Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/56004
Automatic Translation
1,4, 1,2, 1,3, 1,3, 1,2
1Epigenetics Institute, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Graduate Group in Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

Abstract

Noncoding RNAs תפקיד חשוב בתהליכים גרעיניים מספר, לרבות ויסות גנים, הכרומטין ו- DNA לתקן. ברוב המקרים, הפעולה של noncoding RNAs מתווך על ידי פונקציות אשר בתורו מוסדרים על ידי אינטראקציות אלה noncoding RNAs עם חלבונים. בקנה אחד עם זה, מספר גדל והולך של החלבונים המעורבים פונקציות גרעיני דווח לאגד RNA, במקרים אחדים האזורים RNA-איגוד של חלבונים אלו שמופו, לעיתים קרובות באמצעות שיטות מפרך, המבוססים על המועמד.

כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט לביצוע זיהוי מוטים תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב של RNA-מחייב חלבונים ואזורים מחייב RNA שלהם. המתודולוגיה מתבססת על שילוב של uridine photoreactive אנלוגי ב- הסלולר RNA, ואחריו crosslinking בתיווך UV חלבון-RNA, וניתוחים ספקטרומטר מסה לחשוף RNA-תפור פפטידים בתוך פרוטאום. אמנם אנו מתארים את ההליך עבור תאי גזע עובריים בעכבר, הפרוטוקול צריך ניתן להתאים בקלות במגוון של תאים בתרבית.

Introduction

מטרת השיטה RBR-ID היא כדי לזהות רנ א מחייב הרומן חלבונים (RBPs) מפת אזורים מחייב RNA שלהם (RBRs) עם פפטיד ברמת רזולוציה כדי להקל על העיצוב של RNA-איגוד מוטציות והחקירה של הביולוגי, הביוכימי פונקציות של אינטראקציות חלבון-RNA.

רנ א היא ייחודית בין מולקולות כמו זה יכול גם לשמש שליח נושא מידע גנטי וגם גם לקפל לתוך מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם ביוכימיות פונקציות יותר דומה לאלה של חלבונים1,2. גוף גדל והולך של ראיות מרמז כי noncoding RNAs (ncRNAs) תפקיד חשוב שונים ג'ין מסלולים epigenetic ולניהולו4,3,5 , בדרך כלל, פונקציות רגולטוריות אלו הם מתווכת בהופעה עם חלבונים המקיימים אינטראקציה באופן ספציפי עם RNA נתון. הרלוונטיות, קבוצה של חלבונים שמעצבת זוהה לאחרונה עבור ncRNA זמן ובאינטנסיביות למדה (lncRNA) Xist, מתן ערך תובנה איך lncRNA זו שמתווכת שמושרש איון הנשי תאים6,7 ,8. ראוי לציין, מספר חלבונים אלה אינטראקציה-Xist אינם מכילים כל התחומים הקנוני RNA מחייב9, ולכן הפעילות מחייב RNA שלהם לא יכול להיות החזוי סיליקו בהתבסס על הרצף העיקרי שלהם לבד. בהתחשב בכך כי אלפי lncRNAs באים לידי ביטוי בכל תא נתון10, סביר להניח כי רבים מהם עשוי לפעול באמצעות אינטראקציות עם עדיין מתגלים RNA מחייב חלבונים (RBPs). אסטרטגיית ניסיוני לזהות את אלה RBPs הרומן ולכן להקל במידה רבה על המשימה של לנתח את תפקוד ביולוגי ncRNAs.

ניסיונות קודמים כדי לזהות RBPs מדעית צריכים לסמוך על תיקים עשויים + מבחר RNA מצמידים ספקטרומטר מסה (MS)11,12,13,14,15. למרות ניסויים אלה להוסיף חלבונים רבים רשימת בשם RBPs, על ידי עיצוב שהם יוכלו להבחין רק חלבונים מאוגדים תעתיקים polyadenylated. עם זאת, רוב RNAs קטן lncRNAs רבים אינם polyadenylated. 16 , 17 , חלבונים שמעצבת שלהם סביר הוחמצו בניסויים אלה. מחקר שנערך לאחרונה חלה בלמידה על חלבון interactome מסדי נתונים כדי לזהות חלבונים מטוהרים במשותף עם מספר RBPs ידוע והראה כי השותפים RBP חוזרים ונשנים האלה היו בסבירות גבוהה יותר להחזיק RNA מחייב פעילות18. עם זאת, גישה זו מסתמכת על כרייה מסדי נתונים קיימים של האינטראקציה גדולה, רק לזהות חלבונים אשר יכול להיות שותף מטוהרים בתנאים שאינם denaturing עם RBPs הידוע, ובכך למעט מניתוח לא מסיסים ממברנה-מוטבע, נדיר חלבונים.

הזיהוי של חלבון כמו bona פיד ה RBP לעתים קרובות אינה נותנת באופן אוטומטי מידע על תפקיד ביולוגי ו/או ביוכימי של אינטראקציה חלבון-RNA. כדי להתייחס לנקודה זו, רצוי בדרך כלל לזיהוי חלבון תחום ושל חומצות אמינו משקעי מעורב האינטראקציה כך מוטציות ספציפיות יכול להיות שנועד לבחון את הפונקציה של איגוד ה-RNA בהקשר של כל הרומן RBP19, 20. הקודם המאמצים על ידי הקבוצה שלנו ואחרים השתמשו שברי חלבון רקומביננטי, מוטציות המחיקה כדי לזהות רנ א איגוד אזורים (RBRs)19,20,21,22; עם זאת, גישות כאלה הם עתירי עבודה תואם לניתוחים תפוקה גבוהה. לאחרונה, מחקר תיאר אסטרטגיית ניסיוני למפות RNA מחייב פעילויות אופנה תפוקה גבוהה באמצעות ספקטרומטר מסה23; עם זאת, גישה זו התבססה על מבחר תיקים עשויים זוגי + RNA, וכך נשא עליו אותן מגבלות כמו זיהוי RBP הגישות שתוארו לעיל.

פיתחנו שיטה, הנקרא RNA איגוד אזור זיהוי (RBR-), המנצלת חלבון-RNA photocrosslinking, ספקטרומטר מסה כמותיים כדי לזהות חלבונים ואזורים חלבון אינטראקציה עם ה-RNA בתאים חיים בלי הנחה על מצב פוליאדנילציה RNA, כולל RBPs מאוגדים תיקים עשויים-RNAs24. יתר על כן, שיטה זו מסתמך אך ורק על crosslinking, יש אין דרישות על מסיסות חלבון או נגישות, ולכן הוא מתאים למיפוי RNA מחייב פעילות בתוך ממברנות (למשל מעטפת הגרעין) או תאים מסיסות ( למשל המטריקס גרעינית). אנו מתארים את השלבים ניסיוני כדי לבצע RBR-מזהה הגרעינים של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs) אבל עם שינויים מזעריים פרוטוקול זה צריך להיות מתאים למגוון רחב של סוגי תאים, ובלבד שהם ניתן לשלב ביעילות 4SU מתרבות בינוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות והרחבה של mESCs

הערה: תאי גזע עובריים בעכבר הם קלים לתרבות, ניתן להרחיב במהירות למספרים גדולים הנדרשים על ידי ניסויים הביוכימי בזכות שלהם פעם אופניים מהירה. MESCs בריא להכפיל את כל ה 12

  1. MESCs הרחב למספר הרצוי על הצלחות gelatinized mESC בינוני (ראו להלן) חממה תרביות רקמה שמרו ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו- > 95% לחות.
    הערה: מספיק צלחות צריכים להיות מוכנים משכפל ביולוגית 3-5, עבור + 4SU מדגם ושליטה -4SU. לוח 10-ס מ אחד (דהיינו 5-10 מיליון תאים) הוא יותר ממספקת. עבור כל שכפול ביולוגי.
  2. האמצעי mESCs מורכב Dulbecco ' s ששינה הנשר ' s בינוני (DMEM) בתוספת 15% עוברית שור סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין, 0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות x 1, 100 מיקרומטר בטא-mercaptoethanol, 1,000 U /mL לוקמיה מעכבות פקטור (LIF), מיקרומטר 3 CHIR99021, 1 מיקרומטר PD0325901.
  3. לפני passaging mESCs, להכין את המספר הרצוי של צלחות 10 ס מ.
    1. להוסיף 4 מ"ל של 0.1% ג'לטין במים מוודא כי השטח כולו של הצלחת מכוסה; תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT); הסרת פתרון ג'לטין.
  4. מעבר תאים כאשר הם מגיעים ~ 10 מיליון תאים לכל צלחת, בדרך כלל בעקבות חיסון h ~ 48-
    הערה: ככל mESCs גדלות במושבות צפופות, צלחות אסור להיות להגיע confluency 100% כפי שנצפו שורות תאים הגדלים בתוך monolayers (למשל HEK293 או 3T3 תאים). צריך להיות passaged צלחת mESC כאשר ~ 50% confluent ו בהחלט לפני המדיום לצהוב.
    1. להתנתק תאים, לשטוף צלחות עם תרבויות mESC צפופה פעם בתוך 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) בתוספת 2 מ מ EDTA, ולאחר מכן להוסיף טריפסין 0.05% מומס DMEM ולהחזיר את לוחית חממה במשך 5 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו- > 95% לחות).
    2. הסר לוחית של החממה, resuspend תאים בעלי נפח שווה של DMEM על ידי pipetting למעלה ולמטה נמרצות מספר פעמים.
    3. לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהבטיח כי תאים טופס השעיה תא בודד (כלומר אין אשכולות), ואז צנטריפוגה תא תערובת 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב 1-2 מ ל DMEM.
    4. לחסן תאים על צפיפות של תאים/ס מ 10,000 2 mESC בינוני (קרי 800,000 תאים לכל צלחת ס מ-10) באמצעות הלוחות מצופים ג'לטין מוכן בשלב 1.3.1.

2. Crosslink של חלבון – RNA אינטראקציות בתאים חיים

הערה: RNA-חלבון crosslinking מתווך על ידי ribonucleoside activatable-צילום אנלוגי 4-thiouridine (4SU). 4SU יש מקסימום ספיגת יותר מאשר אנדוגני נוקלאוטידים בלבד וניתן לשלב לתוך RNA; לכן UVB בינוני באורך הגל יכול לשמש באופן סלקטיבי crosslink RNA לחלבונים 25 , 26. טיפול UVB של תאים שטופלו 4SU מוביל אל crosslinks קוולנטיות בין המכילות 4SU RNA, חומצות אמינו, עם העדפה Tyr, שדווחה Trp, Met, Lys ואת Cys 27.

  1. MESCs הרחב למספר הנדרש של ס מ-10 צלחות כפי שמתואר שלב 1-
    הערה: מספיק צלחות צריכים להיות מוכנים משכפל ביולוגית 3-5, עבור + 4SU מדגם ושליטה -4SU. לוח 10-ס מ אחד (דהיינו 5-10 מיליון תאים) מספיקה עבור כל שכפול ביולוגי.
  2. לפני הלוחות מגיעים confluency, להוסיף 4SU ישירות לתוך בינוני כדי ריכוז סופי של 500 מיקרומטר. תשאירי - 4SU שליטה הכלים לא מטופל.
  3. לוחות לנער בעדינות כדי להפיץ את 4SU homogeneously ברחבי המדיום. בתכב החממה תרביות רקמה זהה עבור 2 h (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו- > 95% לחות).
  4. להעביר צלחות דלי קרח ולמחוק בינונית.
  5. לשטוף את הצלחת בעדינות עם 5 מ של PBS קר כקרח.
    הערה: לשטוף בעדינות או תאים עלול לנתק.
  6. להוסיף 2 מ"ל של צלחות PBS ומקום כקרח ללא המכסים crosslinker מצויד עם נורות פולט-UVB (312 ננומטר). להאיר צלחות-הגדרה של אנרגיה של J/cm 1 2-
    הערה: זה קריטי כי מכסי פלסטיק יוסרו או שהם אולי מגן תאים מן אור UV ולמנוע crosslinking.
  7. לאסוף תאים באמצעות תא lifters ולהעביר ל- PBS קר כקרח צינורות חרוט. צנטריפוגה ב 2,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C.
  8. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- PBS קר כקרח מ עם 2 מ מ EDTA ו- 0.2 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF).
    9. ספירת תאים באמצעות hemocytometer של
  9. . מצפה 5-10, 10-20 מיליון תאים צלחות ס מ-10, 15 ס מ בהתאמה.
    10. צנטריפוגה
  10. ב 2,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C.
    הערה: תאים מגורען יכול מיד לשמש שלב 3 או הם להיות קפוא בחנקן נוזלי, המאוחסנים ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.

3. בידוד של גרעינים

הערה: גרעינים מבודדים כדי להסיר חלבונים cytoplasmic להגביר את הסיקור של חלבונים גרעיניים. שלב זה יכול להיות מוחלף עם צורות אחרות של fractionation הסלולר ללמוד RBPs בתאים הסלולר שונה.

  1. הכן קר כקרח מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10 מ מ אשלגן כלורי). להשתמש לפחות 2.5 מ לכל 10 מיליון תאים (לפי ספירת בשלב 2.9) לחילוץ.
    הערה: מניות המאגר A (לדוגמא בקבוק 500 מ"ל) יכול להיות שהוכנה מראש ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
    1. לפני השימוש, להוסיף dithiothreitol 0.5 מ מ (DTT) ו- 0.2 מ מ PMSF ל הכמות הרצויה (2.5 מ לכל 10 מיליון תאים) המאגר הקר א
  2. לרחוץ תאים באמצעות 2 מ"ל מאגר A לכל 10 מיליון תאים. ספין-2,500 g x עבור 5 דקות ב 4 º C
  3. להשליך תגובת שיקוע, להוסיף מאגר A בתוספת 0.2% של חומר ניקוי nonionic, הלא denaturing, כגון תמצית-phenoxy-polyethoxy-אתנול (ראה הטבלה של חומרים), µL 500 לכל 10 מיליון תאים. סיבוב במשך 5 דקות ב 4 º C
  4. צנטריפוגה-2,500 g x עבור 5 דק.
  5. להסיר את תגובת שיקוע; בגדר כוללת גרעינים שלמים ללא ציטופלזמה.
    הערה: גרעינים שניתן להשתמש באופן מיידי עבור שלב 4 או קפואה של חנקן נוזלי ו המאוחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.

4. פירוק של גרעינים

הערה: lysed הם גרעינים תפור במאגר מסה ספקטרומטר תואמי לשחרר חלבונים, חלבונים-RNA מתחמי.

  1. מאגר פירוק הוספה (אוריאה 9 מטר, 100 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 24 ° C), µL 200 לכל 10 מיליון תאים. Sonicate להטיית כרומטין באמצעות 1/8 " בדיקה ב- 50% משרעת הגדרה עבור s 5-10
  2. ספין-12,000 x g עבור 5 דקות של 175 לאסוף µL של תגובת שיקוע להימנע בגדר.
    הערה: 100 µL ישמש עבור השלבים הבאים RBR-ID, ניתן לאחסן את µL 75 הנותרים של lysate ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש ו/או ניתוח תספיג.
  3. למדוד ריכוז חלבון באמצעות שיטת ברדפורד או טכניקה דומה 28. לדלל את ריכוז חלבון בדגימות שונות כדי 1 מ"ג/מ"ל או הריכוז הנמוך ביותר מדגם באמצעות כמויות מתאימות של פירוק מאגר.
    הערה: מן הגרעינים של 10 מיליון mESCs מצפה µg 100-200 של חלבון.

5. עיכול טריפסין

הערה: חלבונים מתעכלים ליצירת פפטידים suitable לניתוח ספקטרומטר מסה מלמטה למעלה (MS).

  1. פתרון DTT להוסיף גרעיני lysate (5 מ מ הסופי); תקופת דגירה של h 1-RT.
  2. להוסיף iodoacetamide במלאי טריים (14 מ מ הסופי); תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT בחושך.
  3. Dilute lysate עם 5 פעמים נפח של 50 מ מ NH 4 HCO 3
  4. להוסיף טריפסין (חלבון µg: µg טריפסין = 200:1); דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

6. Desalting של פפטידים

  1. להכין עצה אחת הבמה בהזמנה אישית עבור דגימה.
    1. 6.1.1. מקום בדיסק של מעבדתי החילוץ סי18 חומר לתוך החלק התחתון של טיפ פיפטה 200 µL.
    2. µL להוסיף 50 של oligo R3 להפוך פאזה שרף על גבי הדיסק סי18. קצה הבמה בתוך צנטריפוגה מתאם ואת הקצה מקום עם מתאם בתוך צינור microfuge 1.5 mL-
    3. להוסיף 100 µL 100% acetonitrile טיפים כדי לשטוף. צנטריפוגה-1000 g x עבור 1 דקות להסיר הממס.
    4. Equilibrate עם 50 µL 0.1% trifluoroacetic חומצה (TFA). צנטריפוגה ב 1000 x g עבור מינימלית 1
  2. להוסיף חומצה פורמית 100% חלבון מתעכל הדגימה כדי להקטין את רמת ה-pH ל 2-3-
    הערה: זה צריך לדרוש ~ 5 µL לכל 1 מ של דגימה פפטיד מדולל, אך pH צריך להיות וחומצה נמדד יותר formic, הוסיף במידת הצורך.
  3. מדגם עומס על גבי הבמה מחוייט עצה, צנטריפוגה ב g 1000 x עבור 1 דקות עד שכל מדגם עובר את הטיפ.
  4. שטיפת מאוגד פפטידים עם 50 µL 0.1% TFA. צנטריפוגה ב 1000 x g עבור מינימלית 1
  5. Elute פפטידים על-ידי הוספת 50 µL • תנאי מאגר (75% acetonitrile, 0.025% TFA) ועד קצה הבמה צנטריפוגה-1000 g x עבור 1 דקות לאלץ את המאגר • תנאי הטיפ.
  6. יבש המדגם באמצעות צנטריפוגה ואקום שוכן בגובה 150 x g ו- 1-3 kPa עבור ה 1
    הערה: פפטידים יבשים ניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.

7. הסרה של RNA תפור

הערה: מתייחסים פפטידים עם נוקלאז להסיר את ה-RNA תפור.

  1. Resuspend בגדר ב- 50 µL 2 x מאגר נוקלאז (100 מ מ NH 4 HCO 3, 4 מ מ MgCl 2).
    2. ריכוז
  2. מידה פפטיד באמצעות ספיגת ב 280 ננומטר בהנחה 1 מ"ג/מ"ל של פפטידים עבור A 280 1.
    הערה: ריכוז הצפוי הוא 1 מ"ג/מ"ל.
  3. להתאים את כל הדגימות 1 מ"ג/מ"ל או הריכוז הנמוך ביותר באמצעות 2 x נוקלאז מאגר.
  4. להכין תערובת הבסיס של 50 µL H 2 O + 1 µL טוהר גבוהה נוקלאז (≥ 250 U) (עיין טבלה של חומרים) עבור דגימה.
  5. לקחת את µL 50 פפטיד מדגם ולהוסיף 50 µL של H 2 O + נוקלאז מאסטר מיקס.
  6. Incubate ב 37 ° C עבור ה 1 להמשיך לבצע ספקטרומטר מסה.
    הערה: פפטידים מוכנים עכשיו ספקטרומטר מסה. ניתן לנתח מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.

8. כרומטוגרפיה נוזלית ננו, ספקטרומטריית ולאחר עיבוד הנתונים הגולמיים

הערה: מכיוון 4SU-crosslinking משנה את המסה של פפטיד, יונים שלהם לא נמנית האינטנסיביות של פפטיד שאינו תפור במהלך LC-MS/MS, אשר לכן נראה להיות הופחתו crosslinking. התואר והעקביות של ירידה זו משקפת את מידת crosslinking RNA חלבון עבור כל פפטיד 24.

  1. HPLC להכין אנשים רגילים כדלקמן: 0.1% חומצה פורמית במים HPLC-כיתה (מאגר A); 0.1% חומצה פורמית ב- HPLC-כיתה acetonitrile (מאגר ב).
  2. אם ננו-HPLC זמין, להתחבר ננו-עמודה עם המפרט הבא: קוטר 75 מיקרומטר; ארוז עם חלקיקים סי18-AQ; אורך 20-25 ס מ.
    הערה: אם HPLC זמין פועל בקצב זרימה גבוהה יותר להשתמש בגודל המתאים בעמודה עבור קצב הזרימה המצוין. כרומטוגרפיה זרימה גבוהה יותר מקטינה רגישות.
  3. לתכנת את שיטת HPLC כדלקמן: nL תזרים קצב 250-300/min; צבע 2 למאגר 28% B ב- 120 דקות, מ- 28% 80 B עבור הבא 5 דקות, איזוקראטית 80% B עבור 10 דקות
    הערה: אם HPLC אין טעינה מוקדמת מדגם equilibration של העמודה אוטומטית, הפעלת התוכנית עם 10 דקות ב- 0% B לפני שיטען הדוגמה.
  4. תוכנית בשיטת הרכישה MS כדי לבצע רכישה תלויי-נתונים (DDA) כמו רובה רגיל פרוטאומיקס ניסויים. מחזור חיים מכשיר צריך לסירוגין סריקות מלא MS עם טנדם MS סריקות (או MS/MS) של האותות האינטנסיבי ביותר. השתמש את ההגדרות האופטימליות עבור רץ פרוטאומיקס MS-
    הערה: לקבלת תוצאות בטוח, שימוש מכשירים המסוגלים לבצע לפחות MS מלא לסרוק במצב ברזולוציה גבוהה (למשל orbitrap, זמן-של-טיסה). על כימות מדויק, ודא כי המרווחים בין סריקות MS מלא אינם עוד יותר 3 ס' יותר מחזורי עשוי למנוע הגדרה מדויקת של יון שחולצו chromatograms.
  5. עומס 1-2 µg מדגם אל העמודה HPLC ולהפעיל את שיטת HPLC-MS/MS כפי מתוכנת. עבור כל שכפול ביולוגי לבצע לפחות שתי ריצות עצמאית ולא להתייחס אליהם כמו טכני משכפל.
  6. לאחר MS, לייבא את קבצי raw חבילת תוכנה פרוטאומיקס עבור MS/MS ספקטרה וכימות פפטיד באמצעות כרומטוגרפיה שחולצו. אנו ממליצים על חבילות תוכנה ניתן לבצע יישור כרומטוגרפי של ריבוי MS מפעילה 29 , (ראה טבלה של חומרים) 30.
  7. אם האפשרות זמינה בחבילת התוכנות, לאפשר " התאמה בין הרצפים " לפני הפעלת עיבוד נתונים.
  8. לאחר סיום הניתוח, יצא את הרשימה פפטיד יחד עם הערכים כמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את זרימת העבודה RBR-ID. בשל יעילות נמוכה יחסית crosslinking טכניקה זו, חשוב מאוד לשקול דלדול רמת והן עקביות של האפקט הנצפה (P -ערך) על פני משכפל ביולוגי. איור 2 מציג את חלקת הר געש כתוצאה RBR-ID. פפטידים חפפו RNA זיהוי מוטיב (RRM) תחום מציגים רמה גבוהה עקבית דלדול. RRM תחומים יכול לשמש כפקד חיובי לניתוח RBR-ID.

RBR-ID ניתן למפות RBRs בתאים חיים. ציון RBR-ID ניתן לחשב עבור כל פפטיד להעריך את פוטנציאל RNA מחייב: ציון RBR-ID = - כניסה2(מנורמל + 4SU עוצמת/מנורמל-4SU עוצמת) x (יומן10(P -ערך))2. איור 3 מראה של heatmap עשרות RBR-ID מוקרן על פני השטח של יחידת משנה spliceosomal U1 - 70 k. צבע אדום בהיר בסביבה של הקשר RNA, כפי שנקבע מן המבנה קריסטל, מציין זיהוי נכון של אינטראקציה חלבון-RNA.

זיהוי של הרומן RBPs ועל RBRs שלהם, מומלץ מאוד כי פעילותם RNA מחייב להיות מאושרות על ידי שיטה עצמאית. שלנו הקודם המחקר24, אנחנו המזוהה TET2 בתור רומן RBP, למפות את פעילות ה-RNA-איגוד אזור C-מסוף, כפי שמוצג באיור 4A ידי התוצאה RBR-ID לאורך הרצף העיקרי של החלבון. איור 4B מראה כי הדרישה הרומן הזה RBR היתה אפשרות לאמת על ידי ביצוע PAR-קליפ26 באמצעות הרצף WT ומשווה את האות של מוטציה חסר את RBR החזוי. הסבר מפורט יותר של הניסוי הזה אימות ובקרה נוספים זמינים ב הוא. et al. 201624.

Figure 1
איור 1: סקירה RBR-ID. עכבר ESCs שטופלו 4SU או לא (1 - 2) וכן מוקרן עם nm 312 UV (3). גרעינים בודדים (4) הינם תמציות מתעכל ועם פרוטאז נוקלאז, מניב פפטידים תפור והן uncrosslinked (5). RNA קוולנטיות adducts ב crosslink האתרים לשנות את המסה פפטיד, המוביל לירידה המתאימים האינטנסיביות של ספקטרום המונית של פפטיד uncrosslinked (6, חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: פרוטאום ברוחב RBR-ID ב- mESCs. הר הגעש מתווה בסה כ מציג יומן קיפול לשינויים בעוצמות פפטיד על ציר x והסטודנט t-מבחן ערכי P -בציר y לטיפולי 4SU ± (312 ננומטר). פפטידים חופפים המבואר RRM תחומים הם בצבע כחול. פפטיד RNA-איגוד מ HNRNPC מסומן באדום. בעבר פורסם ב. ואח 2016 הוא24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: RBR-ID ממפה את האתרים של אינטראקציות חלבון – RNA. שהתצוגה באזורים של מבנה הגביש U1 snRNP (PDB מזהה: 4PJO31) מציג חלבון משטחים המקודדים על-פי הניקוד RBR-ID שלהם ואינטראקציה RNAs עבור U1 - 70 K. בעבר פורסם ב. ואח 2016 הוא24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: אימות של RBR של TET2. רצף הראשי (A) ותחומים ידוע עבור TET2; ציון RBR-ID שאריות ברמת מוחלקים להתוות לאורך הרצף הראשי (באמצע); ערכה של פרגמנט מתויג epitope תחום קטליטי (CD) וקבועים שנמחקו RBR (CDΔRBR) נעשה שימוש עבור אימות (למטה). (B) נקוב-קליפ של ביטוי transiently TET2 CD ו ΔCDΔRBR בתאים HEK293. Autoradiography עבור 32RNA התווית על-ידי P (למעלה), שליטה תספיג (למטה). בעבר פורסם ב. ואח 2016 הוא24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים פרוטוקול נסיוני מפורט לביצוע RBR-ID mESCs ו, עם והתאמות, בתוך כל תא שאינו ניתן לשלב 4SU RNA. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה של הגישה כדי להבטיח קליטה מספיק רעש יחס. בנוסף, בעוד הפרוטוקול המתוארים בזאת מתמקדת על הבחינה של גרעיני RBPs, הטכנולוגיה RBR-ID צריך להיות מותאם בקלות תאים הסלולר שונים, כגון ציטוזול או organelles מסוים, על ידי שימוש fractionation שונים אסטרטגיות. פרמטרים שיחייבו המיטוב כוללים ריכוז 4SU וזמן התאגדות, כמו גם את האנרגיה של UV crosslinking. פרמטרים אלה חשובים להבטיח מערך יעיל של RNA-חלבון crosslinks תשואה אות לרעש יחס משביע רצון. הראינו כי 312 אור UVB ננומטר הוא הרבה יותר יעיל ב crosslinking המכילות 4SU RNAs חלבונים לעומת 365 UVA המשמש בדרך כלל PAR-קליפ32ננומטר. ישיר השוואה של RBR-ID הופיעה עם 312 nm ו 365 nm הפגינו זה 312 nm UVB גרמו הזיהוי של חלק גדול יותר של RBPs ידוע24.

שתי שיטות נוספות זמינות לבצע זיהוי RBP פרוטאום ברוחב. אחד, הנקרא RBDmap, דומה RBR-ID, כי הוא מנצל UV crosslinking, גב' RBDmap שימש לזיהוי RBPs ולמפות פעילותם RNA מחייב הלה תאים23. שיטה זו מסתמכת על זיהוי ודאי של פפטידים סמוך לאתרים RNA מחייב ומסתמך על שני oligo רציפים-dT למשוך ומורדות, טוען שיכול להיות שזה קצב נמוך יותר חיובי כוזב מאשר RBR-מזהה עם זאת, המרעה למשוך לאפשר רק הזיהוי של RBPs לאגד תיקים עשויים + RNA, דורשים כמויות גדולות של חומר קלט, עד 10 - 100 פעמים יותר מאשר RBR-תעודת זהות RBR-ID יכול להתבצע עם מעט ככל 5 µg של חלבון ליום שכפול ביולוגיים (µg ~ 2 לכל שכפול טכניים), אשר ניתן לאסוף מ כמה כתאי 250,000.

השיטה השנייה, כינה סונאר, מסתמך על כריית נתונים של חלבון גדול אינטראקציה עם מסדי נתונים כדי לזהות חלבונים זה לעתים קרובות שותף לטהר עם RBPs ידוע, אשר אינטראקציה עם RBPs האלה עשוי להיות בתיווך ולכן RNA18. גישה חכמה זו היא חזקה מאוד, מאפשר זיהוי RBPs הרומן מבלי לבצע כל ניסוי מעבדה רטוב, ובלבד מתאימים מסדי נתונים זמינים; עם זאת, זה לא יכול לחשוף את האתרים אינטראקציה, לכן היא משלימה אבל לא חלופי RBR-תעודת זהות

לסיכום, הטכניקה RBR-ID שלנו יכולים לזהות RBPs הרומן ולמפות שלהם RBRs עם כמויות מדגם קלט מוגבל, ללא צורך בכל טיהור הביוכימי של מתחמי תפור חלבון-RNA. הטכניקה אין הנחה על הסוג של RNA מחוייב RBPs מזוהה הנסיעה ולכן ניתן למפות את פעילות האיגוד RNA חלבונים לאגד הלא-polyadenylated, רבים מהם הם noncoding, רומז RBR-ID יצליח. להוכיח טכניקה שימושית כדי ללמוד תפקידים הרגולציה של noncoding RNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

R.B. נתמכה על ידי התוכנית מלומדים סירל קרן סמית וו (C1404), הצעדה של מטבעות קרן (1-שנות כספים-15-344). שקית מאשר תמיכה של NIH מעניקה R01GM110174 ו- NIH R01AI118891, כמו גם משרד ההגנה הענק BC123187P1. סיפורם-טי נתמך על ידי מענק הכשרה-NIH T32GM008216.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KnockOut DMEM Fisher Scientific 10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin Fisher Scientific 26140079
L-Glutamine solution 200 mM Sigma G7513
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1106
CHIR99021 Tocris 4423
PD0325901 Sigma PZ0162
Gelatin solution,2% in water Sigma G1393
4-thiouridine Sigma T4509 50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500 Fisher Scientific 11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma 78830
IGEPAL CO-630 Sigma 542334 Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide Sigma I6125
Trypsin, sequencing grade Promega V5111
Empore solid phase extraction disk 3M 66883
OLIGO R3 Reversed - Phase Resin Fisher Scientific 1133903
Benzonase Sigma E8263 High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100 Fisher Scientific discontinued updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
TFA Fisher Scientific A11650
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Acetic Acid Sigma 49199
Formic Acid Sigma F0507
ReproSil-Pur 18-AQ Dr. Maisch GmbH HPLC r13.aq.0003 Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm) Molex 1068150017
MaxQuant software Max Planck Institute for Biochemistry Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
  2. Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
  3. Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
  4. Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
  5. Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
  6. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  7. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  8. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
  9. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  10. Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
  11. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  12. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  13. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  14. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
  15. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
  16. Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
  17. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
  18. Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
  19. Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
  20. Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
  21. Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
  22. Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
  23. Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  24. He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
  25. Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
  26. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  27. Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
  28. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  29. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  30. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  31. Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
  32. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).

Tags

ביוכימיה גיליון 127 אינטראקציות חלבון-RNA תחום מחייב RNA אזור ה-RNA מחייב ספקטרומטר מסה noncoding RNAs UV crosslinking
הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warneford-Thomson, R., He, C.,… More

Warneford-Thomson, R., He, C., Sidoli, S., Garcia, B. A., Bonasio, R. Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions. J. Vis. Exp. (127), e56004, doi:10.3791/56004 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter