ . lysis बफर की उचित मात्रा का उपयोग कर 1 मिलीग्राम/एमएल या निंनतम नमूना एकाग्रता के लिए विभिंन नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता पतला ।
    नोट: १०,०००,००० mESCs की नाभिक से १०० की अपेक्षा-& #160; २०० & #181; छ प्रोटीन की.
< p class = "jove_title" > 5. Trypsin पाचन

< p class = "jove_content" > ध् यान दें: प्रोटीन्स पैदा करने के लिए पच रहे हैं पेप्टाइड्स sबॉटम-अप मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) विश्लेषण के लिए uitable.

  1. परमाणु lysate के लिए डीटीटी समाधान जोड़ें (5 मिमी अंतिम); भ.
    2. में 1 ज के लिए मशीन
  2. ताजा स्टॉक (14 मिमी अंतिम) से iodoacetamide जोड़ें; अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  3. पतला lysate 5 गुना वॉल्यूम के साथ ५० mM NH 4 HCO 3
  4. Add trypsin (& #181; g प्रोटीन: & #181; g trypsin = २००:1); पर ३७ की मशीन & #176; सी रात भर.
< p class = "jove_title" > 6. पेप्टाइड्स के लवण

  1. नमूना प्रति एक कस्टम बनाया चरण टिप तैयार ।
    1. 6.1.1. एक २०० के तल में ठोस चरण निष्कर्षण C18 सामग्री की एक डिस्क प्लेस & #181; L पिपेट टीप.
    2. Add ५० & #181; L oligo R3 के C18 डिस्क के शीर्ष पर चरण राल औंधा । एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब अंदर अनुकूलक के साथ और जगह टिप केंद्रापसारक अनुकूलक के अंदर मंच टिप प्लेस ।
    3. Add १०० & #181; L १००% acetonitrile को धोने के लिए टिप्स. १००० एक्स जी पर 1 मिनट के लिए विलायक हटाने के लिए केंद्रापसारक ।
    4. Equilibrate with ५० & #181; L ०.१% trifluoroacetic अम्ल (TFA) । 1 min.
      5. के लिए १००० x g पर केंद्रापसारक
  2. १००% को पचा प्रोटीन के लिए फार्म का एसिड जोड़ने के लिए पीएच 2-3 को कम करने के लिए नमूना ।
    नोट: यह आवश्यकता चाहिए ~ 5 & #181; प्रति 1 मिलीलीटर पतला पेप्टाइड नमूना, लेकिन पीएच मापा जाना चाहिए और अधिक फार्म का एसिड जोड़ा यदि आवश्यक हो तो.
  3. कस्टम पर लोड नमूना मंच टिप बनाया, 1 मिनट के लिए १००० x g पर जब तक नमूना के सभी टिप के माध्यम से चला जाता है ।
  4. धो बाउंड पेप्टाइड्स के साथ ५० & #181; L ०.१% TFA. 1 min.
    5. के लिए १००० x g पर केंद्रापसारक
  5. Elute पेप्टाइड्स जोड़कर ५० & #181; L रेफरेंस बफर (७५% acetonitrile, ०.०२५% TFA) चरण टिप करने के लिए और 1 मिनट के लिए १००० x g पर केंद्रापसारक टिप से बाहर करने के लिए बाध्य करने के लिए ।
  6. 1
    के लिए १५० x g और 1-3 केपीए पर सेट एक निर्वात केंद्रापसारक का उपयोग नमूना सूखी नोट: सूखे पेप्टाइड पर संग्रहित किया जा सकता है-८० & #176; ग अनिश्चित काल तक । यह एक संभावित रोक बिंदु है ।
< p class = "jove_title" > 7. Crosslinked आरएनए को हटाया गया

< p class = "jove_content" > नोट: Crosslinked आरएनए को निकालने के लिए nuclease के साथ पेप्टाइड्स का इलाज.

  1. ५० में गोली reसस्पैंड & #181; L 2x nuclease बफर (१०० मिमी NH 4 HCO 3 , 4 एमएम MgCl 2 ).
  2. माप पेप्टाइड एकाग्रता का उपयोग २८० एनएम संभालने 1 मिलीग्राम/एमएल के लिए पेप्टाइड्स के एक २८० के 1.
    नोट: अपेक्षित एकाग्रता है 1 मिलीग्राम/एमएल
  3. 1 मिलीग्राम/एमएल करने के लिए या 2x nuclease बफर का उपयोग कर सबसे कम एकाग्रता के लिए सभी नमूनों को समायोजित करें ।
  4. की एक मास्टर मिश्रण तैयार ५० & #181; ल H 2 O + 1 & #181; l उच्च शुद्धता nuclease (& #8805; २५० U) ( तालिका सामग्री ) प्रति नमूना के लिए देखें ।
  5. कग ५० & #181; ल l त पेप्टाइड नमुना व add ५० & #181; l के H 2 O + nuclease मास्टर mix.
  6. पर ३७ & #176; ग 1 ज के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री.
    करने के लिए आगे बढ़ें नोट: पेप्टाइड्स अब मास-स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए तैयार हैं । वे तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है या पर संग्रहित-८० & #176; ग अनिश्चित काल तक । यह एक संभावित रोक बिंदु है ।
< p class = "jove_title" > 8. नैनो लिक्विड क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और रॉ डाटा प्रोसेसिंग

< p class = "jove_content" > नोट: क्योंकि 4SU-crosslinking में पेप्टाइड का द्रव्यमान बदलता है, उनके आयनों गैर-crosslinked पेप्टाइड की तीव्रता की ओर नियंत्रण रेखा के दौरान गिनती नहीं ms/ जिसके कारण crosslinking की कमी होने लगती है । डिग्री और इस कमी की निरंतरता प्रत्येक पेप्टाइड < सुप वर्ग के लिए प्रोटीन-आरएनए crosslinking की डिग्री को दर्शाता है = "xref" > 24 .

  1. HPLC बफ़र्स निम्नानुसार तैयार: HPLC-ग्रेड पानी में ०.१% फार्मिक एसिड (बफर ए); ०.१% HPLC ग्रेड acetonitrile में फार्मिक एसिड (बफर बी).
  2. यदि कोई नैनो-HPLC उपलब्ध है, तो निंन विनिर्देशों के साथ एक नैनो-स्तंभ कनेक्ट करें: आंतरिक व्यास ७५ & #181; m; C18-वायु कणों के साथ पैक; लंबाई 20-25 सेमी.
    नोट: यदि HPLC उपलब्ध उच्च प्रवाह दर पर चलता है संकेत प्रवाह दर के लिए एक उचित स्तंभ आकार का उपयोग करें । उच्च प्रवाह क्रोमैटोग्राफी संवेदनशीलता घटाता है ।
  3. प्रोग्राम HPLC विधि निम्नानुसार है: प्रवाह दर २५०-३०० nL/min; ग्रैडिएंट से 2 में 28% बफ़र b १२० मिनट में, 28 से ८०% b अगले 5 मिनट के लिए और isocratic ८०% b 10 min.
    के लिए नोट: यदि HPLC के पास कोई स्वचालित स्तंभ equilibration पूर्व नमूना लोडिंग नहीं है, तो नमूना लोड करने से पहले प्रोग्राम को 0% B पर 10 मिनट के साथ प्रारंभ करें.
  4. कार्यक्रम एमएस अधिग्रहण विधि मानक शॉटगन प्रोटियोमिक् प्रयोगों के रूप में डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) करने के लिए । साधन कर्तव्य चक्र मिलकर एमएस स्कैन के साथ वैकल्पिक पूर्ण एमएस स्कैन करना चाहिए (या एमएस/ms) सबसे तीव्र संकेतों के. प्रोटियोमिक् MS रन के लिए इष्टतम सेटिंग्स का उपयोग करें ।
    नोट: आत्मविश्वास के परिणाम के लिए, उपकरणों का उपयोग करें कि कम से प्रदर्शन कर सकते हैं पूर्ण एमएस उच्च संकल्प मोड में स्कैन ( जैसे orbitrap, समय की उड़ान). सटीक ठहराव के लिए, सुनिश्चित करें कि पूर्ण MS स्कैन के बीच अंतराल अब से 3 s नहीं हैं । अब शुल्क चक्र निकाले आयन chromatograms की सटीक परिभाषा को रोकने हो सकता है.
  5. लोड 1-2 & #181; HPLC कॉलम पर नमूना के जी और क्रमादेशित के रूप में HPLC ms/ प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए प्रदर्शन कम से दो स्वतंत्र रन और उंहें इलाज के रूप में तकनीकी प्रतिकृति ।
    6. एमएस के बाद
  6. , एमएस के लिए एक प्रोटियोमिक् सॉफ्टवेयर पैकेज में रॉ फ़ाइलों को आयात/ms स्पेक्ट्रा की पहचान और पेप्टाइड ठहराव के माध्यम से निकाली आयन क्रोमैटोग्राफी । हम अनुशंसा करते है कि एकाधिक MS रन का क्रोमेटोग्राफिक संरेखण कर सकते है जो सॉफ़्टवेयर पैकेज (सामग्री की तालिका देखें ) < सुप वर्ग = "xref" > 29 , < सुप वर्ग = "xref" > 30 .
  7. अगर ऑप्शन सॉफ्टवेयर सुइट में उपलब्ध है, तो सक्षम & #34; रन के बीच मैच & #34; डेटा प्रोसेसिंग शुरू करने से पहले ।
  8. विश्लेषण समाप्त होने के बाद, ठहराव मान के साथ पेप्टाइड सूची निर्यात करें ।

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Representative Results

आरेख 1 RBR-ID वर्कफ़्लो को दर्शाया गया है । इस तकनीक के अपेक्षाकृत कम crosslinking दक्षता के कारण, यह बहुत महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए दोनों कमी स्तर और मनाया प्रभाव की निरंतरता (पी-मूल्य) जैविक प्रतिकृति में । चित्रा 2 RBR के एक ज्वालामुखी भूखंड-आईडी परिणाम से पता चलता है । उस पर छा आरएनए पहचान रूपांकन (RRM) डोमेन अत्यधिक सुसंगत कमी स्तर दिखा पेप्टाइड्स । RRM डोमेन RBR आईडी विश्लेषण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

RBR-आईडी लाइव कोशिकाओं में RBRs नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक RBR-आईडी स्कोर प्रत्येक पेप्टाइड का अनुमान है आरएनए-बाइंडिंग क्षमता के लिए गणना की जा सकती है: RBR-id स्कोर =-लॉग2(सामान्यीकृत + 4SU तीव्रता/सामान्यीकृत-4SU तीव्रता) x (लॉग10(पी-वैल्यू))2. चित्रा 3 spliceosomal उपइकाई U1-70k की सतह पर अनुमानित RBR-आईडी स्कोर के एक heatmap से पता चलता है. क्रिस्टल संरचना से निर्धारित के रूप में आरएनए संपर्क के आसपास में चमकीले लाल रंग, प्रोटीन-आरएनए बातचीत की सही पहचान इंगित करता है ।

उपंयास RBPs और उनके RBRs की पहचान पर, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि उनकी आरएनए-बाध्यकारी गतिविधि एक स्वतंत्र विधि द्वारा पुष्टि की है । हमारे पिछले अध्ययन में24, हमने TET2 को एक उपंयास RBP के रूप में पहचाना और आरएनए-बाइंडिंग गतिविधि को सी-टर्मिनल क्षेत्र में मैप किया, जैसा कि प्रोटीन के प्राथमिक अनुक्रम के साथ RBR-ID स्कोर को प्लॉट करके चित्र 4a में दिखाया गया है । चित्रा 4B से पता चलता है कि इस उपंयास RBR के लिए आवश्यकता बराबर प्रदर्शन द्वारा सत्यापित किया जा सकता है-क्लिप26 WT अनुक्रम का उपयोग कर और एक उत्परिवर्ती कमी की भविष्यवाणी RBR के लिए संकेत की तुलना । इस मांयता प्रयोग के अतिरिक्त नियंत्रण और अधिक विस्तृत विवरण वह एट अल में उपलब्ध हैं. २०१६24.

Figure 1
चित्र 1: RBR-ID ओवरव्यू. माउस ESCs 4SU या नहीं (1-2) और ३१२ एनएम यूवी (3) के साथ विकिरणित के साथ इलाज कर रहे हैं । नाभिक अलग कर रहे है (4) और अर्क और nuclease के साथ पचा, दोनों crosslinked और uncrosslinked पेप्टाइड्स (5) उपज । crosslink स्थलों पर आबंध आरएनए adducts पेप्टाइड मास में परिवर्तन, uncrosslinked पेप्टाइड के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम की तीव्रता में एक इसी कमी के लिए अग्रणी (6, तीर). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Proteome-वाइड RBR-mESCs में ID । ज्वालामुखी x अक्ष पर और छात्र के टीपरीक्षण पी-मान ± 4SU उपचार (३१२ एनएम) के लिए y अक्ष पर मूल्यों पर पेप्टाइड में परिवर्तन दिखा पेप्टाइड्स से व्याख्या RRM डोमेन ओवरलैपिंग नीले रंग में हैं । HNRNPC से एक आरएनए-बाइंडिंग पेप्टाइड लाल में हाइलाइट किया गया है । पहले वह एट अल २०१६24में प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: RBR-आईडी नक्शे प्रोटीन की साइटों-आरएनए बातचीत. U1 snRNP (PDB id: 4PJO31) के क्रिस्टल संरचना के क्षेत्र में ज़ूम-इन क्षेत्रों में प्रोटीन दिखाती है रंग-कोडेड उनके RBR-ID स्कोर के अनुसार और RNAs-U1 के लिए 70K बातचीत । पहले वह एट अल २०१६24में प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: TET2 की RBR की मांयता । (A) प्राथमिक अनुक्रम और TET2 के लिए ज्ञात डोमेन; प्राथमिक अनुक्रम (मध्य) के साथ रची गई अवशेष-स्तरीय RBR-आईडी स्कोर; और epitope की योजना-उत्प्रेरक डोमेन टुकड़ा (सीडी) और RBR नष्ट (CDΔRBR) के लिए मांयता (नीचे) के लिए इस्तेमाल किया constructs । (ख) PAR-क्षणिक TET2 सीडी और HEK293 कोशिकाओं में ΔCDΔRBR व्यक्त की क्लिप । Autoradiography के लिए ३२पी-लेबल आरएनए (शीर्ष) और नियंत्रण पश्चिमी दाग (नीचे) । पहले वह एट अल २०१६24में प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम mESCs में RBR आईडी प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन और, उचित संशोधनों के साथ, आरएनए में 4SU को शामिल कर सकते हैं कि किसी भी सेल में. अंय सेल प्रकार के दृष्टिकोण के अनुकूलन की आवश्यकता को शोर अनुपात के लिए एक पर्याप्त संकेत सुनिश्चित कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल परमाणु RBPs की परीक्षा पर केंद्रित है, RBR आईडी प्रौद्योगिकी आसानी से विभिंन सेलुलर डिब्बों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, जैसे cytosol या विशिष्ट organelles, विभिंन भिन्नीकरण के उपयोग के द्वारा रणनीति. मानकों कि अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है 4SU एकाग्रता और निगमन समय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से यूवी crosslinking की ऊर्जा शामिल हैं । इन मापदंडों आरएनए-प्रोटीन crosslinks के कुशल गठन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और शोर अनुपात करने के लिए एक संतोषजनक संकेत उपज. हमें पता चला है कि ३१२ एनएम UVB प्रकाश crosslinking 4SU में ज्यादा कुशल है-३६५ एनएम UVA आम तौर पर बराबर में इस्तेमाल किया-क्लिप३२की तुलना में प्रोटीन के लिए RNAs युक्त । RBR की प्रत्यक्ष तुलना-३१२ एनएम और ३६५ एनएम के साथ प्रदर्शन आईडी का प्रदर्शन किया है कि ३१२ एनएम UVB ज्ञात RBPs के एक बहुत बड़ा भाग की पहचान के परिणामस्वरूप24।

proteome चौड़ा RBP पहचान करने के लिए दो अन्य विधियाँ उपलब्ध हैं । एक, RBDmap कहा जाता है, RBR में आईडी के समान है कि यह यूवी crosslinking और सुश्री RBDmap का इस्तेमाल RBPs की पहचान और उनके आरएनए-हेला कोशिकाओं में बाध्यकारी गतिविधियों को मैप करने के लिए उपयोग किया गया था23. यह विधि आरएनए-बाइंडिंग साइटों से सटे पेप्टाइड्स की सकारात्मक पहचान पर निर्भर करती है और दो क्रमिक oligo-डीटी pull-downs पर निर्भर करता है, सुझाव है कि यह RBR-ID से कम झूठी सकारात्मक दर हो सकता है । हालांकि, पुल चढ़ाव केवल RBPs की पहचान की अनुमति है कि polyA के लिए बांध + आरएनए और इनपुट सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, अप करने के लिए 10-100 RBR से अधिक बार आईडी. RBR-आईडी के रूप में कम के रूप में के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है 5 जैविक नकल प्रति प्रोटीन के µ g (~ तकनीकी नकल के प्रति 2 µ जी), जो २५०,००० कोशिकाओं के रूप में कुछ के रूप में से एकत्र किया जा सकता है ।

दूसरी विधि, सोनार कहा जाता है, बड़े प्रोटीन के डेटा खनन पर निर्भर करता है प्रोटीन संपर्क डेटाबेस का पता लगाने के लिए प्रोटीन है कि अक्सर सह ज्ञात RBPs के साथ शुद्ध और इन RBPs के साथ जिनकी बातचीत इसलिए आरएनए18से मध्यस्थता हो सकता है. यह चालाक दृष्टिकोण बहुत शक्तिशाली है और किसी भी गीले प्रयोगशाला प्रयोग प्रदर्शन के बिना उपंयास RBPs की पहचान के लिए अनुमति देता है, बशर्ते कि उपयुक्त डेटाबेस उपलब्ध हैं; हालांकि, यह संपर्क साइटों को प्रकट नहीं कर सकता और इसलिए पूरक लेकिन RBR-ID के लिए वैकल्पिक नहीं है ।

संक्षेप में, हमारे RBR-आईडी तकनीक उपंयास RBPs की पहचान और सीमित इनपुट नमूना मात्रा के साथ अपने RBRs नक्शा और प्रोटीन-आरएनए crosslinked परिसरों के किसी भी जैव रासायनिक शोधन की आवश्यकता के बिना कर सकते हैं । तकनीक की पहचान की RBPs से बंधे आरएनए के प्रकार पर कोई धारणा बनाता है और इसलिए गैर polyadenylated के लिए बाध्य है कि प्रोटीन की आरएनए बाध्यकारी गतिविधि को मैप कर सकते हैं, जिनमें से कई कोडिंग कर रहे हैं, सुझाव है कि RBR आईडी का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तकनीक साबित हो सकता है डिकोडिंग RNAs की विनियामक भूमिकाएँ ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

R.B. Searle विद्वानों कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, W.W. स्मिथ फाउंडेशन (C1404), और सिक्का फाउंडेशन के मार्च (1-वित्तीय-15-344) । बी. ए. जी NIH अनुदान R01GM110174 और NIH R01AI118891, साथ ही DOD अनुदान BC123187P1 से समर्थन स्वीकार करता है. आर.-टी. NIH प्रशिक्षण अनुदान T32GM008216 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KnockOut DMEM Fisher Scientific 10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin Fisher Scientific 26140079
L-Glutamine solution 200 mM Sigma G7513
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1106
CHIR99021 Tocris 4423
PD0325901 Sigma PZ0162
Gelatin solution,2% in water Sigma G1393
4-thiouridine Sigma T4509 50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500 Fisher Scientific 11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma 78830
IGEPAL CO-630 Sigma 542334 Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide Sigma I6125
Trypsin, sequencing grade Promega V5111
Empore solid phase extraction disk 3M 66883
OLIGO R3 Reversed - Phase Resin Fisher Scientific 1133903
Benzonase Sigma E8263 High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100 Fisher Scientific discontinued updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
TFA Fisher Scientific A11650
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Acetic Acid Sigma 49199
Formic Acid Sigma F0507
ReproSil-Pur 18-AQ Dr. Maisch GmbH HPLC r13.aq.0003 Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm) Molex 1068150017
MaxQuant software Max Planck Institute for Biochemistry Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs

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References

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Warneford-Thomson, R., He, C., Sidoli, S., Garcia, B. A., Bonasio, R. Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions. J. Vis. Exp. (127), e56004, doi:10.3791/56004 (2017).

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