適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング
Summary
線虫男性の効率的なカルシウム イメージング用適応「嗅覚チップ」をご紹介します。グリセロールとフェロモンに男性露出の研究も示しています。
Abstract
カルシウム指標の使用に神経回路のダイナミクスとその制御の私達の理解が高まります。マップを完全に神経系と透明な解剖学、線虫線虫は、カルシウムの指標を使用してリアルタイムのダイナミクスを理解するための理想的なモデルを示します。マイクロ流体技術や実験のデザインと組み合わせて、これらの指標を用いたカルシウム イメージング研究は自由移動と閉じ込められた動物で実行されます。しかし、ヴォックストロットらで説明されている嗅覚のチップなどの捕集装置を利用した前の調査があるより少なく共通の男性、両方の形態学的および構造的より一般的な両性具有者で使用するために設計されたデバイス異種。適応嗅覚チップを設計、若い大人動物を用いた男性神経イメージングにおける効率性の向上のために作製します。ターンは、動物を回転し、2 D イメージングで二国間ペア内で個々 のニューロンの分離を可能にするポートをロード ワームに組み込まれました。ワームは、以前両性研究に従ってマイクロ流体デバイス内での匂いの流れを制御する公開されます。カルシウム濃度は ImageJ のオープン ソース ソフトウェアを使用して分析しています。男性ベースのc. の elegansの量の増加対応記載手順必要がありますカルシウム イメージング研究、セックスに固有の神経信号のメカニズムの私達の理解を深めます。
Introduction
マイクロ流体デバイスなどを提供正確に制御された環境へのアクセス増加前記動物、線虫C. elegans、実験操作1をすることができます。これらの研究は、行動アッセイ、カルシウム イメージング、または実験結果1,2,3,4より正確な測定の結果、特定の表現型にも上映 5,6。マイクロは、試薬の最小限の量を活用しながら、詳細な実験を実行できる小規模液体条件を提供します。新しいマイクロ流体デバイス設計の一定の生産、アリーナ自然正弦波運動線虫の行動と神経イメージング研究における神経イメージング デバイスをトラップすることができるから、それぞれの使用方法が異なります・高スループットによる遺伝的形質解析画面4,5,6,7は、デバイスへの嗅覚研究。次のマスター型の製作、マイクロ流体デバイスが構築する高価な-マスターの再利用性を与えられる- で使いやすい、高スループット研究を介して迅速なデータを生成することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) などの高分子材料を用いたデバイスの作製時間以内の新しいデバイスを作成できます。
カルシウム イメージング研究は、リアルタイム8,9,10,11にこれらの細胞のダイナミクスを測定するのに遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) ターゲット細胞で発現を使用します。線虫 c. エレガンスの透過的な性質は、生きている動物のこれらの蛋白質の蛍光レベルのレコーディングのためことができます。GECIs が伝統的に、緑色蛍光タンパク質 (GFP) に依存-用いたセンサー GFP カルモジュリン M13 ペプチド (GCaMP) より最近の研究より良い信号対雑音比と赤いシフト励起プロファイルを許可するこれらのセンサーを適応しています。GCaMP6s や GCaMP6f などのセンサーを含む、これらの仕様が付いている蛋白質を変化の次の GCaMP3 の開発 (低速と蛍光をオフ-料金をそれぞれ高速)、RFP カルモジュリン M13 ペプチド (RCaMP)、および赤いシフトがあります。活性化のプロフィール。線虫の細胞特異的遺伝子のプロモータ配列でこれら GECIs の組み合わせ興味、特にニューロン12,13,14,15のセルを対象します。,16。
マイクロ流体研究にc. の elegansの使いやすさを感じ取ることが、ほぼすべての研究が両性具有に焦点を当てた。男性のみは 0.01 0.02 にもかかわらず野生型人口の % は、非常に貴重な所見はその特性から生じる。両性系の物理のコネクトームは何十年も17に完全にマップされている、男性のコネクトームの動物18の頭部領域を中心に、不完全なままです。男性のカルシウム イメージングの使用は男性の神経系と 2 つの男女間の差異の理解を生成するのに役立ちます。線虫 c. エレガンスの成人男性のサイズを小さく大きいの両性具有の設計された伝統的な嗅覚デバイスの読み込みポートで効果的かつ信頼性の高いトラップを防ぎます。これに対処するためヴォックストロット嗅覚チップ19の修正版は開発された狭い読み込みポート、チャネル背の低いと、ワームのロードのポート (動物を回転)、二国間左/右の可視化が可能になります神経のペア。このデザインができます: 若い成人男性の (1) の有効なトラップ、二国間の対ニューロンの両方のメンバーと男性のニューロンの神経活動の (3) の精密な画像処理の可視化のための動物の (2) のより信頼性の高い向き。
ますます、研究は、線虫の男性が様々 な ascarosides (ascr) または線虫フェロモン20,21,22,23 に両性具有とは異なる応答を示す ,24。したがって、ダイナミクスと男性のコネクトーム内表現の理解を深めると、さらにもっと適切ななっています。男性c. の elegans含む両性25,26, に存在しない 87 セックス特定ニューロンとしてのコネクトームを変更-未定方法。これらのユニークなダイナミクスをイメージすることは、私たちはセックス固有の応答と脳内表現を理解しです。
このプロトコルは男性のc. の elegansの神経イメージングのため男性に適応した嗅覚チップの使用を説明しますその。灰は 1 M グリセリン男性、以前の雌雄同体に確実に応答する侵害受容ニューロンの研究27。Ascarosides への暴露は、テストされる動物の大きい数を必要とする動物から動物へ変数を応答を引き出すことがあります。男性固有の CEM ニューロンの応答以前示されている、電気生理学とイメージング研究、カルシウム ascaroside #323に必ず対応します。
Protocol
Representative Results
Discussion
男性に適応した嗅覚チップは、男性c. の elegansの効率的なトラップの方向のより詳細に制御でき狭いロードポートにターンを組み込みます。Z スタックを必要とせず、神経の二国間ペアの左と右の両方のメンバーの可視化が可能になります。この曲線は、アッシュ (2 D 図-e)29,30などの蛍光マーカーで 1 つだけ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
男性; に対応した初期設計ファイルをご提供するマヌエル · ジマーを感謝したいと思います合成と ascr; #3 の供給のためのフランク ・ シュレーダー洞察力とイメージングと分析支援のためロス Lagoyこの原稿のレビューに貢献したクリストファー ・ シュートと一緒に、マスターの作製とローラ Aurilio.この作業に資金は国立衛生研究所の助成金 1R01DC016058-01 (バッハ)、全米科学財団助成金あわせて 1605679 (D.R.A.)、バローズ Wellcome キャリア賞科学的なインターフェイス (D.R.A.) の下で提供されました。
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
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