Summary
우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
Noncoding RNAs 유전자 발현, chromatin 구조, 및 DNA 복구 통제 등 여러 가지 핵 프로세스에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 대부분의 경우에서 noncoding RNAs의 행동은 누구의 기능 차례로 noncoding RNAs와의 이러한 상호 작용에 의해 통제 된다 단백질에 의해 중재 됩니다. 이 일치, 핵 기능에 관련 된 단백질의 증가 RNA를 바인딩할 보고 되었습니다 그리고 몇 가지 경우에이 단백질의 RNA 바인딩 영역 매핑 되었습니다, 자주 힘 드는, 후보 기반 방법을 통해.
여기, 우리는 RNA 의무적인 단백질 및 RNA 바인딩 영역 그들의 높은 처리량, 프로테옴 전체 편견된 식별을 수행 하기 위해 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 방법론 photoreactive uridine 아날로그 세포질 RNA, UV 중재 단백질-RNA 가교 및 질량 분석 분석 공개는 프로테옴 내 RNA-가교 된 펩 티 드에서에서의 설립에 의존 합니다. 마우스 배아 줄기 세포에 대 한 절차를 설명 하 고, 비록 배양된 세포의 다양 한 프로토콜을 쉽게 적응 한다.
Introduction
RBR ID 방법의 목적은 새로운 RNA 의무적인 단백질 (RBPs)를 식별 하 여 펩 티 드 수준 해상도 RNA 바인딩 돌연변이의 디자인 및 생물학 및 생 화 확 적인 조사를 촉진 하기 위하여 그들의 RNA 바인딩 영역 (RBRs) 지도 단백질 RNA 상호 작용의 기능입니다.
RNA는 생체 중 고유 수 모두 유전 정보를 운반 하는 메신저 역할을 하 고도 생화학 기능 단백질1,2의 유사 더 많은 복잡 한 3 차원 구조에 접어. 증거의 성장 시체 noncoding RNAs (ncRNAs) 다양 한 유전자 규정 하는 후 성적인 경로3,,45 에 중요 한 역할을, 일반적으로, 이러한 규정 하는 기능 콘서트 중재는 제안 특히 주어진된 RNA와 상호 작용 하는 단백질 특정 한 관련성의 상호 작용 단백질의 집합 최근 심각 하 게 공부 긴 ncRNA (lncRNA) Xist,이 lncRNA 여성 셀6,7 x 염색체 비활성화를 중재 하는 방법에 대 한 값진 통찰력을 제공에 대 한 확인 되었다 ,8. 특히, 이러한 Xist 상호 작용 단백질의 몇 없는 어떤 정식 RNA 바인딩 도메인9, 그리고 그러므로 그들의 RNA 바인딩 작업 수 없습니다 예측 철에서 혼자 그들의 기본 시퀀스에 따라. LncRNAs의 수천 어떤 주어진된 셀10표현 됩니다 고려, 아직 될 RNA 의무적인 단백질 (RBPs) 발견 그들 중 많은와 상호 작용을 통해 행동 수도 있습니다 가정 하는 합리적입니다. 이러한 소설 RBPs 식별 하는 실험적인 전략 것입니다 따라서 크게 용이 하 게 ncRNAs의 생물 학적 기능 해 부의 작업.
RBPs 경험적으로 식별 하는 이전 시도 polyA + RNA 선택 질량 분석 (MS)11,12,13,,1415에 결합에 의존 했습니다. 비록이 실험 상 상속 RBPs의 목록에 많은 단백질을 추가, 디자인에 의해 그들은 감지할 수 단백질 polyadenylated 성적표에 바인딩된. 그러나, 대부분의 작은 RNAs 및 많은 lncRNAs polyadenylated 되지 않습니다. 16 , 17 그리고 그들의 상호 작용 단백질 것 가능성이 되었습니다 놓친이 실험에서. 최근 연구 공동 여러 알려진된 RBPs와 정화 하 고 이러한 재발 RBP 파트너 RNA 바인딩 활동18보유 가능성이 것으로 나타났다 단백질을 식별 하기 위해 단백질-단백질 위하여 데이터베이스에 기계 학습을 적용. 그러나,이 방법은 기존의 큰 상호 작용 데이터베이스 마이닝에 의존 하며만 공동 알려진된 RBPs, 따라서 불용 성, 막 임베디드 및 부족 한 분석에서 제외 된 비 변성 시키기 조건에 순화 될 수 있는 단백질을 확인할 수 있습니다. 단백질입니다.
Id는 단백질의 한 진실 fide RBP로 종종 단백질 RNA 상호 작용의 생물학 및 생 화 확 적인 기능에 대 한 정보를 자동으로 생성 하지 않습니다. 해결 하기 위해이 시점, 그것은 일반적으로 특정 돌연변이 각 소설 RBP19, 의 맥락에서 RNA 바인딩 기능을 테스트 하도록 설계 된 수 수 있도록 단백질 도메인 및 아미노산 잔류물 상호 작용에 관련 된 식별 하는 것이 좋습니다. 20. 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 이전 노력 사용 재조합 형 단백질 파편 삭제 돌연변이 RNA 바인딩 영역 (RBRs)19,20,,2122;을 식별 하 그러나, 이러한 접근은 노동 집약 및 높은 처리량 분석와 호환 되지 않는. 더 많은 최근 연구 질량 분석23;를 사용 하 여 높은 처리량 패션에서 RNA 바인딩 활동을 지도 하는 실험적인 전략 설명 그러나,이 방법은 이중 polyA + RNA 선택에 의존 하 고 따라서 위에서 설명한 RBP 식별 방식으로 동일한 제한 실시.
우리 나 RNA 바인딩 영역 id RBR-, photocrosslinking 단백질-RNA와 단백질 및 단백질 영역 만들기 없이 라이브 세포에서 RNA 상호 작용을 식별 하기 위해 양적 질량 분석을 이용 하는 기술 개발 RNA polyadenylation 상태에 가정, polyA RNAs24에 바인딩된 따라서 RBPs를 포함 한. 또한,이 방법은 가교를 독점적으로 의존 단백질 가용성 또는 액세스 가능성 요구 사항은 없습니다 고 따라서 내 막 (예: 핵 봉투) 또는 가난 하 게 녹는 구획 (RNA 바인딩 활동 지도에 적합 예를 들어 핵 매트릭스)입니다. 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 핵에 대 한 RBR-ID를 수행 하는 실험 단계 설명 하지만 사소한 수정이 프로토콜 적합 해야한다 다양 한 세포 유형, 그들은 효율적으로 문화에서 4SU를 통합할 수 있는 중간입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 문화 및 mESCs의 확장
참고: 마우스 배아 줄기 세포 문화에 쉽게 하 고 그들의 빠른 사이클 시간 덕분에 생 화 확 적인 실험에 필요한 큰 숫자를 신속 하 게 확장 될 수 있다. 건강 한 mESCs 더블 모든 12 헤
- 매체 (아래 참조) 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° c, 5% CO 2, 보관 및 > 95% 습도.
참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)는 각 생물 복제에 게 충분 한 것 보다 더.
- 확인 접시의 전체 표면을 커버 하 고 물에 0.1% 젤라틴의 4 개 mL를 추가, 실 온 (RT)에서 10 분 동안 품 어, 젤라틴 솔루션 제거.
참고: mESCs 조밀한 식민지에서 성장, 접시 결코 허용 되어야 한다 monolayers (예: HEK293 또는 3T3 세포)에서 성장 하는 세포 라인에 대 한 관찰로 100 %confluency 도달. ~ 50 %confluent 매체 전에 확실히 노란색 때 mESC 접시를 passaged 해야 합니다.
- 셀을 분리 하려면
- 1 x 2 mM EDTA, 보충 버퍼링 인산 염 (PBS)에 한 번 밀도 mESC 문화 접시를 씻어 다음 0.05% trypsin DMEM에 녹아 추가 하 고 5 분 동안 인큐베이터에 접시를 반환 (37 ° C, 5% CO 2, 그리고 > 95% 습도).
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 적극적으로 여러 번 위아래로 pipetting으로 DMEM의 동등한 양으로 셀 resuspend.
- Hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 단일 세포 현 탁 액을 형성 있도록 (즉, 없음 클러스터), 다음 실 온에서 5 분에 대 한 셀 혼합 500 x g 원심. 상쾌한을 제거 하 고 1-2 ml DMEM 셀 펠 릿 resuspend.
- MESC 매체 (즉 800000 ~ 10 cm 접시 당 세포)에 10, 000 셀/c m 2의 조밀도에 세포를 접종 준비 단계 1.3.1에서에서 젤라틴 코팅 접시를 사용 하 여.
2. 단백질 Crosslink – 라이브 세포 상호 작용 RNA
참고: RNA-단백질 가교는 사진-활성화 ribonucleoside 아날로그 4-thiouridine (4SU)에 의해 중재입니다. 4SU는 내 생 보다 더 흡수도 최대 뉴클레오티드 RNA;로 통합 될 수 있다 고 따라서 중간 파장 UVB는 선택적으로 crosslink RNA 단백질 25 , 26를 사용할 수 있습니다. 4SU 치료 세포의 UVB 치료 리드 화학식 crosslinks에 4SU 포함 된 RNA 및 Tyr에 대 한 보고 선호와 아미노산 사이 Trp, 메트로, 리스, 그리고 Cys 27.
- .
참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)은 각 생물 복제에 대 한 충분 한.
참고: 부드럽게 린스 또는 셀 분리 수 있습니다.
참고: 그것은 플라스틱 뚜껑 제거 하거나 자외선 으로부터 세포를 보호 하 고 가교를 방지 수 중요.
참고: 수송과 세포 수 있습니다 즉시 사용 3 단계 또는 플래시-액체 질소에서 냉동 하 고 무기한-80 ° C에서 저장 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.
3. 핵의 절연
참고: 핵 세포질 단백질을 제거 하 고 핵 단백질의 범위를 증가에 격리 됩니다. 이 단계는 다른 세포질 격실에서 RBPs 공부 세포 분별 법의 다른 형태와 대체 될 수 있다.
- 준비 얼음 감기 (10 mM Tris HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 m m MgCl 2, 10mm KCl) 버퍼. 10 백만 셀 (으로 단계 2.9에서에서 계산) 당 적어도 2.5 mL를 사용 하 여 추출.
참고: 버퍼 A의 주식 (예를 들면: 500 mL 병) 미리 준비 고 6 개월 동안 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. - 사용 전에 0.5 m m dithiothreitol (DTT)와 0.2 밀리미터 PMSF 차가운 버퍼 A. 원하는 금액 (2.5 mL 당 10 백만 셀)을 추가 하는
- 10 백만 셀 당 2 mL 버퍼 A 사용 하 여 셀을 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 2500 x g에서 회전
- 삭제 상쾌한 추가 버퍼 A octyl-phenoxy-polyethoxy-에탄올 등 비, 비 변성 시키기 세제의 0.2%와 보충 (재료의 표 참조), 500 µ L 당 10 백만 셀. 4 ° c.에서 5 분 동안 회전
- 5 분에 대 한 2500 x g에서 원심 분리기
- 제거는 상쾌한, 세포질 없는 그대로 핵을 구성 하는 펠 릿.
참고: 핵 단계 4 또는 플래시-냉동 액체 질소에 대 한 즉시 사용 고 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.
4. 핵의 세포
참고: 가교 된 핵은 단백질 및 단백질 RNA 복합물을 질량 분석 호환 버퍼에서 lysed.
10 백만 셀 당 200 µ L- 추가 세포의 용 해 버퍼 (9 M 요소, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 24 ° C). Chromatin는 1/8를 사용 하 여 기울이려면 sonicate " 5-10 미에 대 한 50% 진폭 설정에서 프로브
- 스핀 5 분 g x 12, 000와 수집 175 µ L의 펠 릿을 피하기 위해 상쾌한.
참고: 다음 RBR ID 단계 사용 됩니다 100 µ L 고 lysate의 나머지 75 µ L 나중에 사용 및 서쪽 오 점 분석-80 ° C에 저장 될 수 있다. - 측정 단백질 농도 Bradford 분석 실험 또는 유사한 기술 28을 통해. 다른 샘플을 1 mg/mL에서 단백질 농도 또는 세포의 용 해 버퍼의 적절 한 금액을 사용 하 여 낮은 샘플 농도 희석.
참고: 10 백만 mESCs의 핵에서 단백질의 100-200 µ g 기대.
5. 트립 신 소화
참고: 단백질 펩 티 드 s 생성 하 소화는하단-최대 질량 분석 (MS) 분석에 대 한의 uitable.
- 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 핵 lysate (5 m m 마지막); DTT 추가 솔루션
- 신선한 주식 (최종 14 m m)에서 iodoacetamide를 추가, 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어.
- 50mm NH 4 HCO 3의 5 번 볼륨 lysate Dilute
- 트립 신 추가 (µ g 단백질: µ g 트립 신 = 200: 1). 37 ° C에서 밤새 품 어.
6. 펩 티 드의 담
- 샘플 당 하나의 맞춤 단계 팁 준비.
- 6.1.1. 고체 상 추출 C18 물자의 디스크 200 µ L 피 펫 팁의 하단에 배치.
- 추가 50 µ L 올리고 R3의 C18 디스크 위에 수 지 위상 반전. 원심 분리 어댑터 내부 단계 팁과 1.5 mL microfuge 관 내부 어댑터와 장소 팁.
- 씻어 팁 추가 100 µ L 100% 이기. 용 매를 제거 하는 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기.
- 평형 50 µ L 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA). 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기
- 소화 단백질 샘플 2-3 pH 감소를 100% 포 름 산 추가.
참고:이 샘플 희석된 펩 티 드의 1 mL 당 ~ 5 µ L를 필요로 한다 하지만 pH 측정 하 고 더 개미의 산 추가 해야 합니다. 필요한 경우. - 맞춤 단계 팁, 샘플의 모든 때까지 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기에 부하 샘플 팁을 통해 간다.
- 세척 바인딩된 펩 티 드 50 µ L 0.1 %TFA. 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기
- 50 µ L 차입 버퍼를 추가 하 여 펩 티 드를 elute (75% 이기, 0.025 %TFA) 단계 팁을 팁에서 차입 버퍼를 1 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기.
- 건조 150g x 1 헤에 대 한 인민군 제 1-3에서 설정 진공 원심 분리기를 사용 하 여 샘플
참고: 말린된 펩 티 드 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한. 이것은 잠재적인 정지점.
7. 가교 된 RNA의 제거
참고: 가교 된 RNA를 제거 하는 nuclease와 펩 티 드를 치료.
- Nuclease 버퍼 (100mm NH 4 HCO 3, 4 m m MgCl 2) x 50 µ L 2에서에서 펠 릿 resuspend.
- 측정 펩 티 드 농도 280에서 흡 광도 사용 하 여 가정 1 mg/mL 1의 A 280에 대 한 펩 티 드의 nm.
참고: 예상된 농도 1 mg/mL. - 모든 샘플 1 mg/mL 또는 nuclease 버퍼 x 2를 사용 하 여 최저 농도 조정.
- 50 µ L H 2 O + 1 µ L 고 순도 nuclease 마스터 믹스를 준비 (≥ 250 U) (테이블의 자료를 참조) 샘플 당.
- 펩 티 드 샘플의 50 µ L 고 추가 50 µ L H 2 O + nuclease 믹스 마스터.
- 품 1 h. 질량 분석을 수행 하는 진행에 대 한 37 ° C에서.
참고:는 펩 티 드 질량 분석에 대 한 준비가 이제 있습니다. 그들은 즉시 분석 하거나 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.
8. 나노 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 원시 데이터 처리
참고: 4SU 가교는 펩 티 드의 질량 때문에, 그들의 이온 합산 되지 않습니다 비 가교 된 펩타이드의 농도 LC-MS/MS, 중 따라서는 가교에 의해 감소 될 것으로 보인다. 24 각 펩 티 드 단백질-RNA 가교의 정도 반영 하는 정도와이 감소의 일관성.
- 준비 HPLC 다음과 같이 버퍼: HPLC 급 물 (버퍼 A) 0.1% 포 름 산, HPLC 급 이기 (버퍼 B)에서 0.1% 개미 산.
- 나노 HPLC를 사용할 수 있으면 다음 사양 나노 열 연결: 내부 직경 75 µ m; C18-AQ 입자; 포장 길이 20-25 cm.
참고: 사용할 수 있는 HPLC 높은 흐름 속도에서 실행 되는 경우 지정 된 유량에 대 한 적절 한 열 크기를 사용 합니다. 높은 흐름 크로마토그래피 감도 감소. - 프로그램 HPLC 방법은 다음과 같습니다: 흐름 속도 250-300 nL/분; 28 다음 5 분 동안 80 %B isocratic 80% B 10 분에서에서 120 분에 28% 버퍼 B에 2에서 그라데이션
참고:는 HPLC 자동된 열 평형 사전 샘플 로드 되어 있지 않으면, 시작 프로그램 0% B 10 분 샘플을 로드 하기 전에. - MS 인수 메서드를 표준 샷건 proteomics 실험으로 데이터 종속 수집 (DDA) 프로그램. 악기 듀티 사이클 탠덤 MS 스캔 (또는 MS/MS)의 가장 강렬한 신호 전체 MS 검사 대체 한다. Proteomics MS 실행에 대 한 최적의 설정을 사용 하 여.
참고: 자신감의 결과 대 한 높은 해상도 모드 (예: orbitrap, 비행 시간)에 스캔 전체 MS 이상 수행할 수 있는 사용 악기. 정확한 정량화에 대 한 있는지 확인 전체 MS 검사 간의 간격으로 더 이상 보다 3 s. 더 듀티 사이클 추출된 이온 chromatograms의 정확한 정의 되지 않을 수 없습니다. - 는 HPLC 열에 샘플의 1-2 µ g를 로드 하 고 프로그래밍 HPLC-MS/MS 메서드를 실행 합니다. 각 생물 복제에 대 한 적어도 2 개의 독립적인 실행을 수행 하 고 그들을 치료 기술 복제.
- 후 MS, MS/MS 스펙트럼 식별 및 추출 된 이온 크로마토그래피를 통해 펩 티 드 정량화에 대 한 proteomics 소프트웨어 패키지에 원시 파일을 가져올. 좋습니다 여러 컬럼에 맞춤 수행할 수 있는 소프트웨어 패키지 MS 실행 (참조 테이블의 재료) 29 , 30.
- 옵션 소프트웨어 제품군에서 사용할 수 있는 경우에, 가능 하 게 " 사이의 일치를 실행 " 데이터 처리를 시작 하기 전에.
- 분석 완료 되 면 수출 부 량 값과 함께 펩 티 드 목록.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1 RBR ID 워크플로를 보여 줍니다. 때문에이 기술은 상대적으로 낮은 가교 효율 생물 복제 걸쳐 고갈 수준 및 관찰 된 효과 (P-값)의 일관성을 고려 하는 매우 중요 하다. 그림 2 는 RBR ID 결과의 화산 줄거리. 펩 티 드 RNA 승인 주제 (RRM) 도메인을 겹쳐 높게 일관 된 고갈 수준 표시. RRM 도메인 RBR ID 분석에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
RBR ID RBRs 라이브 셀에 매핑하는 데 사용할 수 있습니다. RBR ID 점수 RNA 바인딩 잠재력 추정 각 펩 티 드에 대 한 산출 될 수 있다: RBR ID 점수 =-2로그 (정규화 4SU 강도/정규화 +-4SU 강도) x (로그10(P-값))2. 그림 3 spliceosomal 소 단위 k u 1-70의 표면에 RBR ID 점수 heatmap을 보여준다. RNA 연락처의 주변에 밝은 붉은 색 결정 구조에서 결정 된 단백질 RNA 상호 작용의 정확한 id를 나타냅니다.
소설의 RBPs 식별 및 그들의 RBRs, 그들의 RNA 바인딩 활동 독립적인 방법에 의해 확인 될 것이 좋습니다. 우리의 이전 연구24, 우리 소설 RBP로 TET2를 식별 매핑되고 RNA 바인딩 활동 C 터미널 지역에는 단백질의 기본 시퀀스에 따라 RBR ID 점수를 그려서 그림 4A 와 같이. 그림 4B RBR 파 클립을 수행 하 여 확인 될 수 있는이 소설에 대 한 요구 사항을 보여줍니다26 WT 시퀀스를 사용 하 여 및 예측된 RBR 부족 돌연변이의 신호를 비교. 추가 컨트롤 및 유효성 검사 실험의 자세한 설명은 그 외 에 사용할 수 있습니다. 201624.
그림 1: RBR ID 개요. 또는 하지 마우스 ESCs 4SU와 함께 처리 됩니다 (1-2) 및 312 nm UV (3)와 반구. 핵에는 절연된 (4) 추출 소화 효소와 nuclease, 저조한 가교 화와 uncrosslinked 펩 티 드 (5)입니다. 화학식 RNA crosslink에서 adducts 사이트 변경 uncrosslinked 펩 티 드의 질량 스펙트럼 (6, 화살표)의 강도에 해당 감소로 이어지는 펩 티 드 질량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프로테옴 전체 RBR-ID mESCs. 화산 플롯 x 축과 학생의 t에 펩 티 드 농도에 보여주는 로그 배 변경-테스트 ± 4SU 치료에 대 한 y 축에서 P-값 (312 nm). 펩 티 드 주석된 RRM 도메인 중복 파란색에 있습니다. RNA 바인딩 펩 티 드 HNRNPC에서 빨간색으로 강조 표시 됩니다. 이전에 그 외 여러분 201624게시 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: RBR ID 지도 단백질-RNA 상호 작용의 사이트. U1 snRNP의 결정 구조의 지역 확대 (PDB ID: 4PJO31) 색으로 구분 된 그들의 RBR ID 점수에 따라와 상호 RNAs u 1-70 K에 대 한 표면 단백질을 보여주는. 이전에 그 외 여러분 201624게시 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: TET2의 RBR의 유효성 검사. (A) 기본 시퀀스 및 TET2;에 대 한 알려진된 도메인 기본 시퀀스 (가운데); 따라 부드럽게 잔류물 수준 RBR ID 점수 표시 그리고 당연히 피토 프 태그 촉매 도메인 조각 (CD) 및 RBR 삭제 (CDΔRBR) 구조 (아래) 유효성 검사에 사용. (B) 파-뚜렷이 표현된 TET2 CD와 ΔCDΔRBR HEK293 세포에서의 클립. Autoradiography 32P 표시 된 RNA에 대 한 (맨 위) 및 제어 서쪽 오 점 (아래). 이전에 그 외 여러분 201624게시 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
자세한 실험 프로토콜 RBR-ID를 mESCs로 하 고, RNA 4SU를 통합할 수 있는 모든 셀에 적절 한 수정 수행을 설명 합니다. 다른 세포 유형 충분 한 신호 대 잡음 비를 되도록 접근 방법의 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 설명 여기 핵 RBPs 시험에 초점을 맞추고, 하는 동안 RBR-ID 기술 한다 쉽게 적용할 cytosol 또는 특정 세포와 같은 다른 세포질 구획 다른 분류를 사용 하 여 전략입니다. 최적화 해야 하는 매개 변수 포함 자외선 가교의 에너지로 서 4SU 농도 법인 시간. 이 매개 변수는 RNA-단백질 crosslinks의 효율적인 형성을 보장 하 고 만족 스러운 신호 대 잡음 비를 산출 하는 것이 중요. 우리 312 nm UVB 빛은 가교 단백질 4SU 포함 된 RNAs는 365에 비해 훨씬 더 효율적으로 나타났습니다 nm UVA 파 클립32에서 일반적으로 사용 됩니다. RBR ID의 비교 수행 312 직접 및 365 nm를 시연 312 nm UVB 알려진된 RBPs24의 훨씬 더 큰 부분을의 확인에서 결과.
다른 두 가지 방법 프로테옴 전체 RBP 식별을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 하나, RBDmap, 비슷합니다 RBR-ID에 자외선 가교를 이용 하 고 양 RBDmap RBPs 식별 하는 데 사용 되었다 불리고 HeLa 세포23에서 그들의 RNA 바인딩 활동 지도. 이 방법은 RNA 바인딩 사이트에 인접 한 펩 티 드의 긍정적인 식별에 의존 하 고 두 개의 순차적 올리고 dT 풀-다운, RBR. 보다 낮은 거짓 긍정적인 평가 할 수도 있습니다 제안에 의존 그러나 풀-다운 RBPs 바인딩할 polyA + RNA를 RBR. 보다 10-100 배까지 더 많은 양의 입력된 자료를 요구의 식별만을 허용 하는, RBR ID 생물 복제 기술 복제 당 (~ 2 µ g), 250000 셀 몇 가지에서 수집 될 수 있습니다 당 단백질의 작은 5 µ g으로 수행할 수 있습니다.
수 중 음파 탐지기, 나는 두 번째 방법은 단백질을 자주 공동 정화 알려진된 RBPs와와 RNA18이러한 RBPs와의 상호 작용을 따라서 중재 수 있습니다 감지 하 큰 단백질-단백질 상호작용 데이터베이스의 데이터 마이닝에 의존 합니다. 이 영리한 접근은 매우 강력 하 고 허용 소설 RBPs의 식별에 대 한 어떤 젖은 실험실 실험을 수행 하지 않고 적합 한 데이터베이스는 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 상호 작용 사이트를 공개할 수 없습니다 이며 따라서 보완 하지만 대체 하지 RBR-id입니다.
요약, 우리의 RBR ID 기술을 소설 RBPs 식별 하 고 제한 입력된 샘플 금액와 단백질-RNA 가교 된 단지의 어떤 생 화 확 적인 정화를 요구 하지 않고 그들의 RBRs 매핑할 수 있습니다. 기술과 식별된 RBPs로 RNA의 종류에 아무 가정은 따라서 있는 많은 noncoding RBR ID 공부 하는 유용한 기법을 증명할 수도 제안 바인딩할 비-polyadenylated, 단백질의 RNA 바인딩 활동을 매핑할 수는 noncoding RNAs의 규제 역할입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
R.B.는 Searle 학자 프로그램, 트 면 스미스 재단 (C1404), 그리고 천 재단 (1-년도-15-344)의 3 월에 의해 지원 되었다. B.A.G는 NIH에서 지원 R01GM110174 및 NIH R01AI118891 국방부 뿐만 아니라 BC123187P1를 부여 부여 인정 합니다. R.W.-T. NIH 훈련 그랜트 T32GM008216에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
