L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l'utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'esistenza di cellule progenitrici endoteliali (EPC) nel sangue periferico e il suo coinvolgimento nella vasculogenesi fu riportata da Ashara e colleghi1. Più tardi, altri documentata l'esistenza di tipi simili di EPCs provenienti dal midollo osseo2,3. Più recentemente, Yoder e Ingram ha mostrato che EPCs derivate da sangue del cordone ombelicale aveva un potenziale proliferativo più elevato rispetto a quelli isolati da adulto periferico sangue4,5,6. Oltre ad essere coinvolti nella vasculogenesi postnatale, EPCs inoltre hanno indicato la promessa come una fonte di cellule per la creazione di ingegneria tissutale vascolare e cuore valvola costrutti7,8. Esistono diversi protocolli di isolamento, alcuni dei quali coinvolgono l'ordinamento delle cellule delle cellule mononucleari (MNCs) derivate dalle fonti indicate in precedenza con l'aiuto di markers endoteliali ed ematopoietiche, o coltura questi MNCs con crescita endoteliale specializzata medio, o una combinazione di queste tecniche9. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e coltura di EPCs utilizzando specializzati endoteliale supplementato con fattori di crescita, senza l'uso di immunosorting, seguita dalla caratterizzazione di cellule isolate mediante Western blotting e immunostaining.
Introduzione
Parecchi ricercatori hanno studiato le caratteristiche e le potenzialità di umano EPCs5,10,11,12,13. EPC possono essere descritto come fare circolare le cellule che hanno la capacità di aderire al tessuto endoteliale nei siti di ipossia, ischemia, lesioni o di formazione del tumore e contribuiscono alla formazione di nuove strutture vascolari4,14. Loro coinvolgimento osservato nella neovascolarizzazione, sotto forma di vasculogenesi postnatale, ha c....
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Protocollo
questa ricerca è stata condotta con l'approvazione dell'Università di Arkansas Institutional Review Board (numero di omologazione 16-04-722). Unità di sangue del cordone ombelicale sono stati raccolti in soluzione di citrato fosfato destrosio (CPD) presso l'Arkansas Cord Blood Bank, e unità che non soddisfano il requisito per l'archiviazione sono stati donati per la ricerca. Unità cordonali erano corriere al laboratorio entro 24 h dalla raccolta a temperatura ambiente.
1. isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale
- preparazione dei reagenti.
- EGM preparare aggiungendo....
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Risultati
Isolamento ed espansione di cellule progenitrici endoteliali:
Uno schema (Figura 1) viene fornito raffigurante il protocollo generale. I livelli di componenti del sangue diverso sono stati osservati dopo centrifugazione in gradiente di densità del sangue del cordone ombelicale con il mezzo di gradienti di densità. Al momento di semina MNCs sulle piastre collagene-trattati, la conseguenza delle colonie in primo luogo è stata osservata fra g.......
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Discussione
Come accennato in precedenza, aderente EPCs possiedono una morfologia di ciottoli. Nostro MNCs isolato progredito da una colonia di cellule fusiformi (Figura 2A-2D) nelle prime fasi di una colonia di ciottoli (Figura 2E-2F) per un periodo di dieci giorni nella cultura. EPC sono state etichettate in modo diverso dai gruppi di ricerca differenti, vale a dire come ritardati di cellule progenitrici endoteliali10
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 e dall'Università di Honors di Università dell'Arkansas. Vorremmo anche riconoscere l'Arkansas Cord Blood Bank per averci fornito unità cordonali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| A) Per l'isolamento e la coltivazione | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | Questo prodotto viene fornito con tutti i fattori di crescita necessari per rendere il |
| siero fetale bovino | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| salina bilanciata di Hank | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Cloruro di ammonio | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x tampone fosfato soluzione salina | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Coda di ratto I Collagen | Corning | 354236 | |
| Acido acetico glaciale | Amresco | 0714-500ML | |
| 0,05% tripsina-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| tampone HEPES | Thermofisher Scientific Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Anticorpi e lisati cellulari | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | Diluizione 1:250 per Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | Diluizione 1:100 per Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | Diluizione 1:100 per Western blotting |
| α-tubulina | abcam | ab7291 | Diluizione 1:2.500 per Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | Diluizione 1:100 per Western blotting |
| Lisato di cellule endoteliali della vena ombelicale umana | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| di cellule interstiziali valvolari | Linea cellulare primaria coltivata dal proprio laboratorio e lisata con tampone RIPA | ||
| C) Western blotting e immunocolorazione | |||
| 10x tampone Tris/Glycine/SDS | Biorad | 161-0772 | Utilizzato come tampone di corsa |
| 10x tampone Tris/Glycine | Biorad | 161-0771 | Utilizzato come tampone di trasferimento |
| Membrana di trasferimento Immobilon-FL | Merck Millipore | IPFL0010 | Si tratta di una membrana di trasferimento PVDF che ha 45 µ m dimensione dei pori ed è menzionato nel protocollo come membrana western blot |
| 4x tampone campione Laemmli | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoetanolo | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX gel prefabbricato | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher | Scientific P36930 | Utilizzato per il montaggio di vetrini coprioggetti immunocolorati per la conservazione a lungo termine |
| Metanolo | VWR analitico | BDH1135-4LP |
Riferimenti
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J ....
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Ristampe e permessi
