Summary
Vi beskriver en protokoll for å identifisere RNA-bindende proteiner og tilordne sine RNA-bindende regioner i levende celler ved hjelp av UV-mediert photocrosslinking og massespektrometri.
Abstract
Noncoding RNAs spille viktige roller i flere kjernefysisk prosessene, inkludert regulere genuttrykk, chromatin struktur og DNA-reparasjon. I de fleste tilfeller er av noncoding RNAs formidlet av proteiner med funksjoner som igjen er regulert av disse interaksjoner med noncoding RNAs. I samsvar med dette, et økende antall proteiner involvert i kjernefysiske funksjoner har blitt rapportert å binde RNA og i noen tilfeller regionene RNA-binding av disse proteinene er tilordnet, ofte gjennom arbeidskrevende, kandidat-baserte metoder.
Vi rapporterer her en detaljert protokoll for å utføre en høy gjennomstrømning og proteom hele objektiv identifikasjon av RNA-bindende proteiner og deres RNA-bindende områder. Metodene er avhengig av inkorporering av en photoreactive uridine analog i den cellulære RNA, etterfulgt av UV-mediert protein-RNA crosslinking og massespektrometri analyser å avsløre RNA-krysskoblet peptider i proteom. Selv om vi beskriver fremgangsmåten for mus embryonale stamceller, bør protokollen være lett tilpasses en rekke kulturperler celler.
Introduction
Formålet med metoden RBR-ID er å identifisere romanen RNA-bindende proteiner (RBPs) og kart sine RNA-bindende regioner (RBRs) med peptid nivå oppløsning til rette for design av RNA-bindende mutanter og undersøkelsen av biologiske og biokjemiske funksjoner av protein-RNA interaksjoner.
RNA er unik blant biomolecules som det kan både fungere som en budbringer bærer genetisk informasjon og også kaste i komplekse tredimensjonale strukturer biokjemiske funksjoner mer lik de av proteiner1,2. En voksende mengde bevis antyder at noncoding RNAs (ncRNAs) spille en viktig rolle i ulike genet regulatoriske og epigenetic veier3,4,5 , og vanligvis disse regulatoriske funksjonene er formidlet i konsert med proteiner som samhandler med en gitt RNA. Av spesiell relevans, ble et sett av samspill proteiner nylig oppdaget for intenst studerte lang ncRNA (lncRNA) Xist, gir verdifull innsikt i hvordan dette lncRNA formidler X-chromosome inaktivering i kvinnelige celler6,7 ,8. Spesielt, flere av disse Xist-samspill proteiner inneholder ikke noen kanoniske RNA-bindende domener9, og derfor deres RNA-binding aktivitet kunne ikke forventet i sili basert på deres primære sekvens alene. Tatt i betraktning at tusenvis av lncRNAs er uttrykt i en gitt celle10, er det rimelig å anta at mange av dem kan handle via interaksjon med ennå ikke oppdaget RNA-bindende proteiner (RBPs). En eksperimentell strategi å identifisere disse romanen RBPs derfor stor grad vil lette oppgaven med å dissekere den biologiske funksjonen for ncRNAs.
Tidligere forsøk på å identifisere RBPs empirisk avhengig polyA + RNA utvalg kombinert til massespektrometri (MS),11,,12,,13,,14,,15. Selv om disse eksperimentene lagt mange proteiner i listen over mulige RBPs, av design de finner bare proteiner bundet til polyadenylated utskrifter. Men er de fleste små RNAs og mange lncRNAs ikke polyadenylated. 16 , 17 og deres samspill proteiner ville sikkert ha vært savnet i disse eksperimentene. En fersk studie brukt maskinlæring protein-protein interactome databaser å identifisere proteiner som co renset med flere kjente RBPs og viste at disse tilbakevendende RBP partnere var mer sannsynlig å ha RNA-bindende aktiviteter18. Men denne tilnærmingen avhengig gruvedrift eksisterende store interaksjon databaser og kan kun identifisere proteiner som kan være co renset i ikke-denaturing forhold med kjente RBPs, dermed unntatt fra analyse uløselig membran-embedded og knappe proteiner.
Identifikasjon av et protein som en bona fide RBP ofte gir ikke informasjon om biologisk og/eller biokjemiske funksjonen av protein-RNA samhandlingen automatisk. For å løse dette punktet, er det vanligvis ønskelig å identifisere protein domene og aminosyre rester i samhandlingen slik at bestemte mutanter kan utformes til å teste funksjonen av RNA binding i forbindelse med hver romanen RBP19, 20. forrige innsats av vår gruppe og andre har brukt rekombinante proteinfragmenter og sletting mutanter for å identifisere RNA bindende områder (RBRs)19,20,21,22; men er disse arbeidskrevende og inkompatibel med høy gjennomstrømming analyser. Flere nylig, en studie beskrevet en eksperimentell strategi for å tilordne RNA-bindende aktiviteter i en høy gjennomstrømming mote bruker massespektrometri23; men denne tilnærmingen avhengig av et dobbelt polyA + RNA utvalg, og dermed bar de samme begrensningene som RBP identifikasjon nærmer seg beskrevet ovenfor.
Vi utviklet en teknikk, kalt RNA bindende område-IDen RBR-, som utnytter protein-RNA photocrosslinking og kvantitative massespektrometri å identifisere proteiner og protein regioner samarbeidsstil RNA i levende celler uten å gjøre Forutsetningen om RNA polyadenylation status, dermed inkludert RBPs bundet til polyA-RNAs24. Videre denne metoden avhenger utelukkende på crosslinking og har ingen krav på protein løselighet eller tilgjengelighet og er derfor egnet til å tilordne RNA-bindende aktiviteter innen membraner (f.eks den kjernefysiske konvolutten) eller dårlig løselig rom ( f.eks kjernefysiske matrix). Beskriver vi eksperimentelle trinnene for å utføre RBR-ID for kjerner i mus embryonale stamceller (mESCs), men med mindre modifikasjoner denne protokollen bør være egnet for en rekke celletyper, forutsatt at de kan effektivt innlemme 4SU fra kulturen medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur og utvidelse av mESCs
Merk: mus embryonale stamceller er enkle å kultur og raskt kan utvides til den store tall som kreves av biokjemiske eksperimenter takket være rask sykling tiden. Sunn mESCs dobbel hver 12 h.
- Utvid mESCs til ønsket nummeret på gelatinized plater i mESC medium (se nedenfor) i en vev kultur inkubator holdt på 37 ° C, 5% CO 2, og > 95% fuktighet.
Merk: Nok plater bør være forberedt på 3-5 biologiske gjentak for den + 4SU utvalg og -4SU. En 10 cm plate (dvs. 5-10 millioner celler) er mer enn nok for hver biologiske replikere. - Medium for mESCs består av Dulbecco ' s endret Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 15% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 0.5 x penicillin/streptomycin, 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 100 µM beta-mercaptoethanol, 1000 U /mL leukemi hemmende faktor (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
- Før passaging mESCs, forberede ønsket antall 10 cm plater.
- Legge 4 mL av 0,1% i vann sørge for at hele overflaten av platen er dekket, ruge i 10 min ved romtemperatur (RT), fjerne gelatin løsning.
- Passasje celler når de når ~ 10 millioner celler per plate, vanligvis ~ 48 h etter vaksinering.
Merk: Som mESCs vokser i tett koloniene, plater bør aldri tillates å nå 100% confluency som observert i linjer som vokser i monolayers (f.eks HEK293 eller 3T3 celler). En mESC plate bør være passaged når ~ 50% confluent og definitivt før mediet blir gul.- Koble celler, vaske plater med tett mESC kulturer i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) med 2 mM EDTA, og legge til 0,05% trypsin oppløst i DMEM og returnere platen til inkubator i 5 min (37 ° C, 5% CO 2, og > 95% fuktighet).
- Fjern plate fra inkubator og resuspend celler med like volum av DMEM av pipettering opp og ned kraftig flere ganger.
- Teller celler ved hjelp av hemocytometer og sikre at cellene danner en enkeltcelle suspensjon (dvs. ingen klynger), deretter sentrifuge celle blanding 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 1-2 mL DMEM.
- Vaksinere cellene på en tetthet av 10.000 celler/cm 2 i mESC medium (dvs. ~ 800 000 celler per 10 cm plate) bruker gelatin-belagt plater i trinn 1.3.1.
2. Krysskobling av Protein – RNA interaksjoner i Live celler
Merk: RNA-protein crosslinking er formidlet av den Foto-activatable ribonucleoside analoge 4-thiouridine (4SU). 4SU har en lengre absorbansen maksimal enn endogene nukleotider kan bare inkluderes i RNA; mellomliggende-bølgelengde UVB kan derfor brukes til selektivt krysskobling RNA til proteiner 25 , 26. UVB behandling av 4SU-behandlet celler fører til kovalente krysskoblinger mellom 4SU inneholder RNA og aminosyrer, rapporterte foretrekker Tyr, Trp, Met, Lys og Cys 27.
- Vis mESCs å det krevde antallet av 10 cm plater som beskrevet i trinn 1.
Merk: Nok plater bør være forberedt på 3-5 biologiske gjentak for den + 4SU utvalg og -4SU. En 10 cm plate (dvs. 5-10 millioner celler) er tilstrekkelig for hver biologiske replikere. - Før platene kommer confluency, legge 4SU direkte til medium en siste konsentrasjon av 500 µM. forlate - 4SU kontroll retter ubehandlet.
- Shake plater forsiktig å distribuere 4SU homogent gjennom mediet. Returnere dem til samme vev kultur inkubator for 2t (37 ° C, 5% CO 2, og > 95% fuktighet).
- Overføre plater til en isen bøtte og kast medium.
- Skyll platen forsiktig med 5 mL av iskalde PBS.
Merk: Skyll forsiktig eller celler kan løsne. - Legge 2 mL iskald PBS og sted plater uten lokk i et crosslinker utstyrt med UVB-emitting pærer (312 nm). Irradiate plater på en energi innstillingen 1 J/cm 2.
Merk: Det er viktig at plast lokk fjernes, eller de kan skjerme cellene fra UV lys og hindre crosslinking. - Samle celler ved hjelp av cellen løftere og overføre til iskald PBS i konisk rør. Sentrifuger 2000 x g i 5 min, 4 ° C.
- Fjerne nedbryting og resuspend celle pellet i 5 mL iskald PBS med 2 mM EDTA og 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF).
- Antall celler ved hjelp av en hemocytometer. Forventer 5-10 og 10-20 millioner celler fra 10 cm og 15 cm henholdsvis.
- Sentrifuge 2000 x g for 5 min, 4 ° C.
Merk: Pelleted celler kan bli brukt for trinn 3 eller de kan flash-frosne i flytende nitrogen og lagret ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potensiell stoppunktet.
3. Isolering av kjerner
Merk: kjerner er isolert fjerne cytoplasmatiske proteiner og øke dekning av kjernefysiske proteiner. Dette trinnet kan erstattes med andre former for mobilnettet fraksjoneres å studere RBPs i forskjellige mobilnettet avdelinger.
- Forberede iskald bufferen en (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1, 5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Bruk minst 2,5 mL per 10 millioner celler (som telles i trinn 2.9) for utvinning.
Merk: Aksjer bufferen A (f.eks en 500 mL flaske) kan forberedt på forhånd og lagret på 4 ° C i 6 måneder.- Før bruk, Legg til 0,5 mM dithiothreitol (DTT) og 0.2 mM PMSF til den ønskede mengden (2.5 mL per 10 millioner celler) av iskalde buffer A.
- Vask celler med 2 mL Buffer A per 10 millioner celler. Spinn på 2500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Forkast nedbryting, legge til Buffer A med 0,2% av et ikke-ionisert, ikke-denaturing vaskemiddel, som octyl-phenoxy-polyethoxy-etanol (se Tabell for materiale), 500 µL per 10 millioner celler. Roter i 5 min på 4 ° C.
- Sentrifuger 2500 x g i 5 min.
- Fjerne nedbryting, pellet omfatter intakt kjerner uten cytoplasma.
Merk: Kjerner kan brukes umiddelbart for trinn 4 eller flash-frosne i flytende nitrogen og lagret ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potensiell stoppunktet.
4. Lysis av kjerner
Merk: krysskoblet kjerner er lysed i en masse massespektrometri-kompatible buffer å løslate proteiner og protein-RNA komplekser.
- Add lyseringsbuffer (9 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C) 200 µL per 10 millioner celler. Sonicate hvis du vil skråstille chromatin ved hjelp av en 1/8 " undersøke på 50% amplituden innstillingen for 5-10 s.
- Spinn på 12.000 x g i 5 min og samle 175 µL av nedbryting å unngå pellet.
Merk: 100 µL skal brukes for de neste trinnene for RBR-ID og de resterende 75 µL av lysate kan lagres ved-80 ° C for senere bruk og/eller western blot analyse. - Mål protein konsentrasjon via Bradford analysen eller lignende teknikk 28. Fortynne protein konsentrasjonen i de forskjellige prøvene å 1 mg/mL eller den laveste eksempel konsentrasjonen bruke riktige mengder lyseringsbuffer.
Merk: Fra kjerner i 10 millioner mESCs forventer 100-200 µg protein.
5. Trypsin fordøyelsen
Merk: proteiner er digested for å generere peptider suitable for opp-massespektrometri (MS) analyse.
- Legge til DTT løsning kjernefysiske lysate (5 mm endelige); ruge 1t på RT.
- Legge til iodoacetamide fra ferske lager (14 mM endelige); ruge i 30 min på RT i mørket.
- Dilute lysate med 5 ganger volum på 50 mM NH 4 HCO 3
- Legge til trypsin (µg protein: µg trypsin = 200:1); ruge på 37 ° C over natten.
6. Avsalte av peptider
- forbereder en skreddersydd scenen tips per prøve.
- 6.1.1. Plasser en disk av solid fase utvinning C18 materiale i bunnen av en 200 µL pipette tips.
- Legge til 50 µL av oligo R3 reversert fase harpiks på C18 disken. Scenen tips inne sentrifugering adapter og sted spissen med adapter inne en 1,5 mL microfuge tube.
- Legge til 100 µL 100% acetonitrile til tips å vaske. Sentrifuger 1000 x g for 1 min fjerne løsemiddelet.
- Likevekt med 50 µL 0,1% trifluoroacetic syre (TFA). Sentrifuger 1000 x g i 1
- Legge til 100% maursyre fordøyd protein prøve å senke pH 2-3.
Merk: Dette bør kreve ~ 5 µL per 1 mL av utvannet peptid prøven, men pH skal måles og mer formic syre lagt eventuelt. - Load utvalg på skreddersydde scenen tips, sentrifuge 1000 x g for 1 min før alle prøve går gjennom tipset.
- Vask bundet peptider med 50 µL 0,1% TFA. Sentrifuger 1000 x g i 1
- Elute peptider ved å legge til 50 µL elueringsbufferen (75% acetonitrile, 0.025% TFA) scenen tips og sentrifuger 1000 x g for 1 min å tvinge elueringsbufferen av spissen.
- Tørr prøven ved hjelp av et vakuum sentrifuge satt på 150 x g og 1-3 kPa for 1 h.
Merk: Tørket peptider kan lagres ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potensiell stoppunktet.
7. Fjerning av krysskoblet
Merk: behandle peptider med nuclease fjerne krysskoblet RNA.
- Resuspend pellet i 50 µL 2 x nuclease buffer (100 mM NH 4 HCO 3 4 mM MgCl 2).
- Mål peptid konsentrasjon bruke absorbansen på 280 nm forutsatt 1 mg/mL av peptider for en A 280 1.
Merk: Forventet konsentrasjonen er 1 mg/mL. - Justerer alle prøver å 1 mg/mL eller laveste konsentrasjonen med 2 x nuclease buffer.
- Forberede en master blanding av 50 µL H 2 O + 1 µL høy renhetsgrad nuclease (≥ 250 U) (se Tabell for materiale) per prøve.
- Ta 50 µL av peptid prøve og legge 50 µL av H 2 O + nuclease master mix.
- Incubate på 37 ° C i 1 h. Fortsett å utføre massespektrometri.
Merk: Peptidene er nå klar for massespektrometri. De kan analyseres umiddelbart eller lagret ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potensiell stoppunktet.
8. Nano flytende Ture, massespektrometri og ømt punkt databehandlingen
Merk: fordi 4SU-crosslinking endres masse av peptid, deres ioner teller ikke mot intensiteten av ikke-krysskoblet peptid under LC-MS/MS, som derfor synes å være redusert med crosslinking. Grad og konsekvens av denne nedgangen gjenspeiler graden av protein-RNA crosslinking hver peptid 24.
- Forberede HPLC buffere som følger: 0,1% maursyre i HPLC-grade vann (buffer A); 0,1% maursyre i HPLC-klasse acetonitrile (Buffer B).
- Hvis en nano-HPLC tilgjengelig, koble en nano-kolonne med følgende spesifikasjoner: interne diameter 75 µm; fullpakket med C18-AQ partikler; lengde 20-25 cm.
Merk: Hvis HPLC tilgjengelig kjører på høyere flyt priser bruke en riktig kolonnestørrelsen for angitte flow rate. Høyere flyt kromatografi reduserer sensitivitet. - Program metoden HPLC som følger: flow rate 250-300 nL/min, gradient fra 2 til 28% buffer B i 120 min, fra 28 til 80% B for de neste 5 min og isocratic 80% B for 10 min.
Merk: Hvis HPLC ikke har en automatisert kolonnen balanse tidligere eksempel lasting, må du starte programmet med 10 min på 0% B før lasting prøven. - Program MS anskaffelsesmetoden utføre data-avhengige oppkjøp ("BMH") som standard hagle Proteomikk eksperimenter. Driftssyklus instrument bør alternative fulle MS skanninger med tandem MS skanner, eller MS-/ MS mest intense signaler. Bruker de optimale innstillingene for Proteomikk MS kjører.
Merk: For trygg resultater, bruke instrumenter som kan utføre minst full MS skanne i høy oppløsningsmodus (f.eks orbitrap, tid-av-fly). For nøyaktig kvantifisering, sørg for at intervallene mellom full MS skanner er ikke lenger enn 3 s. lengre plikt sykluser kan hindre nøyaktig definisjon av utdraget ion chromatograms. - Laste 1-2 µg av prøven på kolonnen HPLC og kjører metoden HPLC--MS-/ MS som programmert. For hver biologiske replikere utføre minst to uavhengige kjører og behandle dem som teknisk gjentak.
- Etter MS, importere raw-filer til en Proteomikk programvarepakke for MS-/ MS spectra identifikasjon og peptid kvantifisering via utdraget ion kromatografi. Vi anbefaler programvarepakker kan utføre brukt kromatografiske justering av flere MS kjører (se Tabell for materiale) 29 , 30.
- Hvis alternativet er tilgjengelig i programvarepakken, aktivere " kamp mellom går " før du starter databehandling.
- Når analysen er ferdig, eksportere listen peptid sammen med kvantifisering verdiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser RBR-ID arbeidsflyten. Fordi relativt lav crosslinking effektiviteten av denne teknikken er det svært viktig å vurdere både uttømming nivå og konsistensen av observerte effekten (P -verdi) over biologiske gjentak. Figur 2 viser en vulkan tomt RBR-ID resultatet. Peptider som overlappes RNA anerkjennelse motiv (RRM) domene Vis svært konsekvent uttømming nivå. RRM domener kan brukes som en positiv for RBR-ID analyse.
RBR-ID kan brukes til RBRs i levende celler. En RBR-ID score kan beregnes for hver peptid å anslå RNA-bindende potensial: RBR-ID poeng = - logge2(normalisert + 4SU intensitet/normalisert-4SU intensitet) x (Logg10(P -verdi))2. Figur 3 viser en heatmap RBR-ID score projisert på overflaten av spliceosomal delenhet U1 - 70 k. Den lyse røde fargen i nærheten av RNA kontakten, angir som bestemmes av krystallstruktur, riktig identifikasjon av protein-RNA samhandlingen.
Identifikasjon av Roman RBPs og deres RBRs, er det sterkt anbefalt at deres RNA-binding aktivitet bekreftes av en uavhengig metode. I vår forrige studie24, vi identifisert TET2 som en roman RBP og tilordnet RNA-bindende aktiviteten til en C-terminalen region, som vist i figur 4A ved å plotte RBR-ID score langs primære sekvensen av protein. Figur 4B viser at behovet for denne romanen RBR kan kontrolleres ved å utføre PAR-klipp26 bruke WT sekvensen og sammenligne signalet for en mutant mangler den anslåtte RBR. Ekstra kontroll og mer detaljert forklaring på dette validering eksperimentet er tilgjengelige i han et al. 201624.
Figur 1: RBR-ID oversikt. Musen ESCs behandles med 4SU eller ikke (1 - 2) og bestrålt med 312 nm UV (3). Kjerner er isolert (4) og ekstrakter fordøyd med protease og nuclease, gir både krysskoblet og uncrosslinked peptider (5). Kovalente RNA addukter på krysskobling nettsteder endre peptid masse, fører til en tilsvarende reduksjon i intensitet av uncrosslinked peptid masse spektrum (6, pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: proteom hele RBR-ID i mESCs. Vulkanen tomter med logge ganger endringer i peptid innhold på x -aksen og Student t-test P -verdier på y -aksen for ± 4SU behandlinger (312 nm). Peptidene overlappende kommenterte RRM domener er i blått. En RNA-bindende peptid fra HNRNPC er uthevet i rødt. Tidligere publiserte han et al. 201624. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: RBR-ID kart nettstedene til protein-RNA interaksjoner. Zoomet inn regioner av krystall U1 snRNP (PDB-ID: 4PJO31) viser protein overflater fargekodede ifølge deres RBR-ID score og samspill RNAs for U1 - 70 K. Tidligere publiserte han et al. 201624. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: validering av RBR av TET2. (A) primære sekvensen og kjente domener for TET2; utjevnet rester nivå RBR-ID score tegnet inn langs den primære sekvensen (midten); og ordningen med epitope-merket katalytisk domene fragment (CD) og RBR slettet (CDΔRBR) konstruksjoner brukes for validering (nederst). (B) PAR-klipp av transiently uttrykt TET2 CD og ΔCDΔRBR i HEK293 celler. Autoradiography 32P-merket RNA (øverst) og kontroll western blot (nederst). Tidligere publiserte han et al. 201624. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en detaljert eksperimentelle protokoll for å utføre RBR-ID i mESCs, og med riktige modifikasjoner, i en celle som kan innlemme 4SU i RNA. Andre celletyper krever optimalisering av tilnærming å sikre et tilstrekkelig signal til støyforhold. I tillegg, mens protokollen beskrevet heri fokuserer på undersøkelse av kjernefysiske RBPs, bør RBR-ID-teknologi være lett tilpasses forskjellige mobilnettet avdelinger, som stoffer eller bestemte organeller, ved bruk av forskjellige fraksjoneres strategier. Parametere som kan kreve optimalisering inkluderer 4SU konsentrasjon og innlemmelse tid samt energien i UV crosslinking. Disse parameterne er viktig å sikre effektiv dannelsen av RNA-protein krysskoblinger og gi et tilfredsstillende signal til støyforhold. Vi har vist at 312 nm UVB lys er mye mer effektiv på crosslinking 4SU inneholder RNAs proteiner sammenlignet 365 nm UVA vanligvis brukes i PAR-klipp32. Direkte sammenligning av RBR-ID utført med 312 nm og 365 nm viste at 312 nm UVB resulterte i identifikasjon av en mye større del av kjente RBPs24.
To andre metoder er utføre proteom-RBP identifikasjon. En, kalt RBDmap, er lik RBR-ID i at den utnytter UV crosslinking og MS. RBDmap ble brukt til å identifisere RBPs og tilordne oppgaver RNA-bindende i HeLa celler23. Denne metoden avhengig av positiv identifikasjon av peptider tilstøtende til RNA-bindende områder og bruker to sekvensiell oligo-dT rullegardinlistene, antyder at det kunne ha en lavere falsk positiv rate enn RBR-ID. Men tillater rullegardinlistene identifikasjonen for RBPs som binder seg til polyA + RNA og krever store mengder input materiale, opptil 10 - 100 ganger mer enn RBR-ID. RBR-ID kan utføres med så lite som 5 µg protein per biologiske replikere (~ 2 µg per tekniske gjenskape), som kan hentes fra løpet av 250 000 celler.
Den andre metoden, kalles SONAR, er avhengig av datamining store protein-protein samhandling databaser å oppdage proteiner som ofte co renser med kjente RBPs og hvis interaksjon med disse RBPs kan derfor være formidlet av RNA18. Denne smarte er veldig kraftig og gir mulighet for identifikasjon av romanen RBPs uten å utføre noen våte lab eksperiment, forutsatt at egnet databaser er tilgjengelig; men det kan ikke avsløre webområdene samhandling og derfor er komplementære men ikke alternativ RBR-ID.
Oppsummert kan våre RBR-ID teknikk identifisere romanen RBPs og kart deres RBRs med begrenset input eksempel beløp og uten noen biokjemiske rensing av protein-RNA krysskoblet komplekser. Teknikken gjør ikke at på typen RNA bundet av de identifiserte RBPs og derfor kan tilordne RNA bindende aktiviteten av proteiner som binder til ikke-polyadenylated, hvorav mange er noncoding, noe som tyder på at RBR-ID kan være en nyttig teknikk å studere den regulatoriske rollene til noncoding RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
R.B. ble støttet av den Searle Scholars Program, ww Smith Foundation (C1404) og mars Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G anerkjenner støtte fra NIH gir R01GM110174 og NIH R01AI118891, og DOD gi BC123187P1. R.W.-T. ble støttet av NIH trening grant T32GM008216.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
