Summary
Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.
Abstract
Kodlamayan RNA'ların gen ekspresyonu, Kromatin yapısı ve DNA tamiri düzenleyen de dahil olmak üzere birkaç nükleer süreçlerinde önemli rol oynarlar. Çoğu durumda, kodlamayan RNA'ların eylem olan işlevleri sırayla kodlamayan RNA'ların ile bu etkileşimler tarafından düzenlenen proteinler tarafından aracılık ettiği. Bununla tutarlı, proteinler nükleer işlevlerinde dahil, giderek artan sayıda RNA bağlamak için bildirilmiştir ve birkaç durumda bu proteinler RNA-bağlama bölgelerinde, kez zahmetli, aday tabanlı yöntemleri ile eşleştirilmiş olan.
Burada, RNA bağlanıcı proteinler ve kendi RNA-bağlama bölgelerinin yüksek üretilen iş, Proteom çapında tarafsız tanımlama gerçekleştirmek için detaylı bir protokol raporu. Photoreactive üridin RNA-çapraz peptidler Proteom içinde ortaya çıkarmak için UV-aracılı protein-RNA crosslinking ve kütle spektrometresi analizleri ardından hücresel RNA, analog birleşme yöntemi kullanır. Her ne kadar biz fare embriyonik kök hücre için açıklayınız, protokol kültürlü hücreler çeşitli için kolayca adapte edilmelidir.
Introduction
PRİX-ID yöntemin amacı roman RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri (RBRs) RNA-bağlama mutantlar tasarımını ve soruşturma biyolojik ve biyokimyasal kolaylaştırmak için peptid düzeyi çözünürlükte harita olmaktır protein-RNA etkileşimlerin işlevleri.
RNA, hem genetik bilgi taşıyan bir haberci olarak hareket hem de aynı zamanda karmaşık üç boyutlu yapılar biyokimyasal fonksiyonları daha fazla benzer-e doğru protein1,2kat biomolecules arasında benzersizdir. Kanıt büyüyen vücut kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) çeşitli gen düzenleyici ve epigenetik yolları3,4,5 ' te önemli rol oynarlar ve tipik olarak, bu düzenleyici işlevleri konserde aracılı öneriyor proteinler ile özel olarak verilen bir RNA ile etkileşim. Belirli uygunluğu etkileşen proteinler bir dizi son zamanlarda yoğun bir şekilde okudu uzun ncRNA (lncRNA) nasıl bu lncRNA kadın hücreleri6,7 x kromozomu inactivation aracılık eder içine değerli bilgiler sağlayan Xist belirlendi ,8. Özellikle herhangi bir kanonik RNA bağlayıcı etki alanları9içeren birçok Xist etkileşim bu proteinlerin değil ve bu nedenle RNA-bağlama faaliyetlerini öngörülen silico yalnız onların birincil sıralamasına dayanan olamazdı. LncRNAs binlerce herhangi bir belirli hücre10dakika sonra ifade edilir dikkate alındığında, RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) olmak keşfetti henüz pek çoğu ile etkileşimleri aracılığıyla hareket varsaymak makul olduğunu. Bu roman RBPs tanımlamak için deneysel bir strateji bu nedenle büyük ölçüde ncRNA'lar biyolojik fonksiyonu dissekan görevini kolaylaştırmak.
RBPs ampirik olarak tanımlamak için önceki girişimleri RNA kütle spektrometresi (MS)11,12,13,14,-15birleştiğinde polyA + seçime yararlanmıştır. Bu deneyler birçok protein, sözde RBPs listesine rağmen tasarım gereği sadece poliadenile transkript bağlı proteinler bulamazlardı. Ancak, çoğu küçük RNA'lar ve birçok lncRNAs poliadenile değildir. 16 , 17 ve onların etkileşen proteinler büyük olasılıkla bu deneylerde cevapsız olurdu. Yeni yapılan bir çalışmada Makine öğrenimi birden çok bilinen RBPs ile birlikte saflaştırılmış ve tekrarlayan RBP ortakları daha RNA-bağlama etkinlikleri18sahip olasılığı olduğunu gösterdi proteinler tanımlamak için protein-protein interactome veritabanlarına uygulanır. Ancak, bu yaklaşım büyük etkileşim veritabanlarında madencilik dayanır ve sadece böylece çözünmez, membran gömülü ve kıt analizinden hariç olmak üzere bilinen RBPs ile sigara denaturing koşullarda ortak saf olabilir proteinler tanımlayabilirsiniz proteinler.
Kimliği ile bir protein bir bona fide RBP kez otomatik olarak protein-RNA etkileşimi biyolojik ve/veya biyokimyasal işlevi hakkında bilgi vermez. Bu noktada adrese, bu etki alanı ve amino asit protein artıkları etkileşimde yer alan ilgili belirli mutantlar RNA bağlama işlevi her roman RBP19, bağlamında test etmek için tasarlanmış böylece tanımlamak için genellikle arzu edilir 20. önceki çabalar grubumuza ve diğerleri tarafından kullanmış rekombinant protein parçaları ve silme mutantlar bölgeleri (RBRs)19,20,21,22; bağlama RNA tanımlamak için Ancak, bu tür yaklaşımlar emek yoğun ve yüksek üretilen iş analizleri ile uyumsuz. Son zamanlarda, bir çalışma RNA-bağlama faaliyetleri kütle spektrometresi23kullanarak yüksek üretilen iş moda eşlemek için deneysel bir strateji tarif; Ancak, bu yaklaşım bir çift polyA + RNA seçime dayanıyordu ve böylece aynı sınırlamaları yukarıda açıklanan RBP kimlik yaklaşımlar olarak taşıdı.
Photocrosslinking protein-RNA ve protein ve RNA yapmadan canlı hücrelerdeki ile etkileşim protein bölgeleri tanımlamak için nicel kütle spektrometresi patlatır RNA bağlama bölge tanımlaması (PRİX ID.) olarak adlandırdığı bir tekniği, Gelişmiş varsayım RNA Poliadenilasyon durum, böylece RBPs de dahil olmak üzere polyA-RNA'ların24için bağlı. Ayrıca, bu yöntem sadece crosslinking dayanır ve protein çözünürlük veya erişilebilirlik şartlar yoktur ve böylece membranlar (örneğin nükleer zarf) veya kötü çözünür bölmeleri (RNA-bağlama etkinliklerine eşlemek uygundur örneğin nükleer matris). Biz PRİX-ID fare embriyonik kök hücreler (mESCs) çekirdekleri için gerçekleştirmek için deneysel adımlar açıklar ama koşuluyla verimli 4SU ile Kültür dahil edebilirsiniz küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı hücre tipleri, çeşitli için uygun olmalıdır Orta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kültür ve genişleme mESCs
Not: fare embriyonik kök hücre kültür için kolay ve hızlı bir şekilde biyokimyasal deneyler sayesinde hızlı bisiklet zaman gerektirdiği büyük sayılar için genişletilebilir. Sağlıklı mESCs çift her 12 h.
- MESC gelatinized levha istenen numaraya genişletme mESCs orta (aşağıya bakın) doku kültürü kuluçka muhafaza 37 ° C, % 5 CO 2, ve > % 95 nem.
Not: Yeterli plakaları için 3-5 biyolojik çoğaltır için hazır olmalıdır + 4SU örnek ile - 4SU denetimi. Bir 10 cm tabak (Yani 5-10 milyon hücreleri) biyolojik her çoğaltma için daha--dan yeterli. - Orta mESCs için Dulbecco oluşan ' s modifiye kartal ' s orta (DMEM) takıma % 15 fetal sığır serum ile (FBS), 2 mM L-glutamin, 0.5 x penisilin/streptomisin, 1 x esansiyel olmayan amino asitler, 100 µM beta-mercaptoethanol, 1.000 U /mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
- MESCs passaging önce 10 cm tabak için istediğiniz sayıyı hazırlayın.
- 4 mL %0,1 jelatin plaka tüm yüzeyine kaplıdır emin su ekle; (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya; jelatin çözüm kaldırın.
- ~ 48 h aşı takip genellikle plaka, başına ~ 10 milyon hücre ulaştıkları zaman geçiş hücreleri.
Not: mESCs yoğun kolonilerde büyüdükçe, tabaklar asla % 100 confluency monolayers (örneğin HEK293 veya 3T3 hücreleri) büyümek hücre hatları için gözlemlediği gibi ulaşmak için izin verilmelidir. ~ %50 Konfluent ve kesinlikle orta önce sarı dönüştüğünde bir mESC plaka passaged.- Hücreleri, ayırmak için
- yıkama pilakalar ve yoğun mESC bir kez 1 x 2 mM EDTA, takıma fosfat tamponlu tuz (PBS) kültürlerde sonra % 0.05 tripsin DMEM içinde çözünmüş eklemek ve dönmek 5 min için kuluçka plakasına (37 ° C, % 5 CO 2, ve > % 95 nem).
- Kuluçka Gelişim makinesi plaka kaldırmak ve hücreler eşit DMEM hacmi ile yukarı ve aşağı birkaç kez şiddetle pipetting tarafından resuspend.
- Say hemasitometre kullanarak hücreleri ve hücreleri tek hücre süspansiyon oluşturmak emin olun (Yani hiçbir kümeleri), hücre karışımı 500 x g için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 1-2 mL DMEM resuspend.
- Aşılamak bir yoğunluk 10.000 hücre/cm 2 mESC orta (Yani 800.000 ~ 10 cm tabak başına hücre) hücreleri 1.3.1. adımda hazırlanan jelatin kaplı plakalar kullanarak.
2. Protein Crosslink – RNA etkileşimleri canlı hücrelerdeki
Not: RNA-protein crosslinking fotoğraf alınabilen ribonucleoside analog 4-thiouridine tarafından (4SU) aracılı. 4SU vardır uzun bir Absorbans en yüksek değerden endojen nükleotit ve sadece RNA; dahil edilebilir Bu nedenle orta dalga UVB seçerek crosslink RNA proteinleri 25 , 26 için kullanılabilir. UVB tedavisi 4SU tedavi hücre açar kovalent Glossar 4SU içeren RNA ve de Tyr, bildirilen seven amino asitleri arasındaki Trp, Met, Lys ve Cys 27.
- 10 cm tabak gerekli sayıda açıklandığı adım 1 olarak genişletme mESCs.
Not: Yeterli plakaları için 3-5 biyolojik çoğaltır için hazır olmalıdır + 4SU örnek ile - 4SU denetimi. Bir 10 cm tabak (Yani 5-10 milyon hücreleri) biyolojik her çoğaltma için yeterli. - Plakaları confluency ulaşmadan 4SU 500 son bir konsantrasyon için doğrudan orta eklemek µM. bırak - tedavi edilmezse 4SU denetim yemekleri.
- Yavaşça 4SU homojen orta boyunca dağıtmak için shake plakaları. Aynı doku kültürü kuluçka 2s için onları dönmek (37 ° C, % 5 CO 2, ve > % 95 nem).
- Bir buz kovası tabak transfer ve orta atın.
- 5 mL de buz gibi PBS ile hafifçe plaka durulayın.
Not: nazikçe yıkayın veya hücreler ayırabilirsiniz. - UVB yayan ampul ile donatılmış bir crosslinker 2 mL kapaklar olmadan buz gibi PBS ve yer plakaların eklentisi (312 nm). Bir enerji ayarında 1 J/cm 2 tabak ışınlatayım.
Not: Plastik kapağı kaldırılır veya UV ışık hücrelerden kalkan ve çapraz önlemek olabilir önemlidir. - Hücre halterci kullanarak hücreleri toplamak ve konik tüpler içinde buz gibi PBS aktarın. 5 min, 4 ° c için 2.000 x g, santrifüj
- Süpernatant kaldırmak ve 5 mL buz gibi PBS 2 mM EDTA ve 0.2 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile hücre Pelet resuspend.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri hesaplama. 10 cm, 15 cm tabak 5-10 ve 10-20 milyon hücrelerden sırasıyla bekliyoruz. 5 min, 4 ° c için 2.000 x g de
- santrifüj
Not: Pelleted hücreleri hemen adım 3 için kullanılabilir veya flash donmuş sıvı azot ve-80 ° C'de süresiz olarak depolanabilir. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.
3. Çekirdeklerin izolasyon
Not: çekirdeklerin sitoplazmik protein kaldırmak ve nükleer protein kapsamını artırmak için izole. Bu adımı RBPs farklı hücresel kompartmanlarda içinde çalışmaya hücresel ayırma diğer formları ile değiştirilebilir.
- Hazırla buz gibi tampon (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Ayıklama için (2,9 adımda sayılır gibi) 10 milyon hücre başına en az 2.5 mL kullanın.
Not: Stokları (örneğin 500 mL şişe) arabelleği A önceden hazırlanmış ve 4 ° C'de 6 ay süreyle depolanır.- 0,5 mM dithiothreitol (DTT) ve 0.2 mM PMSF buz gibi soğuk arabellek A. istenilen miktarda (10 milyon hücre başına 2.5 mL) için kullanılmadan önce Ekle
- Yıkama 2 mL arabellek A başına 10 milyon hücre kullanarak hücreleri. Spin 2500 x g 4 ° C'de 5 min için de
- Atma süpernatant eklemek arabellek Oktil-phenoxy-polyethoxy-etanol gibi bir Nonyonik, Sigara denaturing deterjan % 0,2 ile takıma A (bakınız Tablo malzemeler), 500 µL 10 milyon hücre başına. 4 ° C'de 5 min için döndürme
- 2500 x g 5 dakika süreyle, santrifüj
- Kaldır süpernatant; Pelet sitoplazma yoksun olduğu gibi çekirdek oluşur.
Not: Çekirdeklerin hemen adım 4 veya flash donmuş sıvı azot için kullanılan ve-80 ° C'de süresiz olarak saklanır. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.
4. Çekirdeklerin lizis
Not: çapraz çekirdek protein ve protein-RNA kompleksi serbest bırakmak için bir kütle spektrometresi uyumlu arabellek lysed.
- Ekle lizis arabellek (9 M üre, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 10 milyon hücre başına 200 µL. Kromatin bir 1/8'i kullanarak yamultmak için solüsyon içeren temizleyicide " 5-10 s. için % 50 genlik ayarında sonda
- Spin 12.000 g 5 min için x ve toplamak 175 µL olan Pelet önlemek için süpernatant.
Not: 100 µL sonraki PRİX-ID adımlar için kullanılacak olan ve kalan 75 µL lysate, daha sonra kullanmak ve/veya western blot analizi için-80 ° C'de saklanabilir. - Ölçü protein konsantrasyonu Bradford tahlil veya benzer tekniği 28 üzerinden. Protein konsantrasyonu 1 mg/ml farklı örneklerinde veya lizis arabellek uygun miktarda kullanarak en düşük örnek konsantrasyon sulandırmak.
Not: 10 milyon mESCs çekirdekleri 100-200 µg protein bekliyoruz.
5. Tripsin sindirim
Not: protein sindirilir peptidler s oluşturmak içinAşağıdan yukarıya kütle spektrometresi (MS) analizi için uitable.
- Dik, 1 h için kuluçkaya eklemek DTT çözüm nükleer lysate (5 mm son);
- İodoacetamide taze stok (14 mM son) Ekle; RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya.
- Dilute 50 mM NH 4 HCO 3 5 kere hacmi ile lysate
- Tripsin ekleyin (µg protein: µg tripsin = 200:1); 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
6. Peptidler desalting
- bir özel yapım aşamasında uç örnek başına hazırlayın.
- 6.1.1. katı faz ayıklama C18 malzemenin bir disk 200 µL pipet ucu dibine yerleştirin.
- Ekle 50 µL oligo R3, faz reçine C18 disk üzerine ters. Yer sahne ipucu Santrifüjü adaptör içinde ve yerde İpucu 1.5 mL microfuge tüp içinde adaptörle.
- Ekle 100 µL % 100 Asetonitril yıkamak için ipuçları. Santrifüj için çözücü kaldırmak 1 dk 1000 x g de.
- Equilibrate 50 µL % 0,1 trifluoroacetic asit (TFA). 1 dk. 1000 x g, santrifüj
- %100 formik asit pH 2-3 için azaltmak için sindirilmiş protein örneği ekleyin.
Not: Bu ~ 5 µL seyreltilmiş peptid Örnek 1 mL başına istemeniz gerekir, ancak pH-meli var olmak eklendi ölçülü ve daha formik asit gerekirse. - Yük örnek özel yapım aşamasında uç, 1dk kadar tüm örnek için 1000 x g, santrifüj üzerine ucu ile gider.
- Yıkama bağlı 50 µL % 0.1 ile peptidler TFA. 1 dk. 1000 x g, santrifüj
- 50 µL elüsyon arabelleği ekleyerek peptidler elute (% 75 Asetonitril, % 0,025 TFA) sahne ipucu ve santrifüj elüsyon Arabellek yetersiz ucu zorlamak 1 dk 1000 x g de.
- Kuru vakum santrifüj 150 x g ve 1 h için 1-3 kPa ayarlamak kullanarak örnek
Not: Kurutulmuş peptidler-80 ° C'de süresiz olarak saklanır. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.
7. Çapraz RNA kaldırılması
Not: tedavi etmek RNA kaldırmak için nükleaz ile peptidler.
- Nükleaz arabellek (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2) x 50 µL 2 Pelet resuspend. Absorbans 280 kullanarak
- ölçü peptid konsantrasyonu 1 mg/mL 1 A 280 için peptidler varsayarak nm.
Not: Beklenen konsantrasyonu 1 mg/mL'dir. - Tüm örnekleri 1 mg/mL veya 2 x nükleaz arabellek kullanarak en düşük konsantrasyon ayarlayın.
- 50 µL H 2 O + 1 µL yüksek saflıkta nükleaz ana karışımı hazırlar (≥ 250 U) (Tablo malzemeler için başvurmak) örnek başına.
- 50 µL peptid örneği alıp 50 µL H 2 O + nükleaz master mix ekleyin. 1 h. kütle spektrometresi gerçekleştirmek için devam etmek için 37 ° C'de
- Incubate.
Not: Peptidler kütle spektrometresi için hazırsınız. Onlar hemen analiz veya süresiz olarak-80 ° C'de depolanan. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.
8. Nano sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve ham veri işleme
Not: 4SU crosslinking peptid kitle değiştiğinden, onların iyonları çapraz peptid yoğunluğunu doğru LC-MS/MS sırasında dikkate alınmaz hangi bu nedenle çapraz tarafından azaltılan görünüyor. Derecesi ve bu düşüş tutarlılığını protein-RNA crosslinking her peptid 24 derecesini yansıtır.
- Hazırlamak HPLC arabelleği aşağıdaki gibi: %0,1 formik asit HPLC sınıf su (a tampon); %0,1 formik asit HPLC sınıf Asetonitril (arabellek B).
- Bir nano-HPLC varsa bağlanmak bir nano-sütun aşağıdaki özelliklerle: iç çap 75 µm; C18-AQ parçacıkları ile; Paketli uzunluğu 20-25 cm.
Not: kullanılabilir HPLC yüksek akış oranları çalışıyorsa belirtilen akış hızı için uygun sütun boyutu kullanın. Daha yüksek akış Kromatografi duyarlılık azalır. - Program HPLC yöntemi aşağıdaki gibi: akış hızı 250-300 nL/dk; 2 gradyan % 28 arabelleğinden B 120 dak, sonraki 5 min için % 80'b ve isocratic % 80'i B 10 dk. 28 '
Not: HPLC bir otomatik sütun denge önceki örnek yükleme yoksa, program 10 dk %0 B örnek yüklemeden önce başlayın. - MS edinme yöntem veri bağımlı kazanım (DDA) standart av tüfeği proteomik deneyler olarak gerçekleştirmek için program. Enstrüman iş hacmi tam MS taramaları ile tandem MS inceden inceye gözden geçirmek (ya da MS/MS) en yoğun sinyallerin alternatif. Proteomik MS çalışır için en iyi ayarları kullanın.
Not: kendine güvenen sonucu elde etmek için en az tam MS gerçekleştirebilirsiniz kullanım aletleri yüksek çözünürlük modu (örneğin orbitrap, uçuş saat) inceden inceye gözden geçirmek. Doğru miktar için 3 s. uzun görev devir ayıklanan iyon chromatograms doğru tanımı engelleyebilir daha tam MS taramalar arasında aralıklarla artık olduğunuzdan emin olun. - 1-2 µg örneği HPLC sütuna yük ve programlanmış gibi HPLC-MS/MS yöntemini çalıştırın. Biyolojik her çoğaltma için en az iki bağımsız çalışması yapmak ve onları tedavi olarak teknik çoğaltır.
- Sonra MS, MS/MS spectra kimlik ve peptid miktar üzerinden ayıklanan iyon Kromatografi için proteomik yazılım paketi içine raw dosyalarını alın. Birden fazla Kromatografik hizalama gerçekleştirebilir yazılım paketleri öneririz MS çalışır (bakınız Tablo reçetesi) 29 , 30.
- Bilgisayar yazılımı maiyet seçeneği varsa, etkinleştirme " maç arasında ishal " veri işleme başlamadan önce.
- Analiz tamamlandığında miktar değerleri ile birlikte peptid listeyi verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 PRİX-ID iş akışı gösterilmektedir. Bu teknik nispeten düşük crosslinking verimliliği nedeniyle tükenmesi düzeyi ve tutarlılık gözlenen etkisi (P -değeri) arasında biyolojik çoğaltır dikkate almak çok önemlidir. Şekil 2 bir yanardağ arsa PRİX-ID sonuç gösterir. RNA tanıma motifi (RRM) etki alanı üst üste peptidler son derece tutarlı tükenmesi düzey göster. RRM etki olumlu bir denetim PRİX-ID analizi için kullanılabilir.
PRİX-ID RBRs canlı hücrelerdeki eşleştirmek için kullanılır. Bir PRİX-ID puanı her peptid RNA-bağlama potansiyel tahmin etmek hesaplanabilir: PRİX-ID puanı = - oturum2(normalleştirilmiş + 4SU yoğunluk/normalleştirilmiş-4SU yoğunluğu) x (günlük10(P -değeri))2. Şekil 3 bir heatmap U1 - 70 k spliceosomal alt yüzeyinde öngörülen PRİX-ID puanları gösterir. Çevresinde RNA ilgili kişinin, parlak kırmızı renkte kristal yapısı, belirlenen doğru tanımlaması protein-RNA etkileşimi gösterir.
Kimliği roman RBPs ve onların RBRs, RNA-bağlama faaliyetlerini bağımsız bir yöntem tarafından onaylanması önerilir. Bizim önceki çalışma24, biz TET2 bir roman RBP olarak tanımlanan ve RNA-bağlama etkinliği şekil 4A PRİX-ID puanı protein birincil dizisi boyunca komplo tarafından gösterildiği gibi bir C-terminal bölgesine eşlenen. Şekil 4B gösterir Bu gereksinimin PRİX-var verified PAR-klip gerçekleştirerek bu roman için WT sırası kullanılarak ve tahmin edilen PRİX eksik bir mutant olan için sinyal karşılaştırarak26 . Ek denetim ve bu doğrulama deneme dair daha detaylı açıklama içinde o ve ark. mevcuttur 201624.
Şekil 1: PRİX-ID genel bakış. Fare ESCs 4SU ile ya da değil kabul edilir (1 - 2) ve 312 nm UV (3) ile ışınlanmış. Çekirdeklerin izole (4) ve proteaz ve çapraz ve uncrosslinked peptidler (5) verimli nükleaz, sindirilmiş özleri vardır. Kovalent RNA adducts crosslink siteleri alter uncrosslinked peptid'ın kütle spektrumu (6, ok) yoğunluğu azalmasına karşılık gelen lider peptid kitle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Proteom çapında PRİX-ID mESCs. Volkan Arsalar gösteren günlük katlı değişimler peptit yoğunluklarda x ekseni ve bir öğrenci t-test ± 4SU tedaviler için y eksenindeki değerler P -(312 nm). Ek açıklama eklenen RRM etki alanları örtüşen peptidler mavi vardır. Bir RNA-bağlama peptid HNRNPC gelen kırmızı ile vurgulanacaktır. Daha önce o vd. 201624' te yayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: PRİX-ID haritalar protein-RNA etkileşimleri sitelerin. Yakınlaştırılmış bileşenini U1 snRNP kristal yapısını bölgelerinde (PDB kimliği: 4PJO31) protein gösterilen yüzeylerde renk kodlu onların PRİX-ID puanı according ve RNA'ların U1 - 70 K için etkileşim. Daha önce o vd. 201624' te yayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: TET2 PRİX doğrulanmasını. (A)birincil sıralama ve bilinen etki alanları TET2 için; düzgünleştirilmiş kalıntı-düzeyi PRİX-ID skoru (orta); birincil sıra çizilen ve düzeni epitope öğesini katalitik etki alanı parçası (CD) ve doğrulama (alt) için kullanılan PRİX-silindi (CDΔRBR) oluşturur. (B) PAR-klip geçici ifade TET2 CD ve ΔCDΔRBR HEK293 hücrelerdeki. Autoradiography (üst) için 32P olarak etiketlenmiş RNA ve denetim Batı leke (altta). Daha önce o vd. 201624' te yayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz PRİX-ID içinde mESCs ve 4SU RNA dahil edebilirsiniz herhangi bir hücreye uygun değişiklikler ile gerçekleştirmek için detaylı bir deneysel protokol tanımlamak. Diğer hücre tipleri yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için yaklaşım duruma getirilmesi gerekebilir. Ayrıca, protokol burada odaklanır nükleer RBPs muayenede açıklanan. süre PRİX-ID teknoloji kolayca farklı ayırma kullanımıyla sitozol veya belirli organelleri, gibi farklı hücresel kompartmanlarda için adapte olmalıdır stratejileri. En iyi duruma getirme gerektirebilir parametreleri 4SU konsantrasyon ve birleşme zaman yanı sıra UV crosslinking enerji içerir. Bu parametreler RNA-protein Glossar verimli oluşumunu sağlamak ve tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı verim açısından önemlidir. 312 nm UVB Işık 4SU içeren RNA'ların proteinler karşılaştırıldığında için 365 crosslinking, çok daha etkili olduğunu göstermiştir nm UVA genellikle kullanılan PAR-CLIP32. PRİX-id karşılaştırma yapılacak 312 ile doğrudan nm ile 365 nm gösterdi 312 nm UVB sonuçlandı çok daha büyük bir kısmını bilinen RBPs24tanımlaması.
Proteom kapsamındaki bir RBP tanımlama gerçekleştirmek iki yöntem mevcuttur. Bir, RBDmap denilen UV crosslinking kullanır ve MS. RBDmap RBPs tanımlamak için kullanılan PRİX-Kimliği alanına benzer ve RNA-bağlama faaliyetlerini HeLa hücreleri23yılında eşleyin. Bu yöntem peptidler RNA bağlayıcı siteleri için bitişik olumlu tanımlaması dayanan ve iki sıralı oligo-dT çekme-çıkışlar, PRİX-kimliği daha düşük bir yanlış pozitif oranı olabileceğini düşündüren kullanır Ancak, çekme-çıkışlar sadece polyA + RNA bağlamak ve giriş malzeme büyük miktarlarda 10 - 100 kat daha fazla PRİX-kimliği gerektiren RBPs tanımlaması izin PRİX-ID protein başına 250.000 hücreler olarak az üzerinden toplanan biyolojik Çoğalt (~ 2 µg) teknik REPLICATE başına kadar az 5 µg ile yapılabilir.
SONAR, olarak adlandırılan ikinci yöntem veri madenciliği büyük protein-protein etkileşim veritabanlarının bu sık sık işbirliği ile bilinen RBPs arındırmak ve bu RBPs ile olan etkileşimi bu nedenle RNA18tarafından aracılı proteinler algılamak için kullanır. Bu akıllı bir yaklaşım çok güçlü ve uygun veritabanı kullanılabilir olması koşuluyla herhangi bir ıslak laboratuvar deney yapmadan roman RBPs tanımlanması için izin verir; Ancak, bu etkileşim siteleri veremiyoruz ve bu nedenle PRİX-kimlik için tamamlayıcı ama değil alternatif.
Özet olarak, bizim PRİX-ID tekniği roman RBPs tanımlamak ve kendi RBRs sınırlı giriş örnek tutarlarını içeren ve protein-RNA çapraz kompleksleri biyokimyasal herhangi bir arınma gerek kalmadan eşleyin. Teknik tarafından tanımlanan RBPs bağlı RNA türünü yok varsayımı yapar ve bu nedenle sigara-poliadenile, bağlayan proteinler birçoğu PRİX-ID eğitim için yararlı bir yöntem olabilir düşündüren kodlamayan RNA bağlama etkinliği eşleyebilirsiniz kodlamayan RNA'ların düzenleyici rolleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
R.B. Searle bilim programı, WW Smith Vakfı (C1404) ve Mart Dimes Vakfı (1-FY-15-344) tarafından desteklenmiştir. B.A.G hibe desteğinden NIH R01GM110174 ve NIH R01AI118891, DOD yanı sıra BC123187P1 hibe eder. RW-T. NIH eğitim grant T32GM008216 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
