Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

Published: September 14, 2017 doi: 10.3791/56021
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Summary

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

Abstract

קיומו של אנדותל ובתאים (EPCs) בדם היקפי ומעורבותו vasculogenesis דווחה לראשונה על ידי Ashara ועמיתיו1. מאוחר יותר, אחרים תיעד את קיום סוגים דומים של EPCs שמקורם במח העצם2,3. לאחרונה, Yoder אינגרם הראה כי EPCs נגזר דם חבל הטבור היה גבוה יותר proliferative פוטנציאל לעומת אלה מבודד למבוגרים היקפיים דם4,5,6. מלבד היותו מעורב vasculogenesis כמחנכת, EPCs גם הראו הבטחה כמקור תא ליצירת רקמות מהונדסים כלי הדם והלב שסתום בונה7,8. קיימות תקנות בידוד שונות, חלקן כרוכות המיון התא של תאי תאים (MNCs) נגזר מן המקורות שהזכרנו קודם בעזרת סמנים אנדותל, hematopoietic, או culturing אלה MNCs עם צמיחה אנדותל מיוחדים בינוני, או שילוב של טכניקות אלה9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד, תרבות של EPCs באמצעות והתמחה אנדותל בינוני עם גורמי גדילה, ללא שימוש immunosorting, ואחריו את האפיון של תאים מבודדים באמצעות סופג המערבי, immunostaining.

Introduction

מספר חוקרים חקרו את המאפיינים ואת הפוטנציאל של האדם EPCs5,10,11,12,13. EPCs יכול להיות מתואר מחזורי תאים בעלי היכולת לדבוק רקמת אנדותל באתרים של היפוקסיה, איסכמיה, פציעה או היווצרות הגידול ולתרום היווצרות של כלי דם מבנים חדשים4,14. מעורבותם שנצפה כורוידאלית, בצורה של vasculogenesis כמחנכת, הובילה להבנה של הפתופיזיולוגיה של תאים אלה והשימוש שלהם יישומים טיפוליים4,15, 16. מספר EPCs של הפרט הוכח להיות בקורלציה עם מחלה קרדיו9,15,16,17,18,19 ,20. מחקרים אחרים יש גם הבדיל EPCs לתוך הפנוטיפ פיברובלסט כמו שסתום, הציע כי תאים אלה יכול לשמש עבור הנדסת רקמות הלב שסתומים7,21.

המסוים המולקולות על פני התא צריך לבודד EPCs לא זוהו בבירור עקב אי-התאמות בין חקירות4. הדבקה של MNCs על מטריצה מסוימים, עם חשיפה למגוון רחב של תנאים תרבות, בוצעה על ידי מספר קבוצות1,17,22,23, רומז כי ייתכן EPCs בשם הצגת מאפיינים פנוטיפי שונים. מאפיינים אלה כוללים חוסר יכולת phagocytotic, שפופרת-צורה Matrigel ואת ספיגת של ליפופרוטאין בצפיפות acetylated-דיל. Clonogenic גבוהה ופוטנציאל proliferative הם שני מאפיינים עם EPCs אשר ניתן hierarchized5. EPCs יכול גם טופס במבחנה בקוריאנית כאשר cocultured עם ריאות העובר האנושי fibroblasts4. תאים אלה ידועים לבטא סמני פני השטח של תאי אנדותל וכדי לחלוק חלק סמנים hematopoietic13,24,25. הסמנים ביטוי חיובי זה מקובל עבור phenotyping EPCs הם CD31, CD34, צמיחה אנדותל כלי הדם קולטן 2 (VEGFR2), Willebrand פון פקטור (vWF), CD133, c-Kit, ואת כלי הדם קדהרין אנדותל (VE-קדהרין)4 , 18. תאים המבטאים שיתוף CD90, CD45, CD14, CD115 או אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA) לא נחשבים EPCs בגלל מוגבל proliferative פוטנציאל, היכולת שלהם phagocytose חיידקים, וחוסר יכולת ליצור דה נובו אנושי כלי ויוו4,7. מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה עבור בידודו של אנדותל ובתאים של דם טבורי האנושית ללא צורך תא כלשהו מיון פרוטוקולים. במאמר זה, השתמשנו CD31, CD34 ו VEGFR2 כסמני חיובית, עם α-SMA כאינדיקטור שלילי.

במאמר זה, אנו מציעים שיטה של בידוד ושל culturing ובתאים אנדותל של דם טבורי ללא תא מיון באמצעות התמחה מדיום הגידול אנדותל עם גורמי גדילה (EGM). EGM זו מכילה כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) ואשר גורם הצמיחה פיברובלסט (FGF), לשפר את ההישרדות, התפשטות והעברה של תאי אנדותל26. זה כולל גם חומצה אסקורבית, האחראית על שמירה על המורפולוגיה המרוצף של תאים; דמויי אינסולין גורם גדילה-1 (IGF-1), אשר מספק האנגיוגנזה ותפקוד הנדידה; הפארין, אשר גורמת לשיפור יציבות לטווח ארוך של גורמי גדילה בינונית26. גורמי גדילה אחרים שיתווספו המדיום התרבות תאי אנדותל כולל תוספי עם גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), אשר מסייע התפשטות תאים מגרה בידול, ואת הידרוקורטיזון, אשר sensitizes לתאים EGF26 . אנו מראים כי השימוש של מדיום הגידול הספציפי הזה מניב מספר גבוה יותר של EPCs לעומת אנדותל הבזליים בינוני (EBM) או של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה בוצע באישור אוניברסיטת ארקנסו הועד המוסדי (אישור מספר 16-04-722). יחידות דם חבל הטבור היו שנאספו ציטראט פוספט תמיסת דקסטרוז (שיקגו) ב ארקנסו בנק דם טבורי, יחידות לא מימש את הדרישה עבור אחסון נתרמו למחקר. כבל יחידות דם היו couriered למעבדה תוך 24 שעות של אוסף בטמפרטורות סביבה.

1. בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי

  1. הכנה של ריאגנטים.
    1. להכין EGM על-ידי הוספת אנדותל הבזליים בינוני (EBM) 10% סרום שור עוברית (FBS) בתוספת 20 ng/mL של פקטורי גדילה דמויי אינסולין (IGF), חומצה אסקורבית µg/mL 1, 5 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (rhEGF), µg 22.5/mL הפארין, 0.5 ng/mL כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), יחד עם 10 ng/mL של recombinant האנושי פיברובלסט גורם גידול B (rhFGF-B), 0.2 הידרוקורטיזון µg/mL, ו-2% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין. לעקר את המדיום תרבות באמצעות polyethersulfone (פסי) 0.2 µm ממברנה מסנן ואקום.
    2. הכן עכברוש הזנב אני קולגן פתרון-ריכוז של 50 µg/mL באמצעות חומצה אצטית N 0.02 נקודות. לעקר את הפתרון הזה באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm.
    3. מעיל מראש צלחות 6-ובכן עם 2 מ של החולדה מוכנה הזנב אני קולגן פתרון עבור כל טוב. למקם אותם בתוך אינקובטור ומתוחזק על 5% CO 2 ו- 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה לפני זריעה.
    4. לדלל כ 25 מ של דם טבורי עם הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS)-ריכוז 1:1.
    5. Assay הכן רדיו-חיסונית משקעים (ריפה) המאגר באמצעות 150 מ מ נתרן כלורי, 1% טריטון X-100, 0.5% נתרן deoxycholate, 1 מ מ β-glycerophosphate, מרחביות 0.1% ו- 50 מ מ טריס (pH 8.0).
  2. בידוד של אנדותל ובתאים.
    1. כל חמים שהוכנו ריאגנטים באמבט מים ומתוחזק על 37 ° C לפני בידוד.
    2. להוסיף 20 מ של צפיפות בינונית ריאגנט הדרגתי. שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל.
    3. בזהירות שכבה 20 מ של דם טבורי מדולל בצינור צנטריפוגה המכיל צפיפות בינונית מעבר צבע מבלי לשבור שכבה זו על-ידי כיוון על פיפטה לכיוון הקירות הצדדיים של הצינור.
    4. להפריד את מרכיבי הדם בהתבסס על צפיפות שלהם ( איור 1) על-ידי צריך שתוציאו ב g x 800 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם הבלמים של הרוטור צנטריפוגה חופש. נא לא להפריע הרבדים השונים.
    5. להסיר את השכבה פלזמה על ידי בקפידה pipetting זה יצא הצינור מבלי להפריע תא שני שכבות עד הקצה פיפטה הוא מסוגל להגיע את MNC שכבה (ראה איור 1). למחוק פלזמה שהוסר.
      הערה: בעת שימוש פיפטה טיפים להסרת הפלזמה, להשאיר שכבה קטנה של פלזמה מעל לשכבה MNC ( איור 1) כדי להפחית הפרעות.
    6. לאסוף את המעיל באפי המכיל את MNCs באמצעות מזרק לגריל של מחט בקוטר 18. ולהעביר אותו ל שפופרת צנטרפוגה טריים.
    7. להוסיף אמצעי שווה של EBM לצנטריפוגה MNCs. שנאספו הצינורות האלה ב 500 x g 10 דקות ב-4 ° C. להשליך תגובת שיקוע.
      הערה: בגדר תא יופיע אדום בגלל הנוכחות של תאי דם אדומים/אריתרוציטים.
    8. הוסף 5 מ של אמוניום כלוריד לפתרון lyse כדוריות דם אדומות. דגירה הצינורית הזאת על קרח למשך 5-10 דקות, ברעידות ומדי פעם.
      הערה: זהירות יש לנקוט במהלך שלב זה לא תעלה על משך הזמן, כפי שהוא יכול להיות מזיק MNCs.
    9. Centrifuge הצינורות ב 500 g x 10 דקות ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע. אם אריתרוציטים נמשכות, חזור על שלבים 1.2.8 ו 1.2.9 עד אין צבע אדום הוא ציין בגדר.
    10. Resuspend בגדר ב EGM מוכן ולהשתמש את hemocytometer כדי לספור את MNCs.
    11. וביופסיה העכברוש הזנב אני מצופים קולגן צלחת 6-טוב (מתוך שלב 1.1.3) ולשטוף הבארות שלוש פעמים עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    12. זרע בגדר MNC resuspended ב EGM לצלחת קולגן-ריכוז של עונה 1 פרק 10 7 MNCs כל היטב. מניחים אותה 37 ° C, 5% CO 2 מיכלים.
    13. לאחר 24 שעות, תשאף המדיום ולשטוף הבארות פעם אחת עם EGM. להוסיף 3 מ"ל של מדיום EGM מכל קידוח ולמקם אותו בחזרה 37 ° C, 5% CO 2 מיכלים.
    14. לחדש את צלחת בינונית EGM טריים כל יום במשך 7 ימים. לאחר 7 ימים, שינוי המדיום EGM בכל יום אחר.
    15. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, לקחת תמונות של צלחת 6-ובכן כל יום כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תאי אנדותל מושבות. לסמן את הצלחת היכן המושבות עולות כדי לעקוב אחר הצמיחה שלהם.
      הערה: בדרך כלל לוקח בין 5 ל 9 ימים על המושבות להופיע בתרבות.
  3. הרחבה של אנדותל ובתאים.
    1. את המעיל. הבקבוק התרבות T-25 עם עכברוש הזנב אני קולגן (50 µg/mL) למקם אותו ב- C ° 37, 5% CO 2 מגשים לפחות 60 דק. וביופסיה ואת לשטוף את הבקבוקון תרבות תא T-25 שלוש פעמים עם PBS 1 x לפני זריעה התאים.
    2. Trypsinize המושבות תא אנדותל כאשר הם מגיעים כ 3 מ מ גודל באמצעות µL 150 של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון כל היטב. למקם את הצלחת 6-ובכן בחזרה 37 ° C, 5% CO 2 מגשים עבור מינימום 2-3
    3. טפח בעדינות את הצלחת 6-טוב מכך התאים המצורפת. מיד להוסיף 2 מ של EGM ולשחזר את התאים בתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל.
    4. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולחשב את צפיפות זריעה הראשונית-
      5. צינורות
    5. ספין לצנטריפוגה 15 מ"ל ב 400 g x עבור 5 דק Resuspend בגדר תא ב EGM, את הבקבוק T-25 עם ~ 500,000 תאי זרע. לסמן את הבקבוק הזה. כמו מעבר 1 ולמקם את הבקבוק T-25 חזרה 37 ° C, 5% CO 2 מיכלים.
      הערה: תאים יכול להיות מצופה EBM, DMEM כדי להשוות את הצמיחה עם EGM.
    6. עבור עוד קטעים, הבקבוק מגיעה למפגש 90%, בצע שלבים 1.3.1 - 1.3.5, reseed את התאים-10 תאים/ס מ 4 2 על המבחנות תרבות תא T-75 או T-175. המשך לאפיון של תאים מבודדים (שלבים 2 ו- 3).

2. אפיון מבודד התאים באמצעות ווסטרן סופג

  1. µL 50-100 הוספה של פירוק מאגר על כל מעבר בעת ביצוע השלבים הרחבה כדי לאפיין את התאים מבודד. לאסוף את החלבונים כ 500,000 או יותר מתאי.
  2. פיפטה למעלה ולמטה נמרצות קרע את התאים ולשחרר את החלבונים. לאסוף ולהעביר את החומר הממתן ל צינור microcentrifuge.
  3. לסובב את הצינור microcentrifuge ב 500 x g ולהעביר בזהירות את תגובת שיקוע ל צינור microcentrifuge. תווית ולאחסן את הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך-
  4. לכמת את כמות החלבונים בצינור כל שימוש או ברדפורד ' assay s או BCA 27 , 28 , 29.
  5. לבצע את המערבי סופג באמצעות הליכים סטנדרטיים 27 , 28 , 29. ניתוח µg 5 של חלבון הכולל עבור הביטוי של CD31, CD34, VEGFR2 וα-SMA. השתמש α-טובולין על נירמול הנתונים.

3. עקיף Immunofluorescence

  1. Sonicate coverslips זכוכית מ מ 18 דקה 50% אתנול, לייבש אותם. להשאיר את coverslips נקי בצלחת 12-ובכן לילה ב למכסה אבטחה עם אולטרה אור על לחטא אותם.
  2. מעיל coverslips עם 50 & #181; g/mL של עכברוש הזנב אני קולגן ולהעביר לצלחת 37 ° C, 5% CO 2 מגשים לפחות 60 דקות
  3. תשאף הקולגן ולהוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x לצלחת 12-טוב לשטוף את coverslips. האחות של PBS 1 x וחזור פעמיים.
  4. זרע 250,000 תרבותי EPCs כל טוב ובמקום אותם חזרה 37 ° C, 5% CO 2 חממה לפחות 3 ימים לפני ביצוע immunostaining.
  5. לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 1 x PBS. להוסיף 1 מ"ל של מתנול כקרח מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לתקן את התאים.
  6. לבצע את immunostaining באמצעות 28 , 27 , 29 פרוטוקול סטנדרטי. להשתמש את הנוגדנים שלהם דילולים המתאים (למשל, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100), VEGFR2 (1:50)).
  7. תמונות של coverslips immunostained באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידוד והרחבה של אנדותל ובתאים:
שרטוט (איור 1) מסופק המתארים את פרוטוקול הכולל. הרבדים רכיב דם שונות נצפו בעקבות צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע של דם טבורי האנושי צפיפות בינונית הדרגתיות. לאחר זריעה MNCs על גבי הלוחות שטופלו קולגן, המוצלח מושבות נצפתה לראשונה בין 5 ימים ו- 7 (איור 2א). מושבות אלה המשיכה לגדול והיה מורפולוגיה תאים בצורת כישור (איור 2א-2D) בשלבים המוקדמים, אשר לאחר מכן התקדם ריצוף דמוי מורפולוגיה (איור 2E-2F). איור 3 א מציג את המספר הכולל של תאים לעומת הזמן בתרבות, כל נקודת נתונים ומייצג את מספר התאים נקצרו כל קטע המצטבר. איור 3 B מתאר את הזמן הממוצע נלקח למען המושבה הראשונה להתעורר בצלחת 6-ובכן שטופלו קולגן לאחר זריעה של MNCs.

אפיון באמצעות סופג המערבי:
איור 4 א מראה נציג התוצאות של המערב כתם קרום זה היה כנגדם נוגדנים שונים. התוצאות שלנו מראים כי התאים היו חיוביים עבור CD31 ו- CD34. הביטוי של CD31 (איור 4B) ו CD34 (איור 4C) שנראה ירידה מעל הקטעים הבאים, בעוד VEGFR2 (איור 4D) בא לידי ביטוי באותה מידה קטעים מאוחר יותר, עם הראשונה קטע ביטוי גבוה יותר. גם הבחנו כי EPCs לא הביעה את התא mesenchymal סמן α-SMA (איור 4E). חבל הטבור האנושי הווריד תאי אנדותל (HUVEC), lysates תא valvular תאים ביניים (הקורבן) שימשו פקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה. HUVECs ידועים לבטא CD31, CD34 ו- VEGFR2, בעוד הקורבנות אקספרס α-SMA.

Figure 1
איור 1 : סכימטי של בידוד EPC. התחל הבידוד על ידי חוט המדללת. דם עם HBSS ואת שכבות זה בקפידה על המדיום הדרגתיות צפיפות, כמוצג. צפיפות צנטריפוגה הדרגתי של הדם בשכבות מבוצע כדי להשיג שכבות נפרדות של הדם, אשר מורכבת MNCs (באפי המעיל), צפיפות בינונית הדרגתיות, גרנולוציטים ו RBCs. התמונה משנה סיפקה מראה שכבות שונות אלה. MNCs נאספים וכוח reseeded לצלחת תרבות תא שטופלו קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . ההתקדמות של המושבה תא. (A-E) תמונות מלון נציג בהיר-שדה של EPC המושבה התקדמות לאורך זמן. שימו לב כי המושבה בצורת פלך בתאים בשלבים מוקדמים, אימוץ המורפולוגיה המרוצף. (E) תמונה ייצוגית של EPC תרבותי בבקבוקון T-75-מעבר 3. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: עקומות גדילה של EPCs. (א) הגרף מתאר את מספר התאים גדלים על פני תקופה של זמן, כל אחד נקודת הנתונים מציין התא מספר נקצרו במהלך כל קטע (P0 - P10) (n = 4). זמן (B) נלקח למען המושבה EPC הראשון להופיע בצלחת 6-טוב (n = 4). קווי השגיאה מציינות את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). אין מובהקות סטטיסטית נמצאה באמצעות חד-כיווני אנובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : סופג המערבי. (א) תספיג חלבון ממברנה צבעונית עם נוגדנים שונים. HUVEC lysate ויק lysate שימשו כפקדי חיובי. (B) בעוצמה ממוצעת של להקות CD31 מנורמל עם α-טובולין. (ג) בעוצמה ממוצעת של להקות CD34 מנורמל עם α-טובולין. (D) בעוצמה ממוצעת של להקות VEGFR2 מנורמל עם α-טובולין. (E) בעוצמה ממוצעת של α-SMA להקות מנורמל עם α-טובולין (n = 3-6). קווי השגיאה מציינות ב- SEM. אין מובהקות סטטיסטית נמצאה באמצעות חד-כיווני אנובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: Immunostaining. תמונות נציג של EPCs תרבותי ב- EGM עבור 7 ימים ו- immunostained-קטעים שונים עבור CD31, CD34, VEGFR2 וα-SMA. סולם בר - 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplemental Figure 1
משלימה איור 1: הגרף מתאר את מספר התאים ליחידת שטח על פני תקופה של 7 ימים כאשר תרבותי EGM, EBM, ו DMEM. EGM הראו צמיחת תאים גבוה יותר לעומת התקשורת (EBM ו- DMEM). הנתונים הראה מובהקות סטטיסטית, עם p < 0.01, באמצעות חד-כיווני אנובה (n = 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplemental Figure 2

/ > משלימה איור 2: להחליפן בתמונות של EPCs תרבותי ב EBM עבור 7 ימים ו- immunostained CD31, CD34, VEGFR2 של α-SMA. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplemental Figure 3
משלימה איור 3: תמונות נציג של EPCs תרבותי ב- DMEM עבור 7 ימים ו- immunostained CD31, CD34, VEGFR2 של α-SMA. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי שהוזכר קודם, מחסידי EPCs בעלי מורפולוגיה המרוצף. MNCs מבודד שלנו התקדם מ מושבה תא בצורת כישור (איור 2א-2D) בשלבים המוקדמים למושבת קאבלסטון (איור 2E-2F) על פני תקופה של 10 ימים בתרבות. EPCs סומנו כאנטי באופן שונה על ידי קבוצות מחקר שונות, כלומר כמו תאים מאוחר קדמון אנדותל10, המושבה אנדותל ויוצרים תאים5, או תאי אנדותל קדמון12. יצוין כי תאים אלה זהים מבחינה פונקציונלית ולבטא את דומה סמני פני שטח התא. מספר התאים שנצפו במהלך תקופת תרבות (איור 3) עלה ל כמעט 108 תאים, מקביל לפרסומים קודמים, טיפוסי של הפוטנציאל proliferative גבוה של3,EPCs5. ואכן, התברר כי EPCs המתקבל דם טבורי האנושית הראו של גבוהה proliferative פוטנציאל ולא הפגינו מספר האוכלוסייה הטווח לפני שעברו הזדקנות ביולוגית בהשוואה EPCs מבודד למבוגרים דם היקפיים אנושי5 , 10.

התוצאות blotting המערבי שלנו (איור 4א) הראו הנוכחות של CD31, CD34 ו VEGFR2 lysates התא המתקבל EPCs בהשוואה הפקד חיובי, HUVEC. HUVECs אקספרס CD31, CD34 ו VEGFR2 ומופעל ויק אקספרס α-sSMA. בדומה דוחות קודמים10,18, הביטוי של CD31 ירד עם מעברים גבוה יותר. התבנית ביטוי גם היה דומה במקרה של CD34 ו- VEGFR2, שבו שני הסמנים שבאו לידי ביטוי חריפה במעבר הראשון, בסכומים נמוכים יחסית אך שווים קטעים מאוחר יותר. נתונים אלה מראה מגמה כי הוא מסכים עם התוצאות של קבוצות קודמות, שבו שימשו פרוטוקולים מבוססי immunosorting לבידוד EPCs נגזר דם טבורי12. באופן כללי, EPCs לא מבטא סמנים mesenchymal, וכדי לוודא כי התאים מבודד, לא היו mesenchymal בטבע, אנו immunolabeled שלנו ממברנות תספיג עם α-SMA. התוצאות שלנו מראים בבירור שהיה שם אין ביטוי α-SMA EPCs בתרבית בהשוואה lysates תא בקרה חיובית שנאסף הקורבנות, אשר מוצג ביטוי חזק של α-SMA נוגדן.

כדי להדגים כי EGM מאפשר התפשטות תאים מוגבר לעומת תקשורת תרבות אחרים המשמשים EPCs, אנחנו תרבותי בתאים שלושה סוגים שונים של מדיה: DMEM, EBM, EGM (קרי, EBM בתוספת גורמי גדילה, כפי שתואר קודם לכן). כולם היו בתוספת 10% FBS. אנחנו נזרע תאים של קטעים שונים כל טוב של צלחת 12-. טוב. משלימה איור 1 מציג את מספר התאים ליחידת שטח כל היטב לאורך זמן בתרבות ניסוחים מדיה שונים. נציין כי EPCs בתרבית ב- EGM הראו עלייה מתמדת במספר התאים, עבור תאים EBM, היה קצב איטי של גידול במספר התאים במהלך שלושת הימים הראשונים, אשר לאחר מכן plateaued. הדבר מצביע על כי EPCs עדיין ישרוד EBM, אך בהעדר גורמי גדילה הפריע התפשטות. נציין גם כי EPCs תרבותי בהתדרדרות DMEM במספר, רומז כי זה ניסוח בינוני מסוים אינו מתאים עבור הישרדות או התפשטות שלהם. Immunostaining הנתונים מראים EPCs בתרבית ב- EGM (איור 5) הביע CD31 יותר בהשוואה EPCs תרבותי EBM (משלימה איור 2), DMEM (משלימה איור 3). השוואה בין איור 5 עם תוספת איור 2 ו- 3 איור משלים, ניתן לראות כי התאים היו לא מזוהם עם סוגי תאים אחרים. כמו כן, כאשר משווים את immunostained EPCs (איור 5), אנחנו יכולים איכותית המדינה כי הביטוי של CD31 ו- CD34 ירד מעל מעברים גבוה יותר, התומכים שלנו נתונים תספיג (איור 4).

לחזור ולהדגיש, המטרה העיקרית של הפרוטוקול המוצע שלנו היא להדגים שזאת ניתן לבודד ובתאים אנדותל בדם culturing MNCs מתמחה בתקשורת סלקטיבי. זה כדי להראות כי EPCs יכול להיות בודדה בלי ציוד מתוחכם ונהלים, בניגוד לשיטות אחרות המערבות את השימוש cytometry זרימה - גם מיד לאחר MNC בידוד1,3,20 , 30 או אחרי המושבות גדלו לתוך טפט - ואחריו replating4,10,12,13,23. המושבות EPC מופיעים בדרך כלל בין ימים 5 ו- 9. השיטה שלנו היא לפיכך שיטה מהירה יותר חסכוני יותר לבידוד EPCs. המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא הביטוי של CD31 ו- CD34 פוחתת עם הקטעים הבאים, אשר יכול להמליץ כי התאים מאבדים את שלהם פנוטיפ קדמון. לפיכך, מומלץ שזה כדאי להשתמש תאים המתקבל מעבר 5 או נמוך יותר כדי לערוך ניסויים אם משתמש בפרוטוקול זה.

אמצעי זהירות יש לנקוט לאחר צנטריפוגה את צפיפות כדי לא להפריע את השכבות השונות כאשר לוקחים הצינורות centrifuged חזרה מכסה המנוע, וגם בעת הסרת. הפלזמה. צעד קריטי נוסף מתייחס פירוק כדוריות דם אדומות, שבו זמן דגירה ארוך יותר עלולים להזיק את MNC. לכן מומלץ לא לחזור על שלב זה יותר מפעמיים. ואכן, מאז השאיפה בינוני מתבצעת 24 שעות לאחר ציפוי, כמויות קטנות של אריתרוציטים יוסרו, כפי שהן ללא-חסיד. מצעים חלופיים, כמו fibronectin או ג'לטין, אמנם לא נבדקו על ידי בנו, יכול לשמש גם לפי הפרוטוקולים ספציפי ליצירת תא תרבות ציפויים. על ידי העסקת מינימאליים של השלבים הראשונים, חוקרים עשויים בודד שאינו מחסידי EPCs30.

לסיכום, אנו מדווחים על שיטה של בידוד EPCs מדם חבל הטבור. חשוב לציין כי EPCs לא להביע סמני כמו α-SMA, רומז שהם אינם תאים דמויי mesenchymal. אכן, α-SMA משמש סמן חשוב כאשר מנסה ללמוד את המעבר אנדותל-mesenchymal (אנדו-MT) של EPCs. אנדו-MT הוא תהליך transdifferentiation הסלולר שבמהלכו תאי אנדותל ידועים להפסיד סמני הספציפי שלהם וכדי להפוך את הפנוטיפ mesenchymal דמוי תא. הוכח כי EPCs יכול לחוות את המעבר הזה בנוכחות צורה של גורם גדילה-β7 , באפשרותך לשחרר חוץ-תאית קרום חלבונים על פיגומים רקמות מהונדסים שלהם8. כל אלה המתכוונים ההבטחה של EPCs לשימוש כמקור תא עצמיים כדי ליצור שסתום הלב או אחרים בונה רקמות מהונדסים לב וכלי דם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

חומר זה מתבסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס CMMI-1452943 ועל ידי המכללה בהצטיינות אוניברסיטת ארקנסו. אנחנו גם רוצים להכיר את בנק דם טבורי ארקנסו סיפק לנו כבל יחידות דם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A) For isolation and culturing
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermofisher Scientific 10378016
Ficoll-Paque GE Heatlhcare 17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution Thermofisher Scientific 14170-112
Ammonium Chloride Stem Cell Technologies 7850
1x Phosphate Buffer Saline Thermofisher Scientific 14190250
Rat Tail I Collagen Corning 354236
Glacial Acetic Acid Amresco 0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25300054
HEPES buffer Thermofisher Scientific 15630080
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Thermofisher Scientific 10566-016
B) Antibodies and cell lysates
CD31  Abcam ab28364 1:250 dilution  for Western blotting
CD34 Santa Cruz Biotechnology sc-7045 1:100 dilution for Western blotting
α-SMA abcam ab5694 1:100 dilution for Western blotting
α-tubulin abcam ab7291 1:2,500 dilution for Western blotting
VEGFR2 abcam sc504 1:100 dilution for Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysate Santa Cruz Biotechnology sc24709 
Valve interstitial cell lysate Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer
C) Western blotting and immunostaining
10x Tris/Glycine/SDS buffer Biorad 161-0772 Used as running buffer
10x Tris/Glycine buffer Biorad 161-0771 Used as transfer buffer
Immobilon-FL transfer membrane Merck Millipore IPFL0010 This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane
4x Laemmli sample buffer Biorad 161-0747
2-mercaptoethanol Biorad 161-0710
10% Criterion TGX precast gel Biorad 5671033
Prolong Gold antifade Thermofisher Scientific P36930 Used for mounting immunostained coverslips for long term storage
Methanol VWR Analytical BDH1135-4LP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  2. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
  3. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
  4. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  5. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  6. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  7. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
  8. Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
  9. Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
  10. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
  11. Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
  12. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  13. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
  14. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
  15. Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
  16. Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
  17. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
  18. Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
  19. Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
  20. Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
  21. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
  22. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
  23. Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
  24. Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
  25. Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
  26. Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
  27. Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
  28. Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
  29. Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
  30. Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 127 ובתאים אנדותל במחזור אבות מאחר ובתאים אנדותל תאי תאי דם הנדסת רקמות דם טבורי
בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravishankar, P., Zeballos, M. A.,… More

Ravishankar, P., Zeballos, M. A., Balachandran, K. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (127), e56021, doi:10.3791/56021 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter