Summary

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

Published: October 25, 2017
doi:

Summary

このプロトコルは、合成と性質、組織学的解析および検出に続いてアルツハイマー病モデルを確立する大人のゼブラフィッシュでアミロイド毒性を生成する単量体のアミロイド β42 ペプチドの注入について説明します。集計。

Abstract

アルツハイマー病 (AD) は毒性アミロイド-β42 の積み重ねで (Aβ42) ペプチドはシナプス変性、炎症、神経細胞の死につながる神経変性疾患を衰弱させると学習障害。人間は、神経幹細胞/前駆細胞 (NSPCs) および減らされた神経の増殖能力の障害のため一部広告の場合失われた神経細胞を再生できません。したがって、効率的な再生治療は、増殖を高める必要がありますもと NSPCs。 ゼブラフィッシュ (動脈分布) の神経因性の能力は再生の有機体、設計できるかを基本的な分子プログラムを学ぶことができます。広告に取り組むために治療のアプローチ。このため、ゼブラフィッシュの広告のようなモデルの生成が必要でした。私たちの方法論を使用して、組織の透過能力を持つ大人ゼブラフィッシュ脳に Aβ42 ペプチドの合成誘導体を導入し、病の病理と再生の応答を分析できます。既存のメソッドまたは動物モデル上の利点は、ゼブラフィッシュはどの脊椎動物の脳を自然に再生成でき、したがって内因性の NSPCs より良い人間神経変性疾患の治療に役立つ私たちを教えることができます。したがって、大人ゼブラフィッシュ脳にアミロイド毒性モデルは神経科学と臨床医学の分野で研究のための新しい道を開く可能性があります。また、このメソッドの単純な実行は、コスト効果の高い、効率的な実験的評価できます。本稿では、合成とゼブラフィッシュ脳への Aβ42 ペプチドの注入をについて説明します。

Introduction

広告は、ニューロンの損失によって特徴付けられる慢性の進行性疾患で大脳皮質1,2,3,45のシナプスします。広告の古典的な神経病理学的特徴アミロイドペプチドの成膜であり、原線維変化の形成のもつれ (Nft)6。老人斑、アミロイド斑とも呼ばれますは、脳実質5β プリーツ構造を形成するアミロイド β (a β) ペプチドで構成されます。AD 患者における Aβ42 の蓄積には、病気の進行の早期かつ重要な役割があります。広告は、シナプスの機能障害、障害の可塑性と神経細胞の損失7,8,9,10につながるイベントの連鎖をトリガーします。

魚類ゼブラフィッシュ成体脳研究幹細胞の可塑性11,12,13,14,15,の調節に優れたモデルとして16,17,18,1920広告21,22,23 を含む中枢神経系 (CNS) におけるさまざまな病気 ,24。利用可能な実験方法19,20,25,26,27,28,29,の広大な配列のため30,31, これらの研究は有益であり、実現可能です。ゼブラフィッシュ中枢神経系13,15,32,33,34,35,36,37を補充することが 38, 神経細胞の損失19,39,40,41,42,43後、活性化分子のプログラムを使用しての一部 44。したがって、ゼブラフィッシュ神経変性疾患モデルの確立は、脊椎動物の脳の再生能力と幹細胞生物学に関する新規質問に対処を助けることができます。

最近では、合成 Aβ42 ペプチド (表 1)39を注入することによって成人脳のアミロイド毒性モデルを開発しました。この注射原因神経変性疾患表現型 (例えば, 細胞死、ミクログリア活性化、シナプス変性および記憶障害)、人間の脳の病理を彷彿を惹起するため、ゼブラフィッシュを使用ことができますを示すゼブラフィッシュ脳の神経変性、ペプチドを免疫組織化学的染色と大人ゼブラフィッシュ中枢神経系がすることができます再生の分子機構検出できる Aβ42 には、39が識別されます。このプロトコルを示す cerebroventricular (CVMI) の注入法27,39,45,46を用いたゼブラフィッシュ脳にアミロイド ペプチドの注入アミロイド沈着 (図 1) を模倣します。CVMI では、β シート構造として射出時に集約し、毒性を発揮するペプチドを提供する斬新な方法を提供します。ペプチドは、心室全体の吻尾軸45沿線をターゲット、脳全体均等に配布されます。さらに、このメソッドは、大人ゼブラフィッシュ脳アミロイドの包有物の NSPCs の形態学的および分子応答を解析できます。このような研究は私たち哺乳類で成功脳修復のため、洞察を提供します。本手法は、失われたニューロンと機能回復の補充を誘導する広告のような症状の後再生が成功応答の必要な分子機構を理解する使用できます。

Protocol

この議定書、EU ガイドラインによって提案された標準的な手順 (2010/63) と生物学および薬 (EuFishBioMed) でカールスルーエ研究所の技術 (キット) の魚モデルのヨーロッパの社会。後、ここに記載されているすべてのメソッド (Landesdirektion ドレスデン; 文書番号 TVV-52/2015 年) 倫理委員会によって承認されました。 1 です Aβ42 ペプチド作製 合成ペプチド (表 1</stron…

Representative Results

合成ペプチドを浄化するために使用された高速液体クロマトグラフィーと質量分析法は、精製したアミロイド β ペプチドの特徴に使用されています。A β ペプチドの分離を改善するために 50 ° C に加熱した HPLC カラムとすべての画分を採取しました。正しく合成ペプチドを識別するには、すべての画分の質量分析を行った。高精度のクロマト グラムは、化合物の純度…

Discussion

アミロイド ペプチドは、変異またはさまざまなタグを含めるに変更できます。例えば、スクランブル アミロイド ペプチドを生成することができますとペプチドの N 末端ペプチド最後の蛍光タグでラベルまたはキャリア ペプチド39が付いたできます。同様に、このプロトコルでは、キャリアのペプチドは、細胞浸透性ペプチド TR 深い輸送貨物に有効性のために脳組織<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、DZNE とヘルムホルツ協会 (VH-NG-1021)、CRTD、によって支持されたドレスデン工科大学 (FZ 111、043_261518) と DFG (KI1524/6) (c. k.);ライプニッツ学術連合 (SAW-2011 IPF-2) と BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) で、(Y.Z.)。我々 も感謝したいウルリケ ・ ホフマン ペプチド合成用とナンディニ アショーカ、Prayag Murawala エリー田中については手順を撮影中。

Materials

Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

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Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

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