Summary
Her præsenterer vi protokoller for vaskemiddel-fri homogenisering af kulturperler pattedyrceller baseret på kvælstof kavitation og efterfølgende separation af cytosole og membran-bundet proteiner af ultracentrifugering. Denne metode er ideel til overvågning, partitionering af perifere Membranproteiner mellem opløselige og membran fraktioner.
Abstract
Dyrkede celler er nyttigt for at studere subcellulært fordelingen af proteiner, herunder perifere Membranproteiner. Genetisk kodet fluorescently har tagged proteiner revolutioneret studiet af subcellulært protein fordeling. Det er imidlertid vanskeligt at kvantificere distribution med fluorescerende mikroskopi, især når proteiner er delvis cytosole. Derudover er det ofte vigtigt at studere endogene proteiner. Biokemiske undersøgelser såsom immunoblots fortsat guldstandarden for kvantificering af protein fordeling efter subcellulært fraktionering. Selv om der er kommercielle kits, der har til formål at isolere cytosole eller bestemte membran fraktioner, er de fleste af disse kits baseret på udtræk med vaske-og rengøringsmidler, som kan være uegnede til at studere perifere Membranproteiner, der nemt er ekstraheret fra membraner. Her præsenterer vi et vaskemiddel-fri protokol for cellulære homogenisering af kvælstof kavitation og efterfølgende separation af cytosole og membran-bundet proteiner af ultracentrifugering. Vi bekræfter den adskillelse af subcellulært organeller i opløselige og pellet fraktioner på tværs af forskellige celletyper, og sammenligne protein udtræk blandt flere fælles ikke-vaskemiddel-baseret mekaniske homogenisering metoder. Blandt flere fordele af kvælstof er kavitation den overlegne effektivitet af cellulære forstyrrelser med minimal fysiske og kemiske skader på sarte organeller. Kombineret med ultracentrifugering, kvælstof kavitation er en fremragende metode til at undersøge skift af perifere Membranproteiner mellem cytosole og membran fraktioner.
Introduction
Cellulære proteiner kan opdeles i to klasser: dem, der er forbundet med membraner og dem, ikke der. Ikke-tilknyttede Membranproteiner findes i cytosol, nukleoplasmaet og lumina i organeller såsom det endoplasmatiske reticulum (ER). Der er to klasser af membran-associerede proteiner, integrerende og perifere. Integreret Membranproteiner er også kendt som transmembrane proteiner, fordi et eller flere segmenter af polypeptid kæde spænder over membranen, typisk som en α-helix sammensat af hydrofobe aminosyrer. Transmembrane proteiner indsættes co-translationally i membraner i løbet af deres biosyntese og forbliver så konfigureret, indtil de er kataboliseres. Perifere Membranproteiner er sekundært drevet til membraner, normalt som følge af posttranslationel modifikation med hydrofobe molekyler såsom lipider. I modsætning til integreret Membranproteiner, Sammenslutningen af perifere Membranproteiner med cellemembraner er reversibel og kan reguleres. Mange perifere membran proteiner funktion signaling veje og regulerede association med membraner er en mekanisme til aktivering eller hæmme en vej. Et eksempel på en signalfunktion molekyle, der er en ydre membran protein er den lille GTPase, RAS. Efter en række posttranslationelle modifikationer, der omfatter ændring med en farnesyl lipid, indsætter den modificerede C-terminus af en ældre RAS protein i cytoplasmatisk indlægssedlen af cellulære membran. Specifikt er plasma membran, hvor RAS engagerer sin downstream effektor RAF1. For at forhindre konstitutiv aktivering af mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) pathway, er flere niveauer af kontrol af RAS på plads. Udover rendering RAS inaktive ved hydrolyserer GTP i BNP, kan aktive RAS også blive frigivet fra plasma membran af ændringer eller interaktioner med solubilizing faktorer for at hæmme signalering. Selvom fluorescerende live imaging giver cellen biologer mulighed for at observere den subcellulært lokalisering af fluorescerende proteiner-mærkede ydre membran proteiner1, forbliver der et kritisk behov for at evaluere membran sammenslutning af endogene proteiner semi-kvantitativt med enkle biokemiske metoder.
Den passende biokemiske vurdering af protein opdeling mellem membran og opløselige fraktioner er kritisk afhængige af to faktorer: cellulære homogenisering og effektiv adskillelse af membranen og opløselige fraktioner. Selv om nogle protokoller, herunder de mest udbredte kommercialiseret kits, afhænger af vaskemiddel-baseret celle homogenisering, kan disse metoder obfuscate analyse ved at udtrække Membranproteiner i opløselige fase2. Derfor, ikke-rengøringsmiddel baseret, mekaniske metoder til celle afbrydelse give renere resultater. Der er flere metoder til mekanisk afbrydelse af celler dyrkes i kultur eller høstet fra blod eller organer. Disse omfatter Dounce homogenisering, fin nål forstyrrelser, kugleleje homogenisering, ultralydbehandling og kvælstof kavitation. Her evaluerer vi kvælstof kavitation og sammenligne det med andre metoder. Kvælstof kavitation er afhængig af kvælstof, der er opløst i cytoplasma af celler under højt tryk. Efter ækvilibrering, er cellesuspension brat udsat for atmosfærisk tryk således at kvælstof bobler er dannet i cytoplasma, at rive åbne celle som følge af deres luftudvikling. Hvis trykket er tilstrækkelig høj, kvælstof luftudvikling kan forstyrre kerne3 og membran bundet organeller som lysosomer4. Hvis trykket holdes lav nok, kan dekompression vil forstyrre plasma membran og ER men ikke andre organeller, dermed breder både cytosol og intakt cytoplasmatisk organeller ind i den homogenatet, der er udpeget cavitate5. Af denne grund er kvælstof kavitation den foretrukne metode til at isolere organeller som lysosomer og mitokondrier.
Men det er også en fremragende måde at forberede en homogenatet, der let kan opdeles i membranen og opløselige fraktioner. Trykbeholderen (herefter kaldet "bombe") anvendes under kavitation består af en tyk rustfrit stål beklædning, der kan modstår højt tryk, med et indløb til levering af nitrogen gas fra en tank og en udgangsporten med en justerbar decharge ventil.
Kvælstof kavitation har været brugt i celle homogenisering siden 1960s6. I 1961, Hunter og Commerfold7 etableret kvælstof kavitation som en farbar vej for pattedyrvæv forstyrrelser. Siden da, forskere har tilpasset teknik til forskellige celler og væv med succes, og kvælstof kavitation er blevet en fast bestanddel i flere programmer, herunder membran forberedelse8,9, kerner og organelle forberedelse10,11, og labile biokemiske udvinding. I øjeblikket anvender celle biologer oftere andre metoder til celle homogenisering, fordi fordelene ved kvælstof homogenisering ikke har været bredt annonceret, kvælstof bomber er dyre, og der er en misforståelse, at et relativt stort antal celler er kræves. Protokoller for kvælstof kavitation at opnå celle-fri homogeniseret med intakt kerner er ikke blevet offentliggjort, og i mest publicerede evalueringer mængder af 20 mL cellesuspension blev brugt. For at tilpasse denne klassiske teknik passer til aktuelle behov for at arbejde med små prøver, præsenterer vi en modificeret protokol af kvælstof kavitation specialdesignet til dyrkede celler. Efter kvælstof kavitation, homogenatet er opdelt i opløselig (S) og membran (P) fraktioner af differential centrifugering, først med en lav hastighed spin til fjern kerner og ubrudt celler, og derefter med en højhastigheds spin (> 100.000 x g) til at adskille membraner fra den vandopløselige fraktion. Vi analysere effektiviteten af separation med immunoblots og sammenligne kvælstof kavitation med andre mekaniske forstyrrelser teknikker. Vi undersøger også den osmotiske effekt af homogenisering buffer under kvælstof kavitation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. buffer og udstyr præparater
- Chill 45 mL celle forstyrrelser bomber, 15 mL rør og ultracentrifugering rør ved 4 ° C.
- Forbered og chill af homogenisering buffer pr. 2 x 10 7 celler på 4 ° C. Tilføj en protease hæmmer tablet lige før brug 25 mL.
Bemærk: Homogenisering buffere typisk indeholde KCl snarere end NaCl for bedre at afspejle intracellulære salt sammensætning. Homogenisering buffer, der bruges i denne protokol består af 10 mM HEPES ved pH 7,4, 10 mM KCl og 1,5 mM MgCl 2 (i det følgende benævnt hypotonic homogenisering buffer). De fleste buffere kan tilpasses for kvælstof kavitation (Se diskussion). - Forbered og chill 6 mL af 1 x Phosphate-Buffered saltvand (PBS) buffer pr. sample på 4 ° C. Tilføj protease hæmmer tabletter frisk før brug.
Bemærk: PBS buffer, der bruges i denne protokol består af 10 mM Na 2 HPO 4 pH-værdi på 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 NaCl og 2,7 mM KCl. - Forbered og chill 4 mL oploesning buffer pr. sample på 4 ° C. Tilføj en protease hæmmer tablet umiddelbart før brugen.
Bemærk: Oploesning buffer, der bruges i denne protokol er 1 x Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer, som består af 25 mM Tris på pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natrium deoxycholate og 1% NP-40. Se 4,6 NOTE.
2. Celle høst
- vokse 2 x 10 7 -10 x 10 9 vævskultur celler med den anbefalede Kulturmedier til celletype. Typisk, en 15-cm parabol udbytter 2 x 10 7 HEK-293 celler dyrkes i DMEM på 90% confluency ( figur 1).
- Fjerne vækstmediet af vakuum.
- For vedhængende celler, placere kultur retter på is, vaske cellerne direkte på kultur retter forsigtigt med kølet homogenisering bufferen to gange (10 mL buffer pr. 15 cm parabol pr. vask) og høste cellerne med en stor celle skraber i en passende mængde af homogenisering buffer; Indsamle for suspension celler, vaske celle pellet i kølet homogenisering bufferen to gange (10 mL buffer pr. 50 mL kultur pr. vask) med 500 x g spin ved 4 ° C i 5 min, og resuspenderes vasket celle i en passende mængde af homogenisering buffer på is.
Bemærk: lydstyrken bør baseres på behov for proteinkoncentration i de planlagte forsøg samt minimal/maksimal volumen tilladt i celle forstyrrelser bombe. En generel retningslinje er 2-10 x 10 7 celler/mL, eller omkring 10 bind af cellen pellet. Denne protokol er optimeret til tre 15-cm retter af HEK-293 celler i homogenisering buffer sættes 2 mL.
3. Kvælstof kavitation
- overførsel af cellesuspension til en ren og kølet bombe i isbad på opsigt plade.
Forsigtig: Bombe har højtryk, lav temperatur, nitrogen gas – bære passende personlige beskyttelse . - Placere en mikro magnetiske rør bar inde bomben og slå røre pladen til at opretholde suspensionen homogenitet.
- Tilføje en protease hæmmer tablet til suspension og luk bomben pr. producent ' s instruktion.
- Gradvist presse bombe med en nitrogen gastank pr. producent ' s instruktion till bombe trykmåler læser 300 til 600 psi. Luk alle ventiler og afbryde kvælstof tank.
Bemærk: Det pres der kræves kan variere med celletype. Her vi udført kavitation på 350 til 400 psi for cellerne HEK-293, NIH-3T3 og Jurkat. - Vente 20 min til at tillade nitrogen opløses og nå til ligevægt i cellerne.
- Fjern overskydende vand omkring decharge ventil ved hjælp af en klud håndklæde. Åbn decharge ventil forsigtigt for at opnå en dråbevis frigivelse af homogenatet og indsamle i en pre kølet 15 mL tube.
Bemærk: Nær slutningen af samlingen vil der være en slutspurt af homogenatet og gas vil dukke op med en hvæsende lyd. Sørg for, at gassen ikke årsag tidligere indsamlet cavitate for at skyde ud af røret (dermed brugen af 15 mL rør i stedet for 1,5 mL rør). Når voldsomme begynder, Luk decharge ventil og åbne kvælstof indsugningsventilen brat for at trykket bomben og opnå kavitation af de resterende celler i bomben. Åben bombe til cavitate opsving og grundig rengøring.
NOTE: Den endelige cavitate bør have et mælkeagtigt udseende med skum på toppen. Forsigtigt omrøres med en pipette tip til at tillade skum til at stilne inden centrifugering.
Bemærk: Undersøge cavitate af fasekonstrastmikroskopi at bestemme homogenisering effektivitet. Tilføje en 15 µL dråbe cavitate til overfladen af en mikroskopi dias og dække med en coverslip. Gentag trin 3.4-3.6 kun hvis for mange ubrudt celler er påvist med en 20 X mål.
Bemærk: Hvis homogenisering buffer ikke indeholder EDTA eller EGTA, føje den til de indsamlede cavitate i en endelig koncentration på 1 mM indenfor 5 min efter udskrivelsen.
4. Adskillelse af Cytosolic og membran brøker
- Centrifuge cavitate på 500 x g i 10 min. ved 4 ° C til at fjerne ubrudt celler og cellekerner.
Bemærk: Gentag trinnet centrifugering, indtil ingen synlige pellet er produceret og indsamle den Post nukleare supernatanten (PNS) samtidig undgå skummet flyder ovenpå. Re der centrifugeres skum for yderligere indsamle og kombinere PNS, hvis nødvendigt ( figur 1). - Behandle PNS som ønskede at få brøkdele af interesse. Med henblik på at adskille cytosole og membran fraktioner, overføre PNS til et ultracentrifuge rør og udføre ultracentrifugering som ønsket. Denne protokol er optimeret til en < 3,5 mL prøve i en polycarbonat ultracentrifuge tube og til ultracentrifugering ved 350.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Indsamle supernatanten (S brøkdel) ved hjælp af 1 mL pipette.
- Skylles omhyggeligt pellet med 3 mL koldt PBS uden at forstyrre det. Fjerne PBS ved vakuum.
Bemærk: Hvis forurening af membran brøkdel af cytosole proteiner er en større bekymring end tabet af prøven, resuspenderes i 3 mL koldt PBS og re-ultracentrifuge som i trin 4.2. Fjerne PBS ved vakuum. - Resuspenderes fuldt ud i en passende mængde af vaskemiddel-holdige oploesning buffer af valg. For at opnå celle ækvivalens, bruge den samme mængde af oploesning buffer som det cytosole brøk.
Bemærk: Vi foreslår at bruge 1 x RIPA buffer som oploesning buffer for effektive membran protein udvinding. Hvis ingen downstream analyse er nødvendig for membran brøkdel, bruge 1 x laemmli prøvebuffer for maksimal membran protein udvinding.
Bemærk: Foreslår vi løs og overføre pellet i oploesning buffer til en ren rør på en tube rotator ved 4 ° C for maksimal membran protein udvinding.
Bemærk: Hvis pelleten er for klæbrig (for mange lipider) skal fjernes effektivt fra the ultracentrifuge tube i oploesning buffer, vi foreslår snap frysning pellet i flydende nitrogen og hurtigt løs toerstoffet fra ultracentrifuge rør med en mini metal spatel før pellet smelter.
Bemærk: Alternativt membran pellets kan kun genopslemmes og ikke oploeses i en ikke-rengøringsmiddel-holdige buffer til at producere en P brøkdel af membran vesikel suspension, i hvilket tilfælde centrifugeringen trin i 4.6 ikke er påkrævet. Sådanne P fraktioner er nyttige, når undersøger funktioner såsom enzym aktiviteter, der er afhængige af membran association. - Centrifugeres fuldt solubilized pellet suspension fra trin 4.5 på 20.000 x g i en bordplade centrifugeres i 10 min. ved 4 ° C. indsamle supernatanten ved hjælp af 1 mL pipette (P-fraktion) og kassér pellet (uopløselig lipider).
- Udføre ønskede assays såsom western blotting med de cytosole og/eller membran fraktioner, eller gemme dem på-80 ° C til fremtidig brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser en opdeling af cellulære proteiner fra PNS i enten opløselige cytosole brøkdel (S) eller membran pellet brøkdel (P). Vi undersøgt tre repræsentative cellelinjer fra forskellige celletyper: HEK-293 (epitelial), NIH-3T3 (fibroblast) og Jurkat (lymfocytter). Rho guanin Dissociation hæmmer (RhoGDI) og kation-uafhængige mannose-6-fosfat receptor (CIMPR) blev brugt som positive kontroller i cytosole og membran fraktioner, henholdsvis. Vi bekræftede den effektive adskillelse af cytosol og membran efter kvælstof kavitation på ~ 350 psi i hypotonic buffer efterfulgt af ultracentrifugering ved 350.000 x g i 1 h. Den samlede protein inddrives fra S og P-fraktion blev derefter analyseret med markører til Skadestuen, endosomes og lysosomer, mitokondrier, Golgi og andre organeller. Alle transmembrane proteiner er til stede i membran fraktion udelukkende, herunder Na+/K+ ATPase og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) fra plasma membran, calnexin fra ER, lysosomale-associerede membranen protein 1 (LAMP1) fra lysosomer, F0-ATPase fra mitokondrier og Golgin 97 fra trans Golgi netværk. Som forventet, mange perifere Membranproteiner, der er løst forbundet med membranen, er til stede både i de cytosole og membran fraktioner i varierende grad. Bemærkelsesværdige eksempler omfatter tidlige endosome antigen 1 (EEA1), Rab7/9 (slutningen endosomes) og hexokinase 1 (ydre mitokondrier membran). Dette viser nytten af denne teknik i evaluering af membran association styrken af perifere proteiner. Vores laboratorium har benyttet sig af denne kavitation teknik at undersøge membran association status af flere signaling molekyler5,12,13,14. Interessant, fandt vi calregulin næsten udelukkende i den vandopløselige fraktion, tyder på, at en microsomes, genereret fra ER membraner har også været afbrudt under kvælstof kavitation og proteiner i ER lumen er frigivet til den vandopløselige fraktion. Derimod er integriteten af mitokondrier efter kavitation afhængig af celletype. Vi observerede F1-ATPase, en indre mitokondrier perifere protein, delvist i det cytosole brøkdel spænder fra 2% til NIH-3T3 celler til ~ 35% for HEK-293 og Jurkat celler. Dette indikerer, at kvælstof kavitation på 350 psi med hypotonic buffer sikrer ikke mitokondrie integritet. Trods tre cyklusser af 500 x g spins til at generere PNS fra cavitate, blev ikke alle kerner fjernet. Histon deacetylase 1 (HDAC1) fra nukleoplasmaet og fibrillarin fra nucleolus, fandtes både i PNS og pellet. Tilstedeværelsen af HDAC1 i toerstoffet og ikke i supernatanten tyder på, at PNS er forurenet med kerner, snarere end nuklear forstyrrelser under kavitation. Dette er i overensstemmelse med rapporter om, at presse bombe til 350 psi efterlader kerner intakt10, selv om vores brug af hypotonic buffer kan gengive atomkerner skrøbelige, som drøftet i det senere afsnit.
Vi sammenlignede homogenisering af kvælstof kavitation effektivitet med de andre fælles metoder, fysiske forstyrrelser. Lige store mængder af Jurkat celler blev suspenderet i identiske hypotonic homogenisering buffer og udsat for forstyrrelse af forskellige metoder. Fandtes påviselig tab af prøver i Dounce homogenisering og kvælstof kavitation (i begge tilfælde omkring 5-10% mindre volumen er indsamlet). Kvælstof kavitation gav imidlertid den højeste ekstraktionseffektivitet af protein; nål passage og Dounce givet kun 60% så meget protein (figur 3). Nysgerrigt, inddrivelse af nogle proteiner, som bestemmes af immunblot ikke udviste en betydelig forskel mellem de forskellige mekaniske forstyrrelser metoder. Men udbyttet af visse perifere Membranproteiner hexokinase 1 og RAS var højere i prøver forberedt med kvælstof kavitation. Dette understøtter at kvælstof kavitation kan være optimal for homogenisering når undersøger perifere Membranproteiner. Inddrivelse af HDAC1 proteiner af kvælstof kavitation er sammenlignelig med andre metoder, tyder på, at kerner forbliver intakte under alle forhold. Dataene i figur 3 viser således, at kvælstof kavitation tilbyder overlegen homogenisering resultater.
Næste, vi sammenlignet homogenisering effektivitet mellem hypotonic buffer og den samme buffer men fremstillet isotonisk med enten saccharose eller natriumchlorid (figur 4). Tilsvarende mængder af protein blev inddrevet fra Jurkat celler homogeniseret i hypotonic buffer versus NaCl isotonisk buffer efter kavitation på 350 psi. Derimod blev mindre protein genfundet i PNS celler forstyrret i buffer fremstillet isotonisk med saccharose. De fleste individuelle proteiner undersøgt af immunblot passer dette mønster. En undtagelse var fibrillarin, der var forholdsvis beriget i PNS genereret i isotonisk buffer.
Til at bestemme, hvis vores protokol kan anvendes til at undersøge partitionering af perifere Membranproteiner mellem opløselige og membran fraktioner, vi sammenlignede partitionering mønstre mellem FLAG-tagged nationale tilsynsmyndigheder vildtype og dens prenylation-mangelfuld mutant, () C186S Figur 5). Ved steady state var vildtype nationale tilsynsmyndigheder til stede i cytosol og membraner, ligner mest perifere Membranproteiner, selvom den del inddrives i den vandopløselige fraktion er større end for andre RAS proteiner14. Når de nationale tilsynsmyndigheder er frataget sin prenyl ændring, det mister evnen til at knytte til membraner og bliver helt cytosole. De forventede partitionering mønstre af de nationale tilsynsmyndigheder bekræftet, at vores protokol er en pålidelig mulighed for at studere dynamikken i partitionering af perifere Membranproteiner mellem cytosol og membraner.
Figur 1: Flowchart sammenfatter trin 2 (blå), trin 3 (rød) og trin 4 (gul) i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Protein opdeling mellem de cytosole og membran fraktioner. HEK-293, NIH-3T3 og Jurkat celler blev udsat kvælstof kavitation (~ 350 psi i 20 min., suspenderet i hypotonic homogenisering buffer) og ultracentrifugering (~ 350.000 x g i 1 h) som beskrevet i protokollen. Endogene protein niveauer i forskellige fraktioner blev analyseret af immunblot. PNS: Receptor-bindende kræft antigen udtrykt på SiSo celler (RCAS), nukleare supernatanten, S: supernatanten, P: pellet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af forskellige mekaniske forstyrrelser teknikker. Tilsvarende beløb af Jurkat celler blev suspenderet i hypotonic buffer og underkastes fryse-tø (3 cykler), nål passage (5 passerer, gennem 28G½ nål), Dounce homogenisering (15 passerer, Kontes 2 mL Dounce rør med en væv grind pistil, regnskabsafslutning 0,01-0,06 mm) eller nitrogen kavitation (~ 350 psi i 20 min.). Relative niveauer af endogent proteiner i PNS blev analyseret af immunblot for hver metode. Total protein koncentrationer af PNS var kvantificeres ved BCA assay og normaliserede værdi af PNS udarbejdet af kvælstof kavitation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4: sammenligning af hypotonic og isotonisk buffere anvendes under kvælstof kavitation. Tilsvarende mængder af Jurkat celler blev suspenderet i hypotonic buffer, eller hypotonic buffer suppleret med 8,5% saccharose eller 150 mM NaCl, og udsat kvælstof kavitation (~ 350 psi i 20 min.). Relative niveauer af endogent proteiner i PNS blev analyseret af immunblot for hver buffer. Total protein koncentrationer af PNS var kvantificeres ved BCA assay og normaliserede værdi af PNS parat i hypotonic buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Farnesylated NRAS partitioner i både P og S fraktioner. HEK-293 celler var forbigående transfekteret med plasmider lede udtryk for FLAG-tagged nationale tilsynsmyndigheder vildtype eller C186S mutant. Protein opdeling blev udført som beskrevet i figur 2 og de angivne Proteinniveau var analyseret af immunblot. Gengivet med tilladelse (Zhou, M et al., 2016. Oprindeligt offentliggjort i Journal of celle Biology. https://Doi.org/10.1083/JCB.201604061). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordele af kvælstof kavitation over andre metoder af mekanisk afbrydelse er mangfoldige. Måske er den mest markante fordel dens evne til at blidt men effektivt homogeniseres prøver. De fysiske principper af dekompression køler prøver i stedet for at skabe lokale varme skader som ultralyd og friktion/klipning grundlag teknikker. Kavitation er også meget effektive til at forstyrre plasmamembran. Fordi kvælstof bobler der genereres inden for hver enkelt celle efter dekompression, kavitation proces er begrænset mindre af Cellestørrelse, prøve størrelse eller prøve koncentration. Det kan derfor tilbyde yderligere fordele i forhold til minerydning-baserede Dounce eller nål passage homogenisering. Kvælstof kavitation giver også mere ensartede resultater som den samme forstyrrende kraft, der anvendes ensartet i hele prøven kan gengives med identiske pres. Desuden, hver celle kun oplever forstyrrelser proces for en enkelt gang og subcellulært komponenter er derfor ikke konstant udsat for variable forstyrrende kræfter. Dette begrænser artefactual fragmentering af organeller. Bekymring for oxidation labile blodlegemers skyldes forstyrrelser er også mindsket, som nitrogen bruges til at mætte cellesuspension og er fri for supplerende ilt. De begrænsede fysiske og kemiske belastninger pålagt af kvælstof kavitation gør det en ideel teknik til at studere labile enzymer og skrøbelige organeller og reproducerbarhed af denne homogenisering teknik er velegnet til kvantificering.
Kvælstof kavitation tilbyder også betydelig fleksibilitet med hensyn til prøvestørrelse, sammensætning af homogenisering buffere og graden af organelle integritet. Du kan skalere op til homogenisering, nødt man simpelthen til at installere trykbeholdere af større kapacitet, uden at ofre hastighed, bekvemmelighed og effektivitet af dekompression. Enhver homogenisering buffer kan anvendes til kvælstof kavitation; buffer valg kan skræddersys til kompatibilitet med kravene i hvert forsøg. Man kan designe en homogenisering buffer, der matcher den intracellulære væske (f.eks.høj kalium og lavt natrium) at minimere ændringer i organeller. For eksempel, udviklet vi en "afslapning" buffer, der minimerer ex vivo actin polymerisation og derved hjælper med at indsamle intakt cytoplasmatisk vesikler fra granulocytter5. De osmotiske og ioniske funktioner af bufferen kan også ændres for at kontrollere graden af celle homogenisering. Derudover kan aggressivitet af cellulære forstyrrelser styres ved at justere kvælstof trykket. Moderat pres reducerer de forstyrrende kraft at bevare kerner, mitokondrier og andre organeller i intakt tilstand, mens højtryk forstyrrer disse organeller. Brock mfl. rapporteret succes med afbrydelse af rotte baserig leukæmi celler samtidig med at de fleste kerner intakt på 350 psi med hypotonic buffer10, som danner grundlag for kvælstof trykket bruges i vores nuværende protokol.
Begrænsninger af kvælstof kavitation omfatter, at homogenisering er ensartet i hele prøverne og forskellige membran strukturer kan producere blærer af lignende størrelse; Dette kan komplicere yderligere adskillelse af plasma membran, glat microsomes, endosomes og Golgi membraner af sats-zonal tæthed gradient centrifugering. En anden bekymring er, at organeller blive relativt skrøbelig efter homogenisering på grund af brud indefra. Således, denne metode kræver omhyggelig optimering til at forhindre organelle brud i efterfølgende manipulationer. Vi sigter mod at løse nogle af disse spørgsmål i denne undersøgelse.
Adskillelse af cytosole og membran brøker ved centrifugering er blevet undersøgt i begrænset rapporter beskriver partitionering af protein fraktioner med en håndfuld af protein markører15,16. Vores metode genererer en rå adskillelse af opløselige og membran-bundet proteiner, og involverer ikke isolation af særlige organeller. Men det er stadig en velbegrundet bekymring, at de homogene vesikler af forskellige membraner produceret af kavitation kan påvirke effektiviteten af adskillelse af ultracentrifugering. Vi forelagt en omfattende undersøgelse af immunoblots i isolation og partitionering af fælles subcellulært organeller efter fraktionering med vores protokol. Som forventet, rent cytosole proteiner som RhoGDI er udelukkende i den opløselige del og transmembrane proteiner på plasma membran (PM) som EGFR og Na+/K+ ATPase, blev inddrevet kun i toerstoffet. Transmembrane proteiner på organeller ER, mitokondrier, Golgi og lysosomer var også inddrives i pellet, bekræfter, at integreret Membranproteiner fra forskellige membraner og organeller med succes kan holdes adskilt fra opløselige proteiner med vores metode. Denne grundlæggende validering er afgørende for den videre analyse af perifere Membranproteiner, som er det vigtigste formål med denne protokol.
De fleste af de perifere Membranproteiner findes i både de cytosole og membran fraktioner. Selv om dette er ofte en korrekt gengivelse af deres lokalisering, det kan i nogle tilfælde repræsenterer artefactual omfordeling af disse proteiner fra cytoplasmatisk overfladen af membraner til den vandopløselige fraktion i løbet af homogenisering processen, siden den styrken af deres tilknytning til membraner er ikke så stærk som integreret Membranproteiner. Selvom kvælstof kavitation minimerer potentielle omfordeling ved at udsætte celler til en engangs, blid forstyrrelser, bør man være opmærksom på sådanne kulturgenstande af biokemiske fraktionering og fokus på ændringer i partitionering af proteiner mellem cytosole og membranen fraktioner på tværs af eksperimentelle betingelser. Ikke desto mindre er undersøgelse af perifere Membranproteiner på forskellige stadier af endosomal modning muligt med denne metode. EEA1, en Rab5 effektor, der medierer docking af clathrin-belagt vesikler til den tidlige endosomes, lokaliserer på cytoplasmatisk overfladen af tidligt endosomes og blev genfundet primært i pellet brøkdel. Sen-endosome-relaterede Rab7 og Rab9 proteiner er også på pellet brøkdel. Der er dog stadig en mærkbar mængde Rab7/9 i cytosol. Fordi RabGDI er i stand til at interagere med prenylated Rabs og gøre disse ellers uløselige proteiner cytosole, Rab proteiner har tendens til at være mere cytosole end andre endosome-relaterede perifere Membranproteiner.
At karakterisere den nukleare og organelle integritet med homogenisering af kvælstof kavitation, vi immunoblotted de isolerede fraktioner til både luminale og cytoplasmatisk rum. I denne analyse, er calregulin fuldt frigivet i de opløselige brøkdel, demonstrere at ER er forstyrret til form microsomes og dermed lækager luminale indhold. I betragtning af at man halvdelen af det samlede areal af membranen i en eukaryote celle omslutter de labyrintiske rum i Skadestuen, er det ikke overraskende, at dens enorme netværk af sac-lignende eller rørformede struktur ikke forblive intakte under udvidelse af kvælstof bobler. På den anden side vores analyse af mitokondriel integritet efter kavitation viser klart afhængighed celletype, så vi observeret F1-ATPase, et protein, som er perifert forbundet med den indre membran af mitochondrier, i det cytosole brøkdel i varierende grad (~ 35% for HEK-293 og Jurkat, 2% for NIH-3T3). Dette indikerer, at kvælstof kavitation på 350 psi med hypotonic buffer garanterer ikke mitokondrie integritet. Ja, andre har rapporteret, at for at bevare mitokondrier, kavitation bør udføres på pres lavere end 150 psi17. Vi fandt derimod, at katalase forbliver i lumen af peroxisomer. Intriguingly, er nukleare proteiner observeret i PNS og pellet fraktioner. Specifikt, HDAC1, en Histon deacetylase stede i hele nukleoplasmaet, er fraværende i de opløselige fraktion, der angiver, at den nukleare integritet ikke bringes i fare. Dette tyder på, at den nukleare kuvert ikke er bristet af kavitation, som man ville forvente frigivelse af HDAC1 i solubLe brøkdel i dette scenario. Det er sandsynligt at kerner fjernes ikke helt i løbet af processen af PNS forberedelse, og proteinet er fortsat i toerstoffet efter ultracentrifugering. Denne sandsynlighed understøttes yderligere af det faktum, at ingen DNA lækage er opdaget i den vandopløselige fraktion. Vi konkluderer derfor, at bruge hypotonic homogenisering buffer under kavitation på ~ 350 psi med tilsætning af Mg2 + er stand til at bevare nukleare integritet i flere cellelinjer.
Vores resultater viser også, at ribosomer indsamler udelukkende på membran pellet brøkdel, tyder på, at selv frie ribosomer i cytoplasmaet, er ubundne til ER membraner kan være helt aflejret i en ikke-saccharose-pude buffer efter centrifugering ved 350.000 x g til 1 h. ligeledes, identifikation af autophagy-relaterede proteiner 12 (Atg12)-Atg5 konjugat som markør af autophagosomes, afslører strenge opdeling til pellet fraktioner. Sin tilstedeværelse i cytosol kan være forårsaget af det faktum, at den kovalente udlæg i Atg12 og Atg5 forud for autophagosomes dannelse. Cytoskeletal proteiner er vanskeligt at vurdere på grund af ex vivo polymerisering. Dette fænomen kan minimeres med en afslapning buffer men i protokollen beskrevet her, tubulin er sandsynligvis polymeriseret ex vivo efter kelation af calcium 18. I vores forberedelser findes tubulin i toerstoffet tyder på polymerisering, hvorimod actin er fundet i både P og S fraktioner.
For at karakterisere potentielle fordele af kvælstof kavitation i homogenisering effektivitet, gennemgik vi nogle fælles mekanisk afbrydelse teknikker. Metoder optimeret til vævsprøver som blender eller mørtel/pistil blev ikke evalueret. Sonikering var også udelukket, da det er vanskeligt at forstyrre den overflade membran samtidig med de indre organeller intakt. Vores analyse fokuserer på følgende metoder: fryse-tø, nål passage og Dounce homogenisering, da de er nemme at udføre og kræver ikke særligt udstyr såsom en kugleleje homogeniseringsapparat. Jurkat celler blev brugt i denne analyse på grund af deres lille størrelse, som gør dem vanskelige at homogenisere effektivt med traditionelle flydende klipning teknikker, der er afhængige af clearance, såsom nål passage og Dounce. Bedømt af koncentrationen af total protein inddrives, fandt vi, at celle-størrelse uafhængige forstyrrelser metoder såsom kvælstof kavitation og fryse-tø faktisk vise overlegne effektivitet af protein udvinding. Lignende analyse med celler i større størrelser afslørede mindre forskelle i homogenisering effektivitetsfordele, selvom kvælstof kavitation er stadig bedre end alternative fysiske metoder testet (data ikke vist).
Mange cytosole, endosomal og cytoskeleton proteiner blev effektivt inddrevet med alle afprøvede metoder. Derimod blev proteiner ER og Golgi optimalt genoprettet ved hjælp af kvælstof kavitation. Det lidt lavere udbytte af F1-ATPase i kvælstof kavitation i forhold til de andre metoder kan afspejle, at mitokondrier er mere tilbøjelige til at forblive intakte under kavitation og derfor mere effektivt fjernet i langsom hastighed spin bruges til at generere PNS. Observationen at hexokinase 1, en perifer membran protein fundet både i cytosol og forbundet med den ydre membran, opførte sig i den modsatte mode i forhold til F1-ATPase sandsynligvis afspejler labilitet for Sammenslutningen af hexokinase 1 i forhold til F1-ATPase, som er afsondret inde i mitokondrierne. Vigtigere, selvom det i stand til at forstyrre celler med sammenlignelige effektivitetsgevinster, gav alternative mekanisk afbrydelse metoder relativt dårlige genopretning af visse perifere Membranproteiner (hexokinase 1 og RAS). Kavitation er således vores homogenisering teknik valg med henblik på at undersøge om deling af perifere Membranproteiner. Fordi Dounce homogenisering er almindeligt anvendt til at forberede intakt kerner, brugte vi Dounce som en benchmark til at evaluere nukleare integritet på tværs af andre mekaniske forstyrrelser metoder. I vores analyse bekræfter lignende niveauer af inddrivelse af HDAC1 proteiner, at kerner forbliver intakt i Jurkat homogeniseret udarbejdet af kvælstof kavitation på ~ 350 psi med hypotonic buffer.
Det var tydeligt at den homogenisering buffer, der bruges under kvælstof kavitation kan påvirke forstyrrelser effektivitet og organelle integritet. Sammensætningen af homogenisering buffer bør optimeres til kravene i den tilsigtede anvendelse, men det er værd at bemærke, at forskere udfører kvælstof dekompression af animalsk væv bruge buffer med et lavt osmotisk tryk til at udtrække nukleare indholdet. Hunter og Commerford viste kerner hævelse og brud når løsningerne blev fortyndet og kerner bevarelse når ved hjælp af isotonisk løsninger7 (som kan opnås ved enten at tilføje uorganiske salte som natriumchlorid eller opløste organiske stoffer såsom saccharose eller glycerol). Den standard isotonisk buffer, der bruges til at isolere subcellulært organeller end kerner fra pattedyrceller er 0,25 M saccharose indeholdende 1 mM EDTA og bufferet med Tris, HEPES eller Tricine ved pH 7,0-7.6. Men ikke alle kultur celler kan være effektivt homogeniseret i en af de isotoniske buffere. Hypotonic buffer (normalt 10 mM Tris, HEPES, etc.) er ofte bruges til at levere nødvendige osmotisk stress til bestemte celletyper til at opnå fuldstændig homogenisering. Men, som nævnt før, hypotonic buffere tendens til at gengive atomkerner, skrøbelig og udsat for lækage af DNA når EDTA er inkluderet. For at fremme nuklear integritet, erstatte vi EDTA med KCl og lave koncentrationer af divalent kationer såsom MgCl2 eller MgSO4. Mg2 + foretrækkes normalt over Ca2 + fordi sidstnævnte kan aktivere visse phospholipases og proteaser og hæmmer RNA polymerase. Når kavitation er færdig, EDTA eller EGTA kan tilføjes tilbage til homogeniseret til Chelat kation, hvis det kræves til at hæmme metalloproteases.
Jurkat celler viser en relativt stor kernen til cytoplasmaet ratio, hvilket gør dem en ideel cellelinie at studere nukleare integritet. Forhøjelsen af homogenisering effektivitet ved hjælp af hypotonic buffer er minimal, når man sammenligner til isotonisk buffer suppleret med NaCl. Dog genopretter kavitation i en isotonisk buffer suppleret med saccharose ca halvdelen af proteiner udvundet ved hjælp af en hypotonic buffer modstykke. Det er usandsynligt, at være et direkte resultat af isotonicity, og misforholdet mellem ved hjælp af NaCl og bruge saccharose for at opnå isotonicity kræver yderligere undersøgelser. En mulig forklaring er, at salt forstyrrer elektrostatiske interaktion mellem proteiner henviser saccharose ikke. NaCl har således, endda på den samme tonicity, en aktivitet, der er relevante for protein udvinding, som saccharose mangler. WEd hensyn til at bevare nukleare integritet, fandt vi øget fibrillarin proteiner inddrives med isotonisk buffere, trods isotonisk buffere teoretisk bliver mere beskyttende af kerner. Nysgerrigt, var den mitokondrielle brøkdel mere effektivt ekstraheres med isotonisk buffer suppleret med NaCl, tyder på, at lav salt betingelser kan være suboptimal til mitokondrier udvinding. I betragtning af kavitation med hypotonic buffer opnår den bedste balance mellem homogenisering effektivitet og nukleare integritet, bliver den hypotonic buffer buffer valg i vores protokol af kavitation. Men vi advare læserne at ingen buffer er en garanti for optimal homogenisering resultater. Vores protokol bør tjene som skabelon for optimering, og pilot test med ønskede buffere, cellelinjer af renter og andre variabler (pres, buffer sammensætning, osv.) skal fastsættes for de bedste resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af GM055279, CA116034 og CA163489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
References
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
