Summary
이 프로토콜은 표준 시험관 전기 생리학 장비를 위해 최근에 개발 된 시스템을 사용하여 자동 이미지 유도 패치 클램프 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.
Abstract
전체 세포 패치 클램프는 단일 세포의 전기적 특성을 측정하는 금 표준 방법입니다. 그러나 체외 수정 패치 클램프는 복잡하고 사용자 조작 및 제어에 대한 높은 의존성으로 인해 도전적이고 낮은 처리량의 기술로 남아 있습니다. 이 원고는 급성 뇌 절편 에서 시험관 전체 세포 패치 클램프 실험을위한 이미지 가이드 자동 패치 클램프 시스템을 시연합니다. 우리 시스템은 형광 표식 된 세포를 검출하고 마이크로 조작기와 내부 피펫 압력 제어를 사용하여 완전 자동 패칭을 목표로 컴퓨터 시각 기반 알고리즘을 구현합니다. 전체 프로세스는 인간의 개입에 대한 최소한의 요구 사항만으로 고도로 자동화되어 있습니다. 전기 저항 및 내부 피펫 압력을 포함한 실시간 실험 정보는 향후 분석 및 다른 세포 유형의 최적화를 위해 전자적으로 문서화됩니다. 우리의 체계는 급성 brai의 문맥에서 기술 되더라도n 슬라이스 기록을 포함 해 분리 된 뉴런, organotypic slice culture 및 기타 비 연결 세포 유형의 자동화 된 이미지 유도 패치 클램프에도 적용 할 수 있습니다.
Introduction
패치 클램프 기술은 제 1 막 흥분성의 이온 채널을 연구 1970 Neher 및 Sakmann에 의해 개발되었다. 그 이후 패치 클램핑은 뉴런, 심근 세포, Xenopus 난 모세포 및 인공 리포좀을 포함하여 다양한 세포 유형에서 세포, 시냅스 및 회로 수준 (인 비트로 및 체내 모두) 에서 다양한 대상에 대한 연구에 적용되었습니다 2 . 이 과정은 관심 세포의 정확한 식별 및 표적화, 세포에 근접하여 패치 피펫을 이동시키는 복잡한 마이크로 매니퓰레이터 제어, 적당한 시간에 피펫에 양성 및 음성 압박을 가하여 꽉 조이는 gigaseal 패치를 확립하고, 전체 셀 패치 구성을 설정하기위한 침입 등이 있습니다. 패치 클램핑은 일반적으로 수동으로 수행되며 마스터하기 위해 광범위한 교육이 필요합니다. 패치를 경험 한 연구원이라 할지라도클램프, 성공률은 상대적으로 낮습니다. 보다 최근에는 패치 클램프 실험을 자동화하기위한 몇 가지 시도가있었습니다. 자동화를 달성하기 위해 두 가지 주요 전략이 개발되었습니다. 표준 패치 클램프 장비를 강화하여 패치 프로세스를 자동 제어하고 새로운 장비 및 기술을 처음부터 설계합니다. 이전 전략은 기존 하드웨어에 적용 할 수 있으며 생체 내 blind patch clamp 3 , 4 , 5 , 급성 뇌 절편의 in vitro patch clamp, organotypic slice culture 및 cultured dissociated neurons 6을 포함하여 다양한 패치 클램프 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다. . 그것은 다수의 미세 조작기 동시에 7을 사용하여 복잡한 로컬 회로 심문을 가능하게한다. 평면 패치 방법은 새로운 개발 전략의 한 예이며 동시에 높은 처리량을 달성 할 수 있습니다약물 스크리닝 목적으로 현탁액에있는 세포의 아치 클램프 8 . 그러나, 평면 패치 방법은 모든 세포 유형, 특히 긴 과정을 갖는 뉴런 또는 광범위한 연결을 포함하는 손상되지 않은 회로에 적용 가능하지 않다. 이는 기존의 패치 클램프 기술의 핵심 이점 인 신경계의 복잡한 회로를 매핑하는 데 그 적용을 제한합니다.
우리는 표준 패치 클램프 하드웨어를 보강함으로써 체외에서 수동 패치 클램프 프로세스를 자동화하는 시스템을 개발했습니다. 당사의 시스템 인 Autopatcher IG는 자동 피펫 보정, 형광 셀 타겟 식별, 피펫 이동 자동 제어, 자동 전체 셀 패칭 및 데이터 기록을 제공합니다. 이 시스템은 여러 깊이의 뇌 조각 이미지를 자동으로 수집 할 수 있습니다. 컴퓨터 비전을 사용하여 분석. 형광으로 표지 된 세포의 좌표를 포함한 정보를 추출합니다. 이 정보는관심 대상 세포를 표적화하고 자동으로 패치하는 데 사용됩니다. 이 소프트웨어는 여러 오픈 소스 라이브러리를 사용하여 무료 오픈 소스 프로그래밍 언어 인 Python으로 작성되었습니다. 이것은 다른 연구자들에게 접근성을 보장하고 전기 생리학 실험의 재현성과 엄격 성을 향상시킵니다. 이 시스템은 추가 하드웨어가 여기에 설명 된 현재 시스템과 쉽게 인터페이스 될 수 있도록 모듈 식 설계를 갖추고 있습니다.
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Protocol
1. 시스템 설치
- 압력 제어 장치를 구성하십시오.
- 회로도 ( 그림 1 )에 따라 압력 제어 장치를 조립하십시오. 전기 회로도 ( 그림 1b )에 따라 제조 된 인쇄 회로 기판 (PCB)에 필요한 부품을 납땜하십시오. 표준 저항기, LED, 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터 (MOSFET), 커패시터 및 커넥터를 사용하십시오 ( 재료 표 참조). 솔레노이드 밸브를 PCB에 납땜하십시오. 에어 펌프와 공기 압력 센서를 전선으로 PCB에 연결하십시오.
참고 : 필요한 모든 부품을 사용할 수 있도록 압력 제어 장치를 구성하는 데 약 2 시간이 걸립니다.
- 회로도 ( 그림 1 )에 따라 압력 제어 장치를 조립하십시오. 전기 회로도 ( 그림 1b )에 따라 제조 된 인쇄 회로 기판 (PCB)에 필요한 부품을 납땜하십시오. 표준 저항기, LED, 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터 (MOSFET), 커패시터 및 커넥터를 사용하십시오 ( 재료 표 참조). 솔레노이드 밸브를 PCB에 납땜하십시오. 에어 펌프와 공기 압력 센서를 전선으로 PCB에 연결하십시오.
- 보조 데이터 수집 (DAQ) 보드를 연결하십시오.
- 표 1에 따라 인쇄 회로 기판의 데이터 출력을 DAQ 보드에 연결하십시오.
참고 : DAQ 보드는l "단일 종단 모드"에서 실행 중입니다. 포트 맵은 사용 설명서 ( Table of Materials 참조)에서 찾을 수 있습니다. - "AIn Pr S"를 아날로그 입력 (AI) 채널 중 하나에 연결하고 "R-Gr"을 보조 DAQ 보드의 아날로그 접지 중 하나에 연결하십시오.
- 앰프의 1 차 출력을 AI 채널 중 하나에 연결하고 접지를 2 차 DAQ 보드의 아날로그 접지에 연결하십시오.
참고 : 표준 BNC 케이블을 사용하여 앰프의 기본 출력을 연결할 수 있습니다. - 다른 쪽 끝을 벗기고 양극 신호 ( 즉, 구리 코어)를 AI 채널과 접지 ( 즉 , 코어 주변의 얇은 와이어)와 아날로그 접지에 연결하십시오. 두 개 이상의 패치 채널이 사용되는 경우 두 번째 채널에 대해이 단계를 반복하십시오.
참고 : DAQ 보드의 아날로그 입력은 이후 단계에서 구성됩니다. - 보조 DAQ 보드의 전원 출력에 전원을 연결하십시오. 별도의 12 V 전원을 사용하십시오.펌프에 대한 욕구.
- 표 1에 따라 인쇄 회로 기판의 데이터 출력을 DAQ 보드에 연결하십시오.
- 튜빙을 연결하십시오.
- 표 2 에 따라 공기 펌프와 두 개의 밸브를 연결하십시오. 마지막 단계에서 3 방향 커넥터를 사용하여 밸브 2 상단 포트, 압력 센서 및 피펫 홀더의 연성 튜빙을 연결하십시오.
- 두 개의 피펫을 사용하는 경우 피펫 홀더에 연결된 튜빙에 다른 3 방향 커넥터를 추가하십시오. 패치 할 때 사용중인 밸브와 피펫을 수동으로 전환하십시오.
- Autopatcher IG를 설치하십시오.
참고 : 시스템 요구 사항 : Autopatcher IG는 Windows 7을 실행하는 PC에서만 테스트되었으며 다른 운영 체제에서는 유효성이 검증되지 않았습니다. 설명 된 절차는 Table of Materials에 나열된 하드웨어에만 적용됩니다.- GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG)에서 Autopatcher-IG를 다운로드하십시오.
- Python을 설치하십시오 (버전 및 다운로드 주소는 Table of Materials 를 참조하십시오).
- PyQt4 제거명령 줄 터미널에 "pip uninstall PyQt4"를 입력하여 라이브러리를 엽니 다.
참고 : 시스템은 이전 버전의 PyQt4 라이브러리를 사용하여 Qwt 및 Opencv 라이브러리와의 호환성을 구현합니다. - 역사적인 바퀴 파일 (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/)에서 Python 라이브러리를 설치하십시오. Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none) -win32.whl) 및 Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl)입니다.
- 휠 파일을 설치하려면 파일이 저장된 디렉토리로 이동하여 "pip install *** wheelfilename ***. whl."을 입력하십시오. "*** wheelfilename ***"을 실제 파일 이름으로 대체하십시오.
참고 : 휠 파일 이름의 "cp27"은 Python 2.7을 나타내며 "win32"는 Windows 32 비트를 나타냅니다. "win32"가 작동하지 않으면 "win64"를 시도하십시오.
- 휠 파일을 설치하려면 파일이 저장된 디렉토리로 이동하여 "pip install *** wheelfilename ***. whl."을 입력하십시오. "*** wheelfilename ***"을 실제 파일 이름으로 대체하십시오.
- CCD 카메라를 제어하려면 설치 프로그램을 다운로드하여 설치하십시오.64 비트 용 (https://www.qimaging.com/support/software/). 그런 다음 MicroManager for 64-bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release)를 다운로드하여 Python으로 카메라를 제어하십시오.
- 매니퓰레이터 및 현미경 스테이지를 제어하려면 제조업체가 제공하는 제어 소프트웨어를 설치하십시오.
참고 : 이렇게함으로써 조작기를 제어하는 데 필요한 드라이버도 설치됩니다. 설치 패키지는 일반적으로 CD-ROM으로 제공됩니다. - 보조 DAQ 보드를 제어하려면 DAQ 보드를 구입 한 CD-ROM에서 Universal Library를 설치하십시오.
- Autopatcher IG의 하드웨어를 구성하십시오.
- 현미경 스테이지와 조작기 컨트롤러를 USB 포트를 통해 컴퓨터에 연결하십시오.
- COM 포트 번호를 유닛 0에 지정합니다 : 현미경 스테이지, 유닛 1 : 왼쪽 조작기 및 유닛 2 : 오른쪽 조작기를이 순서대로 "구성"폴더의 "ports.csv"구성 파일에 지정하십시오. 엘ports.csv 파일의 다른 매개 변수 ( 예 : "SCI"및 "1")는 변경되지 않습니다.
참고 : COM 포트 번호 정보는 제조업체가 제공 한 매니퓰레이터 구성 소프트웨어를 실행하여 찾을 수 있습니다. "설정"탭으로 이동하여 "설정"및 "동작"페이지를 선택하고 맨 위에있는 각 탭의 레이블을 읽습니다. 또는이 정보는 PC 장치 관리자에서 찾을 수 있습니다. - 압력 센서와 패치 채널 1과 2 (유닛 1과 2에 해당)에 대해 DAQ 보드에 아날로그 입력 채널 번호를 할당하십시오. "configuration"폴더의 "DAQchannels.csv"파일에 채널 번호를 입력하십시오.
참고 : 스프레드 시트 대신 메모장 응용 프로그램으로 .csv 파일을 열면 변경 내용을 저장할 때 정보가 변경 될 수 있으므로이 파일을 열 것을 권장합니다.
- 자동 실행기 IG를 실행하십시오.
- 앰프, 현미경 컨트롤러 및 조작기 컨트롤러를 켭니다. 엔스앰프 소프트웨어가 작동 중입니다.
- 다음과 같이 명령 행 터미널에서 Python으로 Autopatcher IG를 실행하십시오. 먼저 Autopatcher IG가 설치된 디렉토리 (대부분의 공통 터미널에 대해 "cd"명령)를 변경하고 명령 행 터미널에 "python Autopatcher_IG.pyw"를 입력하고 "Enter"키.
참고 : 현미경 스테이지와 조작기를 차지할 것이므로 Autopatcher IG를 실행하기 전에 조작자 제어 소프트웨어를 실행하지 마십시오. 그러면 Autopatcher IG가 하드웨어를 찾을 수 없게됩니다. 제어 할 추가 모듈 ( 예 : 인라인 히터)이 있으면 Autopatcher IG이 완전히 시작된 후에 매니퓰레이터 제어 소프트웨어를 실행할 수 있습니다.
- 기본 피펫을 보정하십시오.
- 앞에서 설명한대로 패치 피펫을 당깁니다 9 . 풀어 놓은 유리 피펫을 내부 용액으로 채우고 헤드 스테이지에 올려 놓습니다.
참고 : 빈 유리 피펫의 콘트라스트가 다릅니다.현미경 및 부정확 한 교정으로 이어질 수 있습니다. - 피펫 팁을 현미경 시각 필드로 이동하고 초점을 맞 춥니 다. 다이얼 패드를 사용하여 조작기 및 / 또는 현미경 스테이지를 이동하는 경우 키보드의 "z"를 눌러 좌표를 업데이트하십시오.
참고 : 키보드 (현미경 스테이지 : A / D-x 축, W / S-y 축, R / F-z 축, 조작기 : H / K- x 축, U / 좌표가 실시간으로 업데이트되기 때문에 J - Y 축, O / L - Z 축, 1/2 - 단위 번호)이 이동을 제어하는 데 사용됩니다. - 피펫이 장착 된 해당 장치의 주 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)에서 "보정 시작"버튼을 클릭하십시오 ( 그림 2 ).
참고 : 보정이 끝나면 팝업 창이 나타납니다.
참고 : 보정은 자동으로 수행되며 약 3.5 분이 소요됩니다. 동일한 버튼을 클릭합니다 ( "교정 취소"로 전환됨).캘리브레이션 시작)은 캘리브레이션 시도를 중단합니다. - 메인 GUI의 하단에있는 "Save Calibration"을 클릭하여 교정을 저장하십시오 (두 매니퓰레이터의 현재 교정을 저장하고 나중에로드 할 수 있음).
참고 : 낮은 (4 배 또는 10 배) 배율 및 높은 배율 (40 배)에서 시야를 조정해야 보조 조정이 올바르게 작동합니다. 정렬 절차에 사용되는 광학 시스템의 사용자 매뉴얼을 참조하십시오.
- 앞에서 설명한대로 패치 피펫을 당깁니다 9 . 풀어 놓은 유리 피펫을 내부 용액으로 채우고 헤드 스테이지에 올려 놓습니다.
2. 자동 패치 클램프 절차
- 앞에서 설명한대로 급성 뇌 조각을 준비하십시오 10 .
- 패치 클램프 용 유리 피펫을 준비하십시오.
- 레코딩 챔버의 중앙에 하나의 뇌 슬라이스를 배치하십시오. 슬라이스 홀드 - 다운 또는 "하프"로 슬라이스를 안정화하십시오.
- 형광 세포를 감지합니다.
- 4X 렌즈 아래에서 관심 영역을 찾습니다. cli를 켜서 현미경 스테이지 이동ck-to-move ( "CTM") 모드를 선택하고 관심 영역의 중심을 클릭하십시오. 또는 키패드를 사용하여 현미경 스테이지 (A / D - x 축, W / S - y 축, R / F - z 축)를 이동하십시오.
- 고배율 렌즈로 전환하고 키패드의 R / F를 사용하여 현미경을 z 축으로 이동하여 초점을 조정합니다.
참고 : 저배율 및 고배율 렌즈 아래의 초점 평면이 z 축에서 동일하거나 유사하도록 수조 수준을 조정하는 것이 좋습니다. - 메인 GUI 열의 "Unit 0"에서 "Detect Cell"버튼을 클릭하십시오. 설정의 LED 또는 레이저 광원이 TTL 신호로 제어 할 수없는 경우 수동으로 LED / 레이저를 켭니다. 셀 감지가 끝나면 팝업 창이 나타납니다.
- 필요한 경우 LED / 레이저를 끕니다. 셀 좌표 목록이 "메모리 위치"GUI에 나타납니다. 좌표 옆에있는 "X"버튼을 클릭하여 목록에서 원하지 않는 셀을 제거하십시오.
- 또는 대상 세포가 형광 표식이되어 있지 않으면 기본 GUI에서 "마우스 모드"를 클릭하십시오. 관심 세포를 클릭하십시오; 숫자가있는 노란색 점이 셀에 나타나고 셀의 좌표가 "메모리 위치"GUI에 나타납니다.
- 보조 피펫을 보정합니다.
- 내부 용액으로 유리 피펫의 1/3을 채 웁니다. 헤드 스테이지에 부착 된 피펫 홀더에 피펫을로드하십시오.
- 저배율 렌즈를 사용하십시오. 피펫을 시야로 가져 와서 키패드 (H / K-x 축, U / J-y 축, O / L-z 축)를 사용하여 초점을 조정합니다. 장치 1과 장치 2 사이를 전환하려면 "1"과 "2"를 사용하십시오.
- "Load calibration"을 클릭하여 1 차 교정을로드하십시오. 사용중인 장치 아래의 기본 GUI에서 "Secondary calibration"버튼을 클릭하십시오. 예를 들어, 유닛 2가 사용 중이면 "유닛 2"공동의 "Secondary calibration"버튼을 클릭하십시오열. 팝업 창 지침에 따라 고배율 렌즈로 전환하십시오.
- 대상 셀에 패치를 적용하십시오.
- "MultiClamp"( 즉, 앰프) 소프트웨어가 실행 중인지 확인하십시오. "패치 컨트롤"버튼을 클릭하여 "패치 컨트롤"GUI를 엽니 다. 이 GUI를 열려면 몇 분이 걸릴 수 있습니다.
- 기본 GUI "Unit 0"열에서 "40X"를 확인하여 40X 배율 렌즈를 사용하십시오. "메모리 위치"GUI의 좌표 목록에서 관심있는 셀 옆에있는 "이동"버튼을 클릭하십시오. 현미경이 셀로 이동합니다.
- 메인 GUI에서 사용중인 유닛의 CTM 버튼을 클릭하면 마우스 클릭 후 움직임이 가능합니다. 관심 세포를 클릭하십시오; 피펫 팁이 셀로 이동합니다.
- "Patch control"GUI에서 "Patch"버튼을 클릭하십시오.
참고 : 자동 패치가 시작되고 압력과 저항을 다음과 같이 모니터링 할 수 있습니다."Patch control"GUI.- "Unit 1 selected"버튼을 사용하여 두 장치 사이에서 입력 신호를 전환하십시오.
참고 : 시스템은 목표 세포에 접근하고, 부압을 가하고, 세포막 전위를 맞추고, 일련의 압력 및 저항 임계 값과 논리를 기반으로 기가 제형을 탐지합니다. - "Patch control"GUI에서 각각의 버튼을 클릭하여 언제든지 자동 프로세스를 조작 할 수 있습니다. 예를 들어 "패치"버튼을 다시 클릭하여 패치 평가판을 취소하고 "다음 단계"를 클릭하여 임계치에 관계없이 다음 단계로 패치 프로세스를 진행하십시오.
참고 : gigaseal이 형성되었을 때 사용자에게 팝업 창이 표시되고 커다란 부정적 압력과 함께 zap을 적용하는 옵션이 표시됩니다.
- "Unit 1 selected"버튼을 사용하여 두 장치 사이에서 입력 신호를 전환하십시오.
- "예"를 선택하면 zap과 suction을 결합하여 침입 할 수 있습니다. 또는 "아니오"를 선택하여 흡입만으로 침입하십시오.
- 실험 패치 로그를 저장하십시오.
참고 : 패치 시험 사용이 실패하면 팝업 창이 사용자에게 알리고 패치 프로세스가 재설정됩니다. - 2.4 단계로 돌아가서 다른 셀을 사용하여 단계를 반복하십시오.
- 패치 임계 값을 조정하십시오 (선택 사항).
참고 : 초기 피펫 저항 범위, 양압 및 음압, 기가 레지 저항 등의 임계 값. 구성 파일에서 수정할 수 있습니다.- 시스템이 설치된 대상의 "구성"폴더에서 "PatchControlConfiguration.csv"파일을 엽니 다. 각 임계 값에 해당하는 숫자를 변경하십시오. 값의 이름은 변경하지 마십시오. 이 경우 시스템에서 인식 할 수없는 항목이됩니다.
- "Ct"를 눌러 새로운 임계 값을 즉시 구현하십시오.rl + L "프로그램을 재시작하지 않고 프로그램을 다시 시작하면 파일에서 최신 임계 값을 구현합니다.
3. 레코딩 수행하기
참고 : 컴퓨터 제어 마이크로 전극 증폭기의 모드는 성공적인 패치가 완료되면 자동 패치 소프트웨어에 의해 자동으로 현재 클램프 ( "IC")로 설정됩니다. 전체 셀 패치 클램프 녹음은 선택한 녹음 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수 있습니다 (이 시스템에는 녹음 기능이 포함되지 않음). 여러 대상 셀을 식별 한 경우 녹음을 마친 후에 2.4 단계로 돌아가서 다른 셀을 시도하십시오.
- picospritzer (선택 사양)를 사용하여 자동 국소 약물 적용 실험을 수행하십시오.
참고 : 여기에서는 로컬 마약 응용 프로그램 실험을 사용하여 추가 "명령 순서"기능을 사용하여 TTL 신호를 통해 외부 하드웨어를 제어하는 방법을 설명합니다.- 포트 A 차를 연결하십시오.단계 1.2.3에서 설명한대로 스트립 BNC 케이블을 사용하여 디지타이저의 시작 트리거 입력에 이차 DAQ 보드의 접지를 연결합니다. 디지타이저의 디지털 출력 채널 하나를 피코 스피처의 외부 트리거에 연결하십시오.
- 사용자 설명서에 따라 피펫을 준비하십시오. picospritzer 공기 출력을 micromanipulator에 부착 된 약물 퍼프 피펫 홀더에 연결하십시오.
- 선택 약물로 채워진 피펫을로드하십시오. 피펫 홀더에 부착하십시오. 단계 1.7에서 설명한대로 피펫을 보정하십시오.
- 2.6 단계에서 설명한대로 세포를 패치 한 후 "마우스 모드"(메인 GUI에서 전환)에서 카메라보기 GUI를 마우스로 클릭하여 약물 전달을위한 원하는 위치를 선택하십시오. 또는 그리드의 각 픽셀을 대상 위치 중 하나로 그리드를 디자인하려면 "그리드"GUI를 사용하십시오.
참고 : 그리드는 마우스로 드래그하여 카메라보기 GUI에서 조작 할 수 있습니다. - "Command SequenceGUI "에서 약물 피펫이 장착 된 매니퓰레이터 유닛을 선택하십시오."마우스 포인트로드 "또는"그리드 포인트로드 "를 클릭하여 약물 전달을위한 모든 좌표를 가져옵니다.
- 각 좌표 항목을 클릭하여 오른쪽 열에 특정 명령 TTL 신호를 편집하십시오. 첫 번째 명령 항목에서 가장 오른쪽 숫자를 클릭하여 "0"에서 "1"로 바꾸고 + 5V TTL 신호를 보냅니다. 시간 (T)을 원하는 TTL 신호 지속 시간 (ms)으로 설정하십시오.
- 두 번째 명령 입력에서 모든 자릿수를 "0"으로 설정하고 T를 시험판 녹음 길이의 지속 시간으로 설정하십시오. 모든 좌표 항목에 대한 명령을 편집하십시오. 여러 개의 TTL 신호가 필요한 경우 "+"를 클릭하여 명령 항목을 추가하십시오.
참고 : 8 자리 비트는 필요한 경우 보조 DAQ (포트 1 - 3은 펌프와 2 개의 밸브가 차지함)의 포트 A 채널 0-7을 나타냅니다.
- 데이터 수집 모듈에 녹음 프로토콜을 만듭니다.스윕 시작은 외부 시작 트리거에 의해 트리거됨을 나타냅니다. 프로토콜을 편집하여 원하는 시간에 약물을 전달하십시오.
- "명령 시퀀스"GUI에서 왼쪽의 "실행"을 클릭하여 모든 좌표를 실행합니다. 또는 오른쪽의 "실행"을 클릭하여 선택한 시퀀스 만 실행하십시오.
참고 : 피펫은 각 좌표로 이동하여 정의 된대로 TTL 신호를 실행하여 기록 스윕을 시작합니다.
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Representative Results
우리 시스템은 급성 뇌 조각, 뉴런으로 분화 된 마우스 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 및 관심의 대상 채널을 인위적으로 표현하는 HEK 293 세포에서 세포를 패치하는 능력에 대해 테스트되었습니다. 도 3 은 시각 피질에서 형광 표지 된 5 층 피라미드 뉴런을 표적으로하는 Thy1-ChR2-YFP 트랜스 제닉 마우스 (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J)를 사용한 실험을 나타낸다. 표적 세포는 자동으로 확인 된 녹색 형광성 양성 세포 중 하나였습니다 ( 그림 3b ). 그림 3a 는 패치 된 뉴런의 차동 간섭 대비 (DIC) 이미지입니다. 전체 셀 구성은 2.5 ~ 2.6 단계의 자동 패치 프로토콜을 통해 이루어졌으며 단계 전류 주입으로 유발 된 활동 전위로 검증되었습니다 ( 그림 3c )
1 "> 추가적인"Command Sequence "기능을 입증하기 위해 우리는 세포를 패치하는 동안 두뇌 슬라이스의 3 개 위치에 500 mM KCl을 200 ms 동안 전달했습니다 ( 그림 4 ). "Memory Positions"GUI에 좌표가 저장되고 좌표는 "Unit1"아래의 "Command Sequence"GUI에로드됩니다.이 조작자는 KCl- 우리는 왼쪽 열에 500ms 동안 + 5V TTL 신호를 보내고, 보조 DAQ 보드의 포트 A 채널 0에서 10 초 동안 0V ( 그림 4a ) 디지타이저 "시작 트리거"입력에 연결되었습니다. 그림 4c 는 패치 된 셀이 일반 스파이 킹 뉴런임을 보여줍니다. 약물 적용 피펫 (유닛 1)은 세 개의 선택된 위치( 그림 4b ), 전압 클램프 ( 그림 4d )에서 각 애플리케이션에 대해 10 초를 기록했습니다. 그림 4d 의 흔적의 색은 그림 4b 의 경계 색에 해당합니다. KCl이 셀에서 퍼프되었을 때, 큰 내부 전류가 관찰되었고, 이는 KCl이 확산됨에 따라 서서히 감소했다. 적색 형광 염료를 약물 전달의 공간 분포를 나타 내기 위해 KCl 용액에 첨가하고 결합 된 DIC 및 표피 형광 이미징을 사용하여 이미지화 하였다. 이 실험은 TTL 신호를 통해 조작자 / 현미경 운동 및 외부 하드웨어를 제어하기위한 시스템의 용이함과 유연성을 보여줍니다.
그림 1. 압력 제어 장치. A : 밸브 연결 용 인쇄 회로 기판 (PCB), 압력센서 및 공기 펌프. 왼쪽은 프로토콜에 언급 된 출력의 라벨 위치를 나타내는 PCB의 세부 정보를 보여줍니다. 오른쪽은 PCB와 공기 펌프, USB 포트 및 튜빙 사이의 연결을 보여줍니다. B : PCB 용 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 자동 패치 GUI. 프로토콜에 언급 된 버튼은 빨간색 사각형으로 표시되며 번호가 매겨져 있습니다. 1 : 보정 시작, 2 : 보정 저장, 3 :로드 보정, 4 : 2 차 보정, 5 : 셀 감지, 6 : 패치 제어, 7 : 목표 셀 좌표 이동 및 8 : 패치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오..
그림 3. 패치 ChR2 - YFP - 양성 세포의 예. A : DIC 광학 기기에서 40 배 확대. B : 패널 A에 동일한 세포의 형광 현미경 이미지 (488 nm에서의 LED 조명). C : 일련의 과분극 및 탈분극 단계 전류 주입 동안 패치 된 셀의 전류 - 클램프 기록. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 자동 약물 전달 실험 실시. A : "Command Sequence"GUI에로드 된 선택된 위치. 왼쪽 열에는좌표 목록 및 오른쪽 열은 각 위치에 대한 TTL 신호 형식의 명령 목록을 표시합니다. B : 선택한 3 개의 위치에 해당하는 약물 적용 실험 중 스크린 샷. 1 호기는 KCl 함유 피펫이었고 2 호기는 패칭 피펫이었습니다. 시각화를 위해 KCl 용액에 적색 형광 염료를 혼합 하였다. DIC와 형광 이미징을 결합하여 이미지를 얻었습니다. C : 정상적인 스파이크 뉴런을 보여주는 전류 주입 단계. D : 3 개의 위치에서 500 mM KCl 용액을 국부적으로 사용하여 전압 - 클램프 기록을 추적합니다. KCl 적용이 패치 된 셀에 가까웠을 때 시험에서 내부 전류가있는 빨간색 트레이스가 기록되었습니다. 빨간색 화살표는 KCl 적용의 타이밍을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| PCB 콘센트 | DAQ 보드의 포트 이름 | DAQ 보드의 포트 번호 | 말 |
| DOUT V1 | 포트 A 채널 1 | 22 개월 | 제어 밸브 1 |
| DOUT V2 | 포트 A 채널 2 | 23 | 제어 밸브 2 |
| DOUT P | 포트 A 채널 3 | 24 | 제어 공기 펌프 |
| Gr | 바닥 | 29 | 바닥 |
표 1. 인쇄 회로 기판 (PCB) - 보조 데이터 수집 (DAQ) 보드 연결 구성. 이 테이블을 사용하여 PCB 출력 (왼쪽에서 첫 번째 열)을 DAQ 보드의 포트 (왼쪽에서 두 번째 열). 보조 DAQ의 포트 이름 및 번호는 단일 종단 형 모드를 나타냅니다.
표 2. 압력 제어 장치에서 피펫 홀더까지의 배관 연결. 각 연결에 대해 연성 튜빙을 사용하여 회색 상자로 강조 표시된 해당 포트를 연결하십시오 ( 재료 표 참조).
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Discussion
여기서 우리는 체외에서 자동 이미지 유도 패치 클램프 녹음 을 위한 방법을 설명합니다. 이 프로세스의 핵심 단계는 다음과 같이 요약됩니다. 첫째, 컴퓨터 비전은 현미경을 통해 얻은 일련의 이미지를 사용하여 피펫 팁을 자동으로 인식하는 데 사용됩니다. 이 정보는 현미경과 조작자 좌표계 간의 좌표 변환 함수를 계산하는 데 사용됩니다. 컴퓨터 비전은 형광 표식 된 세포를 자동으로 탐지하고 그 좌표를 식별하는 데 사용됩니다. 이 단계는 피펫 타겟팅 및 오픈 소스 Python 프로그래밍 언어, PyQT 및 OpenCV 라이브러리를 사용하는 자동 패치 알고리즘과 통합됩니다.
기존 의 시험 관내 패치 클램프 방법 에 비해,이 시스템은 여러 영역에서 상당한 개선을 이루었습니다. 그것은 인간의 개입을 최소화합니다. 이 시스템은 패치 클램프 실험에서 대부분의 단계를 자동화하여 req를 최소화합니다.인간 개입을위한 의욕. 저배율 / 고배율 현미경 렌즈를 전환하는 것을 포함하여 나머지 수동 단계 중 일부는 추가 동력화 된 하드웨어를 사용하여 자동화 할 수 있습니다.
패치 클램프 방법은 처리량을 향상시킵니다. 이 시스템을 사용하는 패치 클램프 실험은 각 시도에 대해 더 높은 성공률과 짧은 시간을 달성하여 전반적인 처리량을 크게 향상 시켰습니다. 형광 세포 검출 및 피펫 팁 검출을위한 컴퓨터 비전 알고리즘은 매우 견고하며 오류율은 매우 낮습니다. 피펫 팁 검출의 평균 오차는 1.6 μm였으며 형광 세포 검출의 위양성율은 4.9 % ± 2.25 %였다. 기존의 수동 패치 및 자동 패치 사이의 상세한 비교는 6 이루어지고있다.
실험에 대한 자세한 문서화가 가능합니다. 각 시험판의 패치 로그를 임시 저장하고 분석 할 수 있습니다. 그런 상세한이전에 설명서를 수동으로 패치 할 수 없었습니다. 이것은 독특한 실험 조건, 세포 유형, 종 및 슬라이스 준비에서 패칭 실험의 체계적인 분석을 가능하게합니다.
이 방법은 표준 시험관 패치 클램프 장비와의 호환성을 보여줍니다. 이 원고에서 설명한 것처럼 우리의 시스템은 기존 의 시험관 패치 클램프 리그를 보강하여 자동 패치 기능을 수행 할 수 있도록 설계되었습니다. 평면 패치 방식과는 달리,이 시스템은 이미 수동 패치 클램핑을 통해 최소한의 비용으로 장비를 변환하는 실험실에 적합합니다. 동시에 동일한 시스템을 사용하여 수동 또는 반자동으로 패치 할 수있는 옵션이 있습니다.
위에서 언급 한 시스템의 적응성 때문에 하드웨어를 연결하고 소프트웨어를 구성하는 작업은 시스템을 처음 설정할 때 실험자가 수행해야합니다. 문제가 발생할 수 있습니다.특정 하드웨어를 제어하기 위해 올바르지 않은 포트 할당과 부적절한 드라이버 라이브러리로부터. 문제를 해결할 때 1.2-1.4 단계를 참조하십시오.
기존 시스템의 부분 자동화에 비해이 시스템은 급성 뇌 절편 (및 기타 시험 관내 준비)의 기존 시험 관내 패치 클램핑에서 최대 자동화 수준을 달성합니다. 이는 세포 검출에서부터 피펫 교정 , 패치 7 , 11에 이르는 모든 단계에 해당됩니다. 유일한 병목은 패치 피펫을 채우고 변경하는 수동 프로세스입니다. 패치 피펫 재사용의 최근 개발은이 문제를 잠재적으로 해결할 수 있습니다 12 . 슬라이스 준비의 품질 외에도, 실패한 시련에 대한 가장 보편적 인 이유는 매니퓰레이터의 기계적 오류와 챔버에서 슬라이스의 움직임에 기인합니다. 이러한 제한 사항은현재 시스템. 이 문제를 해결하기 위해 피펫 운동을 근접 루프, 실시간 감지 및 제어하기위한 노력이 이루어지고 있습니다.
향후 개발을 위해 DIC 광학 분야의 일반적인 세포 검출에 대한 현재의 형광 세포 검출 기능을 확장하는 데 관심이 있습니다.
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Disclosures
비 임시 특허 출원 "자동화 된 이미지 유도 패치 - 클램프 전기 생리학을위한 시스템 및 방법", 미국 일련 번호 : 15 / 353,719가 2016 년 11 월 16 일에 출원되었다. 번호 : PRF 67270-02.
Acknowledgments
화이트 홀 재단 (Whitehall Foundation)의 재정 지원에 감사드립니다. 소중한 의견에 대해 사무엘 T 키신저 (Samuel T. Kissinger)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488 nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT - 08084 | Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60 V 30 A | Sparkfun | COM - 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED - Basic Red 5 mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED - Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female x Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
References
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- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
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- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
