Summary

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Published: October 25, 2017
doi:

Summary

Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.

Abstract

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una debilitante enfermedad neurodegenerativa en la que la acumulación de amiloide tóxico-β42 (Aβ42) péptidos conduce a degeneración sináptica, inflamación, muerte neuronal y déficit de aprendizaje. Los seres humanos no pueden regenerar las neuronas perdidas en el caso de AD en parte debido a la deteriorada capacidad proliferativa de las células progenitoras neuronales (NSPCs) y reducción de la neurogénesis. Por lo tanto, terapias regenerativas eficaces también deben aumentar la proliferación y capacidad neurogénica NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) es un organismo regenerativo y podemos aprender los programas moleculares básicos que podríamos diseñar enfoques terapéuticos para hacer frente a AD. Por esta razón, fue necesaria la generación de un modelo de AD-como en el pez cebra. Con nuestra metodología, podemos introducir derivados sintéticos de Aβ42 péptido con capacidad penetrante de tejido en el cerebro del pez cebra adulto y analizar la patología de la enfermedad y la respuesta regenerativa. La ventaja sobre los métodos existentes o modelos animales es que pez cebra puede enseñarnos cómo un cerebro vertebrado puede regenerar naturalmente y así nos ayudan a tratar mejor las enfermedades neurodegenerativas humanas dirigiéndose NSPCs endógenas. Por lo tanto, el modelo de toxicidad del amiloide en el cerebro del pez cebra adulto puede abrir nuevas avenidas para la investigación en el campo de la neurología y la medicina clínica. Además, la ejecución simple de este método permite la evaluación experimental rentable y eficiente. Este manuscrito describe la síntesis y la inyección de péptidos de Aβ42 en cerebro de pez cebra.

Introduction

AD es una enfermedad progresiva crónica caracterizada por la pérdida de neuronas y sinapsis en la corteza cerebral1,2,3,4,5. Los sellos clásicos de neuropathological del anuncio son los depósitos de péptidos amiloides y formación de los ovillos enredos (NFTs)6. Las placas seniles, también conocido como placas amiloideas, están compuestas de péptidos amiloide-β (Aß) que forman estructuras de β-plisadas en el parénquima cerebral del5. La acumulación de Aβ42 en pacientes con EA tiene un papel temprano y crítico en la progresión de la enfermedad. Anuncio desencadena una cascada de eventos que llevan a disfunción sináptica y plasticidad deteriorada pérdida neuronal7,8,9,10.

El cerebro adulto del pez cebra teleósteos sirve como un excelente modelo para estudiar la regulación de la célula de vástago plasticidad11,12,13,14,15, 1617,de,18,19,20 y diversas enfermedades en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo AD21,22,23 ,24. Debido a una gran variedad de métodos experimentales disponibles19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, estos estudios son informativos y factible. Pez cebra puede llenar el CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, en parte mediante el uso de programas moleculares activados después de la pérdida neuronal19,39,40,41,42,43, 44. Por lo tanto, establecer un modelo de enfermedad neurodegenerativa en el pez cebra puede ayudar a resolver las preguntas novela sobre biología Regenerativa de capacidad y células madre en cerebros vertebrados.

Recientemente, hemos desarrollado un modelo de la toxicidad del amiloide en cerebro de pez cebra adulto inyectando sintético Aβ42 péptidos (tabla 1)39. Esta inyección causa neurodegeneración fenotipos de patología del cerebro humano (p. ej., muerte celular, la activación microglial, degeneración sináptica y déficits de la memoria), que indica ese pez cebra puede ser utilizado para la obtención de neurodegeneración en cerebro de pez cebra, Aβ42 péptidos pueden ser detectados con los stainings de immunohistochemical y mecanismos moleculares de la regeneración en pez cebra adulto que CNS puede ser identificado39. En este protocolo, demostramos la inyección de péptidos sintéticos de amiloide en el cerebro de pez cebra con cerebroventricular inyección (CVMI) método27,39,45,46 para imitar la deposición amiloidea (figura 1). CVMI ofrece una forma novedosa de entregar los péptidos, que agregan a inyección como estructuras de β-hoja y ejercen toxicidad. Los péptidos se distribuyen uniformemente a través del cerebro, a la zona ventricular a lo largo del eje rostro caudal entero45. Además, este método permite analizar la respuesta morfológica y molecular de las NSPCs en cerebro de pez cebra adulto después de inclusiones amiloideas. Este tipo de estudios nos dará una idea para la reparación exitosa del cerebro en mamíferos. Nuestro método puede utilizarse para comprender el mecanismo molecular necesario de una respuesta exitosa regeneración después de los síntomas de AD-como para inducir la reposición de las neuronas perdidas y recuperación funcional.

Protocol

este protocolo es un procedimiento estándar sugerido por las directrices de la UE (2010/63) y la sociedad europea de modelos de peces en biología y medicina (EuFishBioMed) en Karlsruhe Instituto de tecnología (KIT). Todos los métodos descritos después de aquí han sido aprobados por la Comisión de ética (Landesdirektion Dresden; número TVV-52/2015). 1. preparación de Aβ42 péptido sintetizar péptidos (ver tabla 1) utilizando la química estándar 9-fluor…

Representative Results

HPLC se utiliza para purificar el péptido sintetizado y espectrometría de masas se ha utilizado para caracterizar los péptidos β amiloide purificada. La columna HPLC se calienta a 50 ° C para mejorar la separación de los péptidos Aβ y se recolectaron las fracciones. Para identificar el péptido sintetizado correctamente, se realizó análisis de espectrometría de masas para todas aquellas fracciones. El cromatograma UPLC muestra la pureza del compuesto. La fracción HPLC que prod…

Discussion

Los péptidos amiloides pueden modificarse para incluir variaciones de secuencia o varias etiquetas. Por ejemplo, se puede generar un péptido amiloide revuelto, y los péptidos pueden ser marcados con etiquetas fluorescentes en el N-terminal del extremo del péptido o etiquetados portador péptidos39. Del mismo modo, en el presente Protocolo, el péptido portador es el penetrar en la célula péptido TR debido a su eficacia para el transporte de carga profunda en el tejido cerebral del<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por DZNE y la Asociación Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) y DFG (KI1524/6) (CK); y por la Asociación de Leibniz (Sierra-2011-IPF-2) y el BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). También nos gustaría agradecer a Ulrike Hofmann para síntesis de péptidos y Nandini Asokan, Prayag Murawala y Elly Tanaka durante la filmación del procedimiento.

Materials

Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250×10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50×2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

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Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

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