Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング
Summary
このプロトコルは、合成と性質、組織学的解析および検出に続いてアルツハイマー病モデルを確立する大人のゼブラフィッシュでアミロイド毒性を生成する単量体のアミロイド β42 ペプチドの注入について説明します。集計。
Abstract
アルツハイマー病 (AD) は毒性アミロイド-β42 の積み重ねで (Aβ42) ペプチドはシナプス変性、炎症、神経細胞の死につながる神経変性疾患を衰弱させると学習障害。人間は、神経幹細胞/前駆細胞 (NSPCs) および減らされた神経の増殖能力の障害のため一部広告の場合失われた神経細胞を再生できません。したがって、効率的な再生治療は、増殖を高める必要がありますもと NSPCs。 ゼブラフィッシュ (動脈分布) の神経因性の能力は再生の有機体、設計できるかを基本的な分子プログラムを学ぶことができます。広告に取り組むために治療のアプローチ。このため、ゼブラフィッシュの広告のようなモデルの生成が必要でした。私たちの方法論を使用して、組織の透過能力を持つ大人ゼブラフィッシュ脳に Aβ42 ペプチドの合成誘導体を導入し、病の病理と再生の応答を分析できます。既存のメソッドまたは動物モデル上の利点は、ゼブラフィッシュはどの脊椎動物の脳を自然に再生成でき、したがって内因性の NSPCs より良い人間神経変性疾患の治療に役立つ私たちを教えることができます。したがって、大人ゼブラフィッシュ脳にアミロイド毒性モデルは神経科学と臨床医学の分野で研究のための新しい道を開く可能性があります。また、このメソッドの単純な実行は、コスト効果の高い、効率的な実験的評価できます。本稿では、合成とゼブラフィッシュ脳への Aβ42 ペプチドの注入をについて説明します。
Introduction
広告は、ニューロンの損失によって特徴付けられる慢性の進行性疾患で大脳皮質1,2,3,4、5のシナプスします。広告の古典的な神経病理学的特徴アミロイドペプチドの成膜であり、原線維変化の形成のもつれ (Nft)6。老人斑、アミロイド斑とも呼ばれますは、脳実質5β プリーツ構造を形成するアミロイド β (a β) ペプチドで構成されます。AD 患者における Aβ42 の蓄積には、病気の進行の早期かつ重要な役割があります。広告は、シナプスの機能障害、障害の可塑性と神経細胞の損失7,8,9,10につながるイベントの連鎖をトリガーします。
魚類ゼブラフィッシュ成体脳研究幹細胞の可塑性11,12,13,14,15,の調節に優れたモデルとして16,17,18,19、20広告21,22,23 を含む中枢神経系 (CNS) におけるさまざまな病気 ,24。利用可能な実験方法19,20,25,26,27,28,29,の広大な配列のため30,31, これらの研究は有益であり、実現可能です。ゼブラフィッシュ中枢神経系13,15,32,33,34,35,36,37を補充することが 38, 神経細胞の損失19,39,40,41,42,43後、活性化分子のプログラムを使用しての一部 44。したがって、ゼブラフィッシュ神経変性疾患モデルの確立は、脊椎動物の脳の再生能力と幹細胞生物学に関する新規質問に対処を助けることができます。
最近では、合成 Aβ42 ペプチド (表 1)39を注入することによって成人脳のアミロイド毒性モデルを開発しました。この注射原因神経変性疾患表現型 (例えば, 細胞死、ミクログリア活性化、シナプス変性および記憶障害)、人間の脳の病理を彷彿を惹起するため、ゼブラフィッシュを使用ことができますを示すゼブラフィッシュ脳の神経変性、ペプチドを免疫組織化学的染色と大人ゼブラフィッシュ中枢神経系がすることができます再生の分子機構検出できる Aβ42 には、39が識別されます。このプロトコルを示す cerebroventricular (CVMI) の注入法27,39,45,46を用いたゼブラフィッシュ脳にアミロイド ペプチドの注入アミロイド沈着 (図 1) を模倣します。CVMI では、β シート構造として射出時に集約し、毒性を発揮するペプチドを提供する斬新な方法を提供します。ペプチドは、心室全体の吻尾軸45沿線をターゲット、脳全体均等に配布されます。さらに、このメソッドは、大人ゼブラフィッシュ脳アミロイドの包有物の NSPCs の形態学的および分子応答を解析できます。このような研究は私たち哺乳類で成功脳修復のため、洞察を提供します。本手法は、失われたニューロンと機能回復の補充を誘導する広告のような症状の後再生が成功応答の必要な分子機構を理解する使用できます。
Protocol
この議定書、EU ガイドラインによって提案された標準的な手順 (2010/63) と生物学および薬 (EuFishBioMed) でカールスルーエ研究所の技術 (キット) の魚モデルのヨーロッパの社会。後、ここに記載されているすべてのメソッド (Landesdirektion ドレスデン; 文書番号 TVV-52/2015 年) 倫理委員会によって承認されました。 1 です Aβ42 ペプチド作製 合成ペプチド (表 1</stron…
Representative Results
合成ペプチドを浄化するために使用された高速液体クロマトグラフィーと質量分析法は、精製したアミロイド β ペプチドの特徴に使用されています。A β ペプチドの分離を改善するために 50 ° C に加熱した HPLC カラムとすべての画分を採取しました。正しく合成ペプチドを識別するには、すべての画分の質量分析を行った。高精度のクロマト グラムは、化合物の純度…
Discussion
アミロイド ペプチドは、変異またはさまざまなタグを含めるに変更できます。例えば、スクランブル アミロイド ペプチドを生成することができますとペプチドの N 末端ペプチド最後の蛍光タグでラベルまたはキャリア ペプチド39が付いたできます。同様に、このプロトコルでは、キャリアのペプチドは、細胞浸透性ペプチド TR 深い輸送貨物に有効性のために脳組織<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DZNE とヘルムホルツ協会 (VH-NG-1021)、CRTD、によって支持されたドレスデン工科大学 (FZ 111、043_261518) と DFG (KI1524/6) (c. k.);ライプニッツ学術連合 (SAW-2011 IPF-2) と BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) で、(Y.Z.)。我々 も感謝したいウルリケ ・ ホフマン ペプチド合成用とナンディニ アショーカ、Prayag Murawala エリー田中については手順を撮影中。
Materials
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer’s amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer’s disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer’s disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer’s disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer’s disease?. Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer’s disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. . Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. . Peptides: Chemistry and Biology. , (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
Cite This Article
Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).