Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l'utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.
Abstract
L'esistenza di cellule progenitrici endoteliali (EPC) nel sangue periferico e il suo coinvolgimento nella vasculogenesi fu riportata da Ashara e colleghi1. Più tardi, altri documentata l'esistenza di tipi simili di EPCs provenienti dal midollo osseo2,3. Più recentemente, Yoder e Ingram ha mostrato che EPCs derivate da sangue del cordone ombelicale aveva un potenziale proliferativo più elevato rispetto a quelli isolati da adulto periferico sangue4,5,6. Oltre ad essere coinvolti nella vasculogenesi postnatale, EPCs inoltre hanno indicato la promessa come una fonte di cellule per la creazione di ingegneria tissutale vascolare e cuore valvola costrutti7,8. Esistono diversi protocolli di isolamento, alcuni dei quali coinvolgono l'ordinamento delle cellule delle cellule mononucleari (MNCs) derivate dalle fonti indicate in precedenza con l'aiuto di markers endoteliali ed ematopoietiche, o coltura questi MNCs con crescita endoteliale specializzata medio, o una combinazione di queste tecniche9. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e coltura di EPCs utilizzando specializzati endoteliale supplementato con fattori di crescita, senza l'uso di immunosorting, seguita dalla caratterizzazione di cellule isolate mediante Western blotting e immunostaining.
Introduction
Parecchi ricercatori hanno studiato le caratteristiche e le potenzialità di umano EPCs5,10,11,12,13. EPC possono essere descritto come fare circolare le cellule che hanno la capacità di aderire al tessuto endoteliale nei siti di ipossia, ischemia, lesioni o di formazione del tumore e contribuiscono alla formazione di nuove strutture vascolari4,14. Loro coinvolgimento osservato nella neovascolarizzazione, sotto forma di vasculogenesi postnatale, ha condotto ad una comprensione della patofisiologia di queste cellule e il loro uso in applicazioni terapeutiche4,15, 16. il numero di EPCs in un individuo è stato indicato per essere correlati con patologia cardiovascolare9,15,16,17,18,19 ,20. Altri studi hanno anche differenziato EPCs in un fenotipo fibroblasto-come valvola e proposto che queste cellule potrebbero essere utilizzate per l'ingegneria dei tessuti cuore valvole7,21.
Le molecole di superficie determinata cella necessari per isolare EPCs non sono stati chiaramente identificate a causa di discrepanze tra le indagini4. L'adesione delle MNCs per una certa matrice, con l'esposizione a una varietà di condizioni di coltura, è stata eseguita da diversi gruppi1,17,22,23, suggerendo che presunto EPCs può visualizzare le proprietà fenotipiche differenti. Queste proprietà includono la mancanza di abilità phagocytotic, la formazione del tubo in Matrigel e l'assorbimento delle lipoproteine a bassa densità di Dil-acetilato. L'alta clonogenic e potenziale proliferativo sono due proprietà con cui EPCs può essere gerarchizzato5. EPCs possono anche formare in vitro i tubuli quando cocultured con fibroblasti di polmone fetale umano4. Queste cellule sono conosciute per esprimere gli indicatori di superficie delle cellule endoteliali e di condividere alcuni dei marcatori ematopoietici13,24,25. I marcatori espressi positivamente che sono ampiamente accettati per la fenotipizzazione EPCs sono CD31, CD34, fattore di crescita endoteliale vascolare receptor 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (vWF), CD133, c-Kit e vascolare endoteliale caderina (VE-caderina)4 , 18. non sono considerate essere EPCs a causa della loro limitata capacità proliferativa potenziali, di fagocitare batteri e incapacità di formare de novo umano cellule che co-esprimono CD90, CD45, CD14, CD115 o l'actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA) vasi in vivo4,7. Questo articolo descrive un protocollo modificato per l'isolamento di cellule progenitrici endoteliali dal sangue del cordone ombelicale umano senza la necessità di qualsiasi cella ordinamento protocolli. In questo articolo abbiamo usato CD31, CD34 e VEGFR2 come gli indicatori positivi, con α-SMA come indicatore negativo.
In questo articolo, vi proponiamo un metodo di isolamento e coltura delle cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale senza cella ordinamento utilizzando specializzato supplementato crescita endoteliale con fattori di crescita (EGM). Questo EGM contiene fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e fattore di crescita del fibroblasto (FGF), che migliorano la sopravvivenza, la proliferazione e la migrazione di cellule endoteliali26. Include anche l'acido ascorbico, che è responsabile del mantenimento della morfologia di ciottoli delle cellule; 1 fattore di crescita insulino-simile (IGF-1), che fornisce angiogenici e funzione migratori; e l'eparina, che provoca una migliore stabilità a lungo termine dei fattori di crescita nel medio26. Altri fattori di crescita aggiunti al terreno di coltura delle cellule endoteliali comprende il completamento con fattore di crescita epidermico (EGF), che aiuta a stimolare la proliferazione delle cellule e differenziazione e idrocortisone, che sensibilizza le cellule per EGF26 . Indichiamo che l'utilizzo di questo mezzo di crescita specifici rendimenti più alti numeri di EPCs rispetto al medio basale endoteliale (EBM) o per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco).
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Protocol
questa ricerca è stata condotta con l'approvazione dell'Università di Arkansas Institutional Review Board (numero di omologazione 16-04-722). Unità di sangue del cordone ombelicale sono stati raccolti in soluzione di citrato fosfato destrosio (CPD) presso l'Arkansas Cord Blood Bank, e unità che non soddisfano il requisito per l'archiviazione sono stati donati per la ricerca. Unità cordonali erano corriere al laboratorio entro 24 h dalla raccolta a temperatura ambiente.
1. isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale
- preparazione dei reagenti.
- EGM preparare aggiungendo sostanza basale endoteliale (EBM) al 10% siero bovino fetale (FBS) completati con 20 ng/mL del fattore di crescita insulino-simile (IGF), 1 µ g/mL di acido ascorbico, fattore di crescita ricombinante umano epidermico 5 ng/mL (rhEGF), 22,5 µ g/mL eparina e 0,5 ng/mL endoteliale fattore di crescita vascolare (VEGF), insieme a 10 ng/mL di fattore di crescita del fibroblasto umano ricombinante B (rhFGF-B), idrocortisone di 0,2 µ g/mL e 2% penicillina-streptomicina-glutammina. Sterilizzare il terreno di coltura utilizzando un filtro vuoto a membrana in polietersulfone (PES) 0,2 µm. Ratto
- preparare io coda soluzione di collagene ad una concentrazione di 50 µ g/mL utilizzando 0,02 N di acido acetico. Sterilizzare questa soluzione utilizzando un filtro per siringa 0,2 µm.
- Pre-cappotto 6-pozzetti con 2 mL di preparato ratto ho coda soluzione di collagene per ciascun pozzetto. Metterli in un incubatore mantenuto a 5% CO 2 e 37 ° C per almeno 1 h prima della semina.
- Diluire circa 25 mL di sangue del cordone ombelicale con Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) ad una concentrazione di 1:1.
- Preparare radio-immuno precipitazione (RIPA) tampone utilizzando 150 mM di cloruro di sodio, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, β-glicerofosfato di 1 mM, 0,1% SDS e 50 mM Tris (pH 8.0) per il test.
- Isolamento di cellule progenitrici endoteliali.
- Caldo tutti preparati i reagenti in un bagno d'acqua mantenuto a 37 ° C prima dell'isolamento.
- Aggiungere 20 mL di reagente medio gradiente di densità in una provetta da centrifuga 50ml.
- Attentamente strato 20 mL di sangue cordonale diluito la provetta da centrifuga contenente medio gradiente di densità senza rompere questo strato puntando la pipetta verso le pareti laterali del tubo.
- Separare i componenti del sangue basata sulla loro densità ( Figura 1) mediante centrifugazione a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente, con i freni del rotore della centrifuga fuori. Non disturbare i diversi strati.
- Rimuovere lo strato di plasma pipettando attentamente fuori dal tubo senza disturbare altri cell strati fino a quando la punta della pipetta è in grado di raggiungere il MNC strato (Vedi Figura 1). Scartare il plasma rimosso.
Nota: Durante l'utilizzo di puntali per rimuovere il plasma, lasciare un piccolo strato di plasma sopra lo strato MNC ( Figura 1) per ridurre i disturbi. - Raccogliere il buffy-coat contenente i PTM usando una siringa graduata per un ago calibro 18 e trasferirlo in una provetta da centrifuga freschi.
- Aggiungere un volume uguale di EBM alla centrifuga MNCs. raccolti questi tubi a 500 x g per 10 min a 4 ° C. scartare il sopranatante.
Nota: Il pellet cellulare apparirà rosso a causa della presenza di globuli rossi/eritrociti. - Aggiungere 5 mL di soluzione di cloruro di ammonio per lisare le cellule di anima rosse. Incubare la provetta in ghiaccio per 5-10 minuti, con agitazione occasionale.
Nota: Prestare attenzione durante questo passaggio di non superare la durata di tempo, come può essere dannoso per i PTM. - Centrifugare le provette a 500 x g per 10 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Se persistono gli eritrociti, ripetere i passaggi 1.2.8 e 1.2.9 Nessun colore rosso è osservato nel pellet.
- Risospendere il pellet in EGM preparati e utilizzare l'emocitometro per contare i PTM.
- Aspirato il ratto di coda ho piastra a 6 pozzetti rivestite con collagene (dal punto 1.1.3) e lavare i pozzetti tre volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).
- Del seme il pellet MNC risospeso in EGM alla piastra di collagene ad una concentrazione di 1 x 10 7 MNCs in ciascun pozzetto. Posizionarlo a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
- Dopo 24 h, il mezzo di aspirare e lavare i pozzetti una volta con EGM. Aggiungere 3 mL di terreno EGM in ciascun pozzetto e posizionarlo torna a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
- Riempire la piastra con mezzo EGM fresco ogni giorno per 7 giorni. Dopo 7 giorni, cambiare il mezzo EGM alterni.
- Usando un microscopio a campo chiaro, prendere le immagini della piastra 6 pozzetti ogni giorno per monitorare la progressione delle colonie delle cellule endoteliali. Contrassegnare la piastra dove le colonie derivano per tenere traccia della loro crescita.
Nota: Prende solitamente fra 5 e 9 giorni per le colonie a comparire nella cultura.
- Espansione di cellule progenitrici endoteliali.
- Cappotto il matraccio di cultura T-25 con ratto coda ho collagene (50 µ g/mL) e posizionarlo a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per almeno 60 min. aspirare e lavare il matraccio di cultura cellulare T-25 tre volte con PBS 1x prima della semina delle cellule.
- Tripsinizzano le colonie delle cellule endoteliali quando raggiungono circa 3 millimetri nel formato utilizzando 150 µ l di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% in ciascun pozzetto. Inserire nuovamente la piastra a 6 pozzetti i 37 ° C, 5% CO 2 incubatrice per un minimo di 2-3
- Toccare delicatamente la piastra 6 pozzetti per sloggiare le cellule allegate. Immediatamente aggiungere 2 mL di EGM e ripristinare le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e calcolare la densità di semina iniziale. Tubi di
- spin la centrifuga 15 mL a 400 x g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in EGM e seminare la bottiglia di T-25 con ~ 500.000 cellule. Contrassegnare questa boccetta come passaggio 1 e posizionare il pallone T-25 torna a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
Nota: Le cellule possono essere placcate in EBM e DMEM per confrontare la crescita con EGM. - Per ulteriori passaggi, quando il pallone raggiunge 90% confluenza, attenersi alla seguente procedura 1.3.1 - 1.3.5 e reinizializzare le cellule 10 4 cellule/cm 2 su T-75 o T-175 matracci di cultura cellulare. Procedere alla caratterizzazione di cellule isolate (passaggi 2 e 3).
2. Caratterizzazione di isolato cellule mediante Western Blotting
- Aggiungi 50-100 µ l di lysis buffer ad ogni passaggio quando seguendo la procedura di espansione per caratterizzare le cellule isolate. Raccogliere le proteine da circa 500.000 o più cellule.
- Pipettare vigorosamente su e giù a rottura delle cellule e rilasciare le proteine. Raccogliere e il buffer di trasferimento ad un tubo del microcentrifuge.
- Spin il tubo del microcentrifuge a 500 x g e attentamente trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Etichetta e memorizzare le provette a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Quantificare la quantità di proteine in ogni provetta utilizzando entrambi Bradford ' s o BCA dosaggio 27 , 28 , 29.
- Eseguire Western blotting usando le procedure standard 27 , 28 , 29. Analizzare 5 µ g di proteina totale per l'espressione di CD31, CD34, VEGFR2 e α-SMA. Utilizzare α-tubulina per normalizzare i dati.
3. Immunofluorescenza indiretta
- sottoporre ad ultrasuoni-18mm vetrini coprioggetti in etanolo al 50% e asciugarli. Lasciare i coprioggetti puliti in un piatto di 12-pozzetti pernottamento nella cappa di sicurezza biologica con un UV luce su per sterilizzarli.
- Cappotto lamelle con 50 & n. 181; g/mL di ratto coda ho collagene e trasferire la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per almeno 60 min.
- Aspirare il collagene e aggiungere 1 mL di PBS 1x alla piastra 12-pozzetti per lavare i vetrini coprioggetti. Aspirare il PBS 1X e ripetere due volte.
- Seme 250.000 coltivate EPCs in ciascun pozzetto e il posto nuovamente a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per almeno 3 giorni prima di effettuare immunostaining.
- Lavare la piastra 3 volte con PBS 1X. Aggiungere 1 mL di metanolo ghiacciato in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti per fissare le cellule.
- Eseguire immunostaining usando un protocollo standard 27 , 28 , 29. Utilizzare gli anticorpi alle loro appropriate diluizioni (ad es., CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1: 100) e VEGFR2 (01:50)).
- Prendere le immagini di lamelle immunostained utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
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Representative Results
Isolamento ed espansione di cellule progenitrici endoteliali:
Uno schema (Figura 1) viene fornito raffigurante il protocollo generale. I livelli di componenti del sangue diverso sono stati osservati dopo centrifugazione in gradiente di densità del sangue del cordone ombelicale con il mezzo di gradienti di densità. Al momento di semina MNCs sulle piastre collagene-trattati, la conseguenza delle colonie in primo luogo è stata osservata fra giorni 5 e 7 (Figura 2A). Queste colonie hanno continuato a crescere e avevano una morfologia delle cellule fusiformi (Figura 2A-2D) nelle prime fasi, che più successivamente ha diventato una sanpietrino-come la morfologia (Figura 2E-2F). Figura 3 A Mostra il numero totale di cellule rispetto al tempo nella cultura, e ogni punto di dati rappresenta il numero cumulativo di cellule raccolte ad ogni passaggio. Figura 3 B raffigura il tempo medio impiegato per la prima colonia a sorgere nella piastra di 6 pozzetti di collagene-trattati dopo la semina le multinazionali.
Caratterizzazione mediante Western Blotting:
Figura 4 A Mostra il rappresentante risultati del Western blot della membrana che è stata testata contro i vari anticorpi. I nostri risultati indicano che le cellule erano positive per CD31 e CD34. L'espressione di CD31 (Figura 4B) e CD34 (Figura 4C) è sembrato fare diminuire sopra passaggi successivi, mentre VEGFR2 (Figura 4D) è stato espresso ugualmente in passaggi successivi, con il primo passaggio avendo più alta espressione. Inoltre abbiamo osservato che le EPCs non ha espresso il marcatore delle cellule mesenchimali α-SMA (Figura 4E). Cellule endoteliali (HUVEC) della vena ombelicale umana e lisati di cellule interstiziali valvolari (VIC) sono stati utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente. HUVECs sono noti per esprimere CD31, CD34 e VEGFR2, mentre VICs esprimono α-SMA.
Figura 1 : Schematico di isolamento EPC. Inizio l'isolamento di cavo di diluizione del sangue con HBSS e stratificazione di attentamente sopra il mezzo di gradienti di densità, come mostrato. Centrifugazione in gradiente di densità del sangue a strati è effettuata per ottenere strati distinti del sangue, che è composto di MNCs (buffy-coat), densità gradiente medio, granulociti e globuli rossi. L'immagine di sottoinsieme fornito Mostra questi diversi strati. MNC sono raccolti e reinizializzato su una piastra di coltura delle cellule di collagene-trattati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Progressione della Colonia Cell. (A-E) Immagini rappresentative del campo luminoso della progressione di Colonia EPC nel corso del tempo. Si noti che la Colonia ha cellule fusiformi nelle fasi iniziali, adottando la morfologia di ciottoli. (E) immagine rappresentativa di EPC coltivate in una boccetta di T-75 al passaggio 3. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Curve di crescita di EPCs. (A) il grafico rappresenta il numero di cellule che crescono in un periodo di tempo, e ciascuno del punto dati denota la cella numero raccolta durante ogni passaggio (P0 - P10) (n = 4). (B) tempo impiegato per la prima colonia EPC a comparire nella piastra 6 pozzetti (n = 4). Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). Nessuna significatività statistica è stata calcolata usando il One-way ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Western Blotting. (A) membrana occidentale della macchia macchiata con vari anticorpi. HUVEC lisato e VIC lisato sono stati utilizzati come controlli positivi. (B) media intensità delle bande di CD31 normalizzato con α-tubulina. (C) media intensità delle bande di CD34 normalizzato con α-tubulina. (D) media intensità delle bande di VEGFR2 normalizzato con α-tubulina. Intensità media (E) di α-SMA bande normalizzato con α-tubulina (n = 3-6). Le barre di errore indicano SEM. Nessuna significatività statistica è stata calcolata usando il One-way ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immunostaining. Immagini rappresentative delle EPCs coltivate in EGM per 7 giorni e immunostained presso vari passaggi per CD31, CD34, VEGFR2 e α-SMA. Scala bar - 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare figura 1: Il grafico mostra il numero di celle per unità di superficie per un periodo di 7 giorni quando coltivate in DMEM, EBM ed EGM. EGM hanno mostrato una maggiore crescita cellulare rispetto ai media (EBM e DMEM). I dati hanno mostrato una significatività statistica, con p < 0,01, usando il One-way ANOVA (n = 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
/ > Supplementare nella figura 2: immagini rappresentative di EPCs coltivate in EBM per 7 giorni e immunostained per CD31, CD34, VEGFR2 e α-SMA. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare nella figura 3: Immagini rappresentative delle EPCs coltivate in DMEM per 7 giorni e immunostained per CD31, CD34, VEGFR2 e α-SMA. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come accennato in precedenza, aderente EPCs possiedono una morfologia di ciottoli. Nostro MNCs isolato progredito da una colonia di cellule fusiformi (Figura 2A-2D) nelle prime fasi di una colonia di ciottoli (Figura 2E-2F) per un periodo di dieci giorni nella cultura. EPC sono state etichettate in modo diverso dai gruppi di ricerca differenti, vale a dire come ritardati di cellule progenitrici endoteliali10, colonie endoteliali cellule5, o di cellule progenitrici endoteliali12. Dovrebbe essere notato che queste cellule sono funzionalmente identici ed esprimono simili indicatori di superficie delle cellule. Il numero di cellule osservati durante il periodo di coltura (Figura 3) è aumentato a quasi 108 celle, analoghe a precedenti pubblicazioni e tipiche dell'elevato potenziale proliferativo di EPCs3,5. Infatti, è stato trovato che EPCs ottenute da sangue del cordone ombelicale umano hanno mostrato un alto proliferativa potenziali e ha dimostrato parecchi doublings della popolazione prima di subire la senescenza rispetto a EPCs isolate da sangue periferico umano adulto5 , 10.
I nostri risultati macchiantesi occidentali (Figura 4A) ha mostrato la presenza di CD31, CD34 e VEGFR2 sui lisati cellulari ottenuti da EPCs confrontato al controllo positivo, HUVEC. HUVEC esprimono CD31, CD34 e VEGFR2 e attivato VIC espresso α-sSMA. Simili a precedenti rapporti10,18, l'espressione di CD31 diminuita con passaggi più alti. Il modello di espressione anche era simile nel caso di CD34 e VEGFR2, dove entrambi i marcatori sono stati espressi fortemente nel primo passaggio e in quantità relativamente bassa ma uguale in passaggi successivi. Questi dati mostrano una tendenza che è in accordo con i risultati precedenti gruppi in cui protocolli basati su immunosorting sono stati usati per l'isolamento del cavo emoderivati EPCs12. In genere, EPCs non esprimono marcatori mesenchymal e, per verificare che le cellule isolate non erano mesenchymal in natura, abbiamo immunolabeled nostre membrane di Western blot con α-SMA. I nostri risultati indicano chiaramente che non c'era nessuna espressione di α-SMA nelle EPCs colto quando confrontato con controllo positivo lisati cellulari raccolti da VICs, che esibiscono la forte espressione di α-SMA anticorpo.
Per dimostrare che EGM permette per proliferazione aumentata delle cellule rispetto ad altri mezzi di coltura utilizzati per EPCs, abbiamo coltivato le cellule in tre diversi tipi di media: DMEM, EBM ed EGM (cioè, EBM completati con fattori di crescita, come descritto in precedenza). Tutti sono stati completati con 10% FBS. Abbiamo seminato le cellule dei diversi passaggi in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti. Supplementare la figura 1 Mostra il numero di celle per unità di superficie in ogni pozzetto nel tempo nella cultura nelle formulazioni differenti media. Notiamo che le EPCs colto in EGM ha mostrato un costante aumento nel numero delle cellule e per le celle in EBM, c'era un tasso più lento di aumento nel numero delle cellule durante i primi tre giorni, che successivamente stabilizzato. Ciò suggerisce che le EPCs potrebbe ancora sopravvivere in EBM, ma l'assenza di fattori di crescita hanno ostacolato la proliferazione. Notiamo anche che EPCs coltivate in declino DMEM in numero, suggerendo che questa particolare formulazione media non è adatta per la loro sopravvivenza o la proliferazione. I nostri dati di immunostaining mostrano che le EPCs colto in EGM (Figura 5) espresso CD31 ulteriori rispetto a EPCs coltivate in EBM (Supplemental figura 2) e DMEM (Supplemental figura 3). Confrontando la Figura 5 con supplementare nella figura 2 e supplementare nella figura 3, può essere visto che le cellule non sono state contaminate con altri tipi di cellule. Inoltre, quando si confrontano le immunostained EPCs (Figura 5), possiamo qualitativamente affermare che l'espressione di CD31 e CD34 diminuita sopra passaggi superiori, sostenendo i nostri dati di Western blot (Figura 4).
Per ribadire, l'obiettivo primario della nostra proposta di protocollo è di dimostrare che uno può isolare cellule progenitrici endoteliali mediante coltura sangue MNCs in terreni selettivi specializzati. Questo è quello di mostrare che EPCs possono essere isolate senza sofisticate apparecchiature e procedure, a differenza di altri metodi che implicano l'uso di citometria a flusso - subito dopo il MNC isolamento1,3,20 , 30 o dopo le colonie sono cresciuti in un monostrato - seguita da ricromatura4,10,12,13,23. Le colonie EPC di solito compaiono tra i giorni 5 e 9. Il nostro metodo è così un metodo più veloce e più conveniente per l'isolazione EPCs. Il limite principale di questa tecnica è che l'espressione di CD31 e CD34 diminuisce con passaggi successivi, che potrebbero suggerire che le cellule stanno perdendo il loro fenotipo di cellule progenitrici. Pertanto, è consigliabile che si dovrebbero utilizzare cellule ottenute dal passaggio 5 o inferiore per condurre esperimenti se utilizza questo protocollo.
Dopo la centrifugazione di densità devono essere prese precauzioni per non disturbare i diversi strati quando tenendo la cappa con i tubi centrifugati e anche quando si rimuove il plasma. Un altro passo fondamentale riguarda la lisi degli eritrociti, dove un tempo di incubazione più lungo potrebbe potenzialmente danneggiare il MNC. Si consiglia quindi di non ripetere questo passaggio più di due volte. Infatti, poiché l'aspirazione media avviene 24 ore dopo il placcaggio, tracce di eritrociti vengono rimossi, così come sono non aderente. Substrati alternativi, come fibronectina o gelatina, mentre non testati da noi, possono essere utilizzati secondo i protocolli specifici per la creazione di rivestimenti di cultura cellulare. Impiegando una modifica minore nelle fasi iniziali, i ricercatori possono isolare antiaderente EPCs30.
In conclusione, abbiamo segnalato un metodo per isolare EPCs dal sangue del cordone ombelicale. È importante notare che le EPCs non esprimono marcatori come α-SMA, suggerendo che essi non sono cellule mesenchimali. Infatti, α-SMA serve come indicatore importante quando si cerca di studiare la transizione endoteliali mesenchimali (endo-MT) di EPCs. Endo-MT è un processo di transdifferenziazione cellulare durante il quale le cellule endoteliali sono noti per perdere loro marcatori specifici e di trasformare un fenotipo delle cellule mesenchimali-come. È stato dimostrato che EPCs possono subire questa transizione in presenza di trasformazione di fattore di crescita-β7 e possono rilasciare proteine di membrana extracellulare il loro tessutale impalcature8. Tutte queste osservazioni indicano la promessa di EPCs per uso come fonte di cellule autologhe per creare una valvola cardiaca o altri costrutti tessutale cardiovascolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 e dall'Università di Honors di Università dell'Arkansas. Vorremmo anche riconoscere l'Arkansas Cord Blood Bank per averci fornito unità cordonali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
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