Summary
Här presenterar vi protokoll för tvättmedel-fri homogenisering av odlade däggdjursceller baserat på kväve kavitation och efterföljande separation av cytosoliska och membran-bundna proteiner av ultracentrifugering. Denna metod är idealisk för övervakning av uppdelning av perifera membranproteiner mellan lösliga och membran fraktioner.
Abstract
Odlade celler är användbara för att studera subcellulär fördelningen av proteiner, inklusive perifera membranproteiner. Genetiskt kodade fluorescently har märkta proteiner revolutionerat studiet av subcellulär protein distribution. Det är dock svårt att kvantifiera distribution med fluorescerande mikroskopi, särskilt när proteiner är delvis cytosoliska. Dessutom är det ofta viktigt att studera endogena proteiner. Biokemiska analyser såsom immunoblots förblir den gyllene standarden för kvantifiering av protein fördelningen efter subcellulär fraktionering. Det finns kommersiella kit som syftar till att isolera cytosoliska eller vissa membran fraktioner, bygger de flesta av dessa kit på extraktion med rengöringsmedel, som kan vara olämpliga för att studera perifera membranproteiner som utvinns enkelt från membran. Här presenterar vi ett tvättmedel-fritt protokoll för cellulära homogenisering av kväve kavitation och efterföljande separation av cytosoliska och membran-bundna proteiner av ultracentrifugering. Vi bekräftar separation av subcellulär organeller i lösliga och pellet fraktioner över olika celltyper och jämföra protein utvinning bland flera gemensamma icke-diskmedel-baserade mekaniska homogenisering metoder. Bland flera fördelar med kväve är kavitation överlägsen effektivitet av cellulära störning med minimal fysisk och kemisk skada känsliga organeller. Kombinerat med ultracentrifugering, kväve kavitation är en utmärkt metod att undersöka skiftet av perifera membranproteiner mellan cytosoliska och membran fraktioner.
Introduction
Cellproteiner kan delas in i två klasser: de som är associerade med membran och de som inte är. Icke-membran associerade proteiner finns i cytosolen, nukleoplasman och lumina av organeller såsom det endoplasmatiska retiklet (ER). Det finns två klasser av membran-associerade proteiner, integrerad och perifera. Integrerad membranproteiner är också känd som transmembrana proteiner eftersom ett eller flera segment i kedjan polypeptid spänner membranet, vanligtvis som en α-helix består av hydrofoba aminosyror. Transmembrana proteiner infogas co-translationally membran under deras biosyntes och förblir så konfigurerade tills de är kataboliseras. Perifera membranproteiner drivs sekundärt till membran, vanligtvis till följd av posttranslationella modifieringen med hydrofoba molekyler såsom lipider. I motsats till integrerad membranproteiner, föreningen av perifera membranproteiner med cellmembran är reversibel och kan regleras. Många perifera membranet proteiner funktion i signalvägar och reglerade association med membran är en mekanism för att aktivera eller hämma en väg. Ett exempel av en signalmolekyl som är en perifer membranprotein är de små GTPase, RAS. Efter en serie av post-translationella modifieringar som inkluderar modifiering med en farnesyl lipid, infogar modifierad C-terminus en mogen RAS-protein i cytoplasmiska bipacksedeln av cellulära membran. Plasmamembranet är bestämt, där RAS engagerar sina nedströms effektor RAF1. För att förhindra konstitutiv aktivering av mitogen-aktiverat protein kinase (MAPK), finns flera nivåer av kontroll över RAS. Förutom rendering RAS inaktiva av screening GTP till BNP, kan aktiv RAS också frigöras från plasmamembranet av modifieringar eller interaktioner med solubilizing faktorer för att hämma signalering. Även om fluorescerande levande imaging ger cellbiologer möjlighet att följa subcellulär lokalisering av fluorescerande protein-taggade perifera membranet proteiner1, återstår det ett kritiskt behov att utvärdera membran sammanslutning av endogena proteiner semi kvantitativt med enkel biokemiska metoder.
Ordentlig biokemiska utvärderingen av protein partitionering mellan membran och lösliga fraktioner är kritiskt beroende av två faktorer: cellulär homogenisering och effektiv separation av membran och lösliga fraktioner. Även om vissa protokoll, inklusive de mest använda kommersialiserade kit, är beroende av diskmedel-baserade cell homogenisering, kan dessa metoder fördunkla analys genom att extrahera membranproteiner in i löslig fas2. Således ger icke-tvättmedel baserat, mekaniska metoder för cell störningar renare resultat. I området i närheten finns det flera metoder för mekaniska störningar i cellerna odlas i kultur eller skördas från blod eller organ. Dessa inkluderar Dounce homogenisering, fin nål störningar, kullager homogenisering, ultraljudsbehandling och kväve kavitation. Här vi utvärdera kväve kavitation och jämföra det med andra metoder. Kväve kavitation är beroende av kväve som är upplöst i cytoplasman i celler under högt tryck. Efter Jämviktstiden utsätts plötsligt cellsuspensionen till atmosfärstryck så att kväve bubblor bildas i cytoplasman som riv cellen till följd av deras gasutveckling. Om trycket är tillräckligt högt, kväve gasutveckling kan störa den nucleus3 och membran bundna organeller som lysosomer4. Men om trycket hålls tillräckligt låg, kommer dykarsjukan störa plasmamembranet och ER men inte andra organeller, därmed spilla både cytosol och intakt cytoplasmiska organeller i Homogenatet som designeras den cavitate5. Av denna anledning är kväve kavitation metoden för val av isolera organeller som lysosomer och mitokondrier.
Men är det också ett utmärkt sätt att förbereda en Homogenatet som enkelt kan delas in i membranet och lösliga fraktioner. Tryckkärlet (hädanefter kallad ”bomben”) används under kavitation består av ett tjockt rostfritt stål hölje som tål högt tryck, med ett inlopp för leverans av kvävgas från en tank och en outlet-port med en justerbar avtappningsventil.
Kväve kavitation har använts för cell homogenisering sedan 1960-talet6. I 1961, jägaren och Commerfold7 etablerade kväve kavitation som ett hållbart alternativ för däggdjursvävnader störningar. Sedan dess har forskare har anpassat tekniken till olika celler och vävnader med framgång, och kväve kavitation har blivit en stapelvara i flera program, inklusive membran beredning8,9, kärnor och organell förberedelser10,11, och labila biokemiska extraktion. För närvarande, använder cellbiologer oftare andra metoder av cell homogenisering eftersom fördelarna med kväve homogenisering inte har varit allmänt annonserat, kväve bomber är dyra och det finns en missuppfattning att ett relativt stort antal celler är krävs. Protokoll för kväve kavitation att uppnå cell-fri homogenates med intakt kärnor inte har publicerats, och i den publicerade utvärderingar volymer av 20 mL cellsuspension användes. För att anpassa denna klassisk teknik för att passa aktuella krav som arbetar med småskaliga prover, presenterar vi ett modifierat protokoll av kväve kavitation utformats speciellt för odlade celler. Efter kväve kavitation, Homogenatet separeras i lösliga (S) och membran (P) fraktioner av differentiell centrifugering, först med en låg hastighet spin ta bort kärnor och obruten celler, och sedan med en snabb spinn (> 100 000 x g) att skilja hinnor från den lösliga fraktionen. Vi analysera effektiviteten av separation med immunoblots och jämför kväve kavitation med andra mekaniska störningar tekniker. Vi undersöker också den osmotiska effekten av homogenisering buffert under kväve kavitation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. buffert och utrustning preparat
- Chill 45 mL cell störningar bomber, 15 mL rör och ultracentrifugering rören vid 4 ° C.
- Förbered och chill 25 mL homogenisering buffert per 2 x 10 7 celler vid 4 ° C. Lägg en proteas hämmare tablett strax före användningen.
Obs: Homogenisering buffertar innehåller vanligtvis KCl snarare än NaCl att bättre spegla intracellulära salt sammansättning. Homogenisering buffert används i detta protokoll består av 10 mM HEPES vid pH 7.4, 10 mM KCl och 1,5 mM MgCl 2 (nedan kallad hypoton homogenisering buffert). De flesta buffertar kan anpassas för kväve kavitation (se diskussionen). - Förbered och chill 6 mL 1 x Phosphate-Buffered saltlösning (PBS) buffert per provet vid 4 ° C. Lägg proteas hämmare tabletter färska före användning.
Obs: PBS-bufferten används i detta protokoll består av 10 mM Na 2 HPO 4 vid pH 7.4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl och 2,7 mM KCl. - Förbered och chill lösbarhet buffert per provet vid 4 ° C. Lägg en proteas hämmare tabletten precis innan användning 4 mL.
Obs: Lösbarhet buffert används i detta protokoll är 1 x Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysbuffert, som består av 25 mM Tris vid pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxikolat och 1% NP-40. Se 4.6 not.
2. Cellen skörd
- växa 2 x 10 7 -10 x 10 9 vävnadsodling celler med den rekommenderade Odlingsmedier för celltypen. Vanligtvis, en 15-cm skålen ger 2 x 10 7 HEK-293 celler odlade i DMEM på 90% konfluens ( figur 1).
- Ta bort odlingsmedium genom vakuum.
- För vidhäftande celler, placera kultur rätter på is, tvätta cellerna direkt på kultur rätter försiktigt med kylda homogenisering buffert två gånger (10 mL buffert per 15 cm skålen per tvätt) och skörda cellerna med en stor cell skrapa i en lämplig volym av homogenisering buffert; För suspension celler, samla in och tvätta cellpelleten i kylda homogenisering buffert två gånger (10 mL buffert per 50 mL kultur per tvätt) med 500 x g spinn vid 4 ° C i 5 min, och återsuspendera cellpelleten tvättade i en lämplig volym av homogenisering buffert på is.
Obs: volymen bör baseras på kraven för proteinkoncentration i de avsedda experiment samt minimal/maximal volym tillåtna i cell störningar bomben. En allmän riktlinje är 2-10 x 10 7 celler/mL, eller cirka 10 volymer av cellen pellet. Detta protokoll är optimerad för tre 15 cm rätter av HEK-293 celler i 2 mL homogenisering buffert.
3. Kväve kavitation
- överföring cellsuspensionen till en ren och kylda bomb i ett isbad på uppståndelse plattan.
FÖRSIKTIGHET: Bomben har högt tryck, låg temperatur, kvävgas – bära lämplig personlig skyddsutrustning . - Placera en mikro magnetiska rör bar släpper bomben och slå på uppståndelse plattan att upprätthålla suspension homogenitet.
- Lägg till en proteas hämmare tablett till upphängningen och Stäng bomben per tillverkare ' s instruktion.
- Gradvis trycksätta bomben med kväve gastank per tillverkare ' s instruktion tills bomben tryckmätaren läser 300 till 600 psi. Stäng alla ventiler och koppla från kväve tanken.
Obs: Det tryck som behövs kan variera med celltypen. Här vi utfört kavitation vid 350 till 400 psi för cellerna HEK-293, NIH-3T3 och Jurkat. - Vänta 20 min så att kvävet att upplösa och nå jämvikt inom cellerna.
- Ta bort överflödigt vatten runt utloppsventilen med hjälp av en trasa handduk. Öppna utloppsventilen försiktigt för att uppnå en droppvis release av Homogenatet och samla i en pre kylda 15 mL tub.
Obs: Nära slutet av samlingen kommer det att finnas en spurt av Homogenatet och gas kommer att dyka upp med ett väsande ljud. Kontrollera att gasen inte orsak samlats in tidigare cavitate för att skjuta ut ur röret (därav användningen av 15 mL rör istället för 1,5 mL rör). När spurt börjar, Stäng utloppsventilen och öppna kväve inloppsventilen abrupt för att tryckutjämna bomben och uppnå kavitation resterande celler i bomben. Öppna bomben för cavitate återhämtning och noggrann rengöring.
Obs: Den slutliga cavitate skall ha en mjölkaktig utseende med skum på toppen. Rör varsamt med en pipettspetsen så att skummet avta innan centrifugering.
Obs: Undersöka cavitate av faskontrast mikroskopi att bestämma homogenisering effektivitet. Lägg en 15 µL droppe av cavitate på ytan av en mikroskopi bild och täck med ett täckglas. Upprepa steg 3.4-3.6 endast om alltför många obruten celler upptäcks med ett 20 X mål.
Obs: Om homogenisering buffert inte innehåller EDTA eller EGTA, lägga till den insamlade cavitate med en slutlig koncentration på 1 mM inom 5 min efter utskrivning.
4. Separation av Cytosolic och membran fraktioner
- centrifug cavitate på 500 x g under 10 minuter vid 4 ° C ta bort obruten celler och atomkärnor.
Obs: Upprepa centrifugeringssteget tills inga synliga pellets produceras och samla Post Nuclear Supernatant (PNS) samtidigt undvika skummet flyter på toppen. Re Centrifugera skummet för att samla in och kombinera PNS, om nödvändigt ( figur 1). - Bearbeta PNS som önskat att få bråkdelar av intresse. I syfte att avskilja cytosoliska och membran fraktioner, överföra PNS till en ultracentrifugen röret och utföra ultracentrifugering som önskas. Detta protokoll är optimerad för en < 3,5 mL prov på polykarbonat ultracentrifugen tub och för ultracentrifugering vid 350 000 x g för 1 h vid 4 ° C.
- Samla supernatanten (den S fraktionen) med 1 mL pipett.
- Skölj noggrant pelleten med 3 mL kall PBS utan att störa den. Ta bort PBS av vakuum.
Obs: Om förorening av den membran fraktionen av cytosoliska proteiner är ett större bekymmer än förlusten av prov, återsuspendera pelleten i 3 mL kall PBS och re-ultracentrifugen som i steg 4,2. Ta bort PBS av vakuum. - Återsuspendera pelleten fullt i en lämplig volym av tvättmedel innehållande lösbarhet buffert av val. För att uppnå cell likvärdighet, Använd samma volym av lösbarhet buffert som den cytosoliska fraktionen.
Obs: Vi föreslår att du använder 1 x RIPA buffert som lösbarhet buffert för effektiv membran protein utvinning. Om ingen efterföljande analys krävs för membran bråkdel, Använd 1 x laemmli prov buffert för maximal membran protein utvinning.
Obs: Vi föreslår lossnar och överföra pelleten i lösbarhet buffert till en ren röret på en tube rotator vid 4 ° C för maximal membran protein utvinning.
Obs: Om pelleten är alltför klibbig (alltför många lipider) avlägsnas effektivt från the ultracentrifugen tube i lösbarhet buffert, vi föreslår snapin frysning pelleten i flytande kväve och snabbt lossnar pelleten från ultracentrifugen röret med en mini metall spatel innan pelleten blidväder.
Obs: Alternativt membran pellets kan bara resuspended och inte solubilized i en icke-tvättmedel-innehållande buffert för att producera en P bråkdel av membran vesikler fjädring, i vilket fall centrifugeringen steg i 4.6 inte krävs. Sådan P fraktioner är användbara när du undersöker funktioner såsom enzym som är beroende av membran association. - Centrifugera fullt solubilized pellet fjädringen från steg 4,5 vid 20 000 x g i en bordsskiva Centrifugera i 10 min vid 4 ° C. samla supernatanten med 1 mL pipett (den P fraktionen) och kassera pelleten (olösliga lipider).
- Utför önskad analyser såsom western blotting med cytosoliska eller membran fraktioner, eller spara dem vid-80 ° C för framtida användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar delningen av cellulära proteiner från PNS i antingen lösliga cytosoliska bråkdel (S) eller membran pellet bråkdel (P). Vi har granskat tre representativa cellinjer från olika celltyper: HEK-293 (epitelceller), NIH-3T3 (fibroblast) och Jurkat (lymfocyter). Rho guanin Dissociation hämmare (RhoGDI) och katjon-oberoende mannos-6-fosfat-receptorn (CIMPR) användes som positiva kontroller för cytosoliska och membran fraktioner, respektive. Vi bekräftade den effektiv separationen av cytosol och membran efter kväve kavitation vid ~ 350 psi i hypoton buffert följt av ultracentrifugering vid 350 000 x g för 1 h. Det totala proteinet återhämtat sig från S och P fraktioner analyserades sedan med markörer för ER, endosomes och lysosomer, mitokondrier, Golgi och andra organeller. Alla transmembrana proteiner finns i membranet fraktionen uteslutande, inklusive Na+k+ ATPas och epidermal tillväxtfaktor (EGFR) från plasmamembranet, calnexin från ER, lysosomala-associerade membranprotein 1 (LAMP1) från lysosomer, F0-ATPas från mitokondrier och Golgin 97 från trans Golgi nätverk. Som förväntat, många perifera membranproteiner som är löst associerade med membranet är närvarande både i cytosoliskt och membran fraktioner i varierande grad. Anmärkningsvärda exempel på tidig endosome antigen 1 (EEA1), Rab7/9 (slutet endosomes) och hexokinas 1 (yttre mitokondrier membran). Detta visar nyttan av denna teknik i utvärdering av membran association styrkan av perifera proteiner. Vårt laboratorium har utnyttjat denna kavitation teknik undersöka membran föreningen status för flera signalering molekyler5,12,13,14. Intressant nog fann vi calregulin nästan uteslutande i lösliga fraktionen, tyder på att de mikrosomer genereras från ER membran har också störts under kväve kavitation och proteinerna i ER lumen släpps till den lösliga fraktionen. Mitokondrier efter kavitation integritet är däremot beroende på celltyp. Vi observerade F1-ATPas, en inre mitokondrier perifera protein, delvis i cytosoliskt fraktionen alltifrån 2% för NIH-3T3-celler ~ 35% för HEK-293 och Jurkat celler. Detta indikerar att kväve kavitation vid 350 psi med hypoton buffert garanterar inte mitokondriernas integritet. Trots tre cykler av 500 x g spins att generera PNS från cavitate, togs inte alla atomkärnor bort. Histon histondeacetylas 1 (HDAC1) från nukleoplasman och fibrillarin från nucleolus, hittades både i PNS och pelleten. Närvaron av HDAC1 i pelleten och inte i supernatanten föreslår att PNS är förorenat med atomkärnor, i stället för nukleära störningar under kavitation. Detta är förenligt med rapporter som tryckförvaring bomben till 350 psi lämnar kärnor intakt10, även om vår användning av hypoton buffert kan återge atomkärnor sköra, som diskuteras i avsnittet senare.
Vi jämförde homogenisering effektiviteten av kväve kavitation med andra gemensamma fysiska störningar metoder. Lika mängder Jurkat celler var upphängd i identiska hypoton homogenisering buffert och utsätts för olika störningar metoder. Det var påvisbar förlust av prover i Dounce homogenisering och kväve kavitation (i båda fallen ca 5-10% mindre volym samlas). Dock gav kväve kavitation högsta protein utvinning effektivitet; nålen passage och Dounce gav bara 60% så mycket protein (figur 3). Nyfiket, återvinning av vissa proteiner som bestäms av immunoblot inte visade en signifikant skillnad mellan de olika mekaniska störningar metoderna. Avkastningen av vissa perifera membranproteiner som hexokinas 1 och RAS var dock högre i prover som tillagas med kväve kavitation. Denna stöder det kväve kavitation kan vara optimal för homogenisering när du undersöker perifera membranproteiner. Återvinning av HDAC1 proteiner av kväve kavitation är jämförbar med andra metoder, vilket tyder på att kärnorna förblir intakt i alla förhållanden. Data i figur 3 visar således att kväve kavitation erbjuder överlägsen homogenisering resultat.
Nästa, vi jämfört homogenisering effektivitet mellan hypoton buffert och samma bufferten men gjort isoton med sackaros eller natriumklorid (figur 4). Liknande mängder protein återvanns från Jurkat celler homogeniseras i hypoton buffert kontra NaCl isoton bufferten efter kavitation vid 350 psi. Däremot återfanns mindre protein i PNS celler störd i buffert görs isoton med sackaros. De flesta enskilda proteiner granskas av immunoblot passar detta mönster. Ett undantag var fibrillarin som var relativt berikad i PNS genereras i isoton buffert.
Att avgöra om våra protokoll kan användas för att undersöka partitionering av perifera membranproteiner mellan lösliga och membran fraktioner, Vi jämförde partitionering mönster mellan flagga-taggade de nationella Regleringsmyndigheterna vildtyp och dess prenylation-brist mutant, () C186S (Se figur 5). Vid steady state var var den vilda typen de nationella Regleringsmyndigheterna närvarande i både cytosol och membran, liknar mest perifera membranproteiner, även om portion återvinns i lösliga fraktionen är större än för andra RAS proteiner14. När de nationella Regleringsmyndigheterna berövas sin pryl modifiering, det förlorar förmågan att associera med membran och blir helt cytosoliska. De beräknade partitionering mönster av de nationella Regleringsmyndigheterna bekräftat att våra protokoll är ett pålitligt alternativ att studera dynamiken i delningen av perifera membranproteiner mellan cytosol och membran.
Figur 1: flödesschema sammanfattar steg 2 (blå), steg 3 (röd) och 4 (gul) i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Protein uppdelning mellan de cytosoliska och membran fraktionerna. HEK-293, NIH-3T3 och Jurkat celler utsattes för kväve kavitation (~ 350 psi för 20 min, upphängd i hypoton homogenisering buffert) och ultracentrifugering (~ 350 000 x g för 1 h) som beskrivs i protokollet. Endogen proteinnivåer i olika fraktioner analyserades av immunoblot. PNS: Receptorbindning cancer antigenet uttrycks på SiSo celler (RCAS), nukleära supernatanten, S: supernatanten, P: pellet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförelse av olika mekaniska störningar tekniker. Motsvarande mängd Jurkat celler var upphängd i hypoton buffert och utsatts för frysning-tining (3 cykler), nål passage (5 pass, genom 28G½ nål), Dounce homogenisering (15 passerar, Kontes 2 mL Dounce röret med en vävnad grind mortelstöt, clearance av 0,01-0,06 mm) eller kväve kavitation (~ 350 psi för 20 min). Relativa nivåer av endogena proteiner i PNS analyserades av immunoblot för varje metod. Totalprotein koncentrationer av PNS kvantifierades genom BCA assay och normaliserade till värdet av PNS utarbetats av kväve kavitation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av hypoton och isoton buffertar används under kväve kavitation. Motsvarande belopp av Jurkat celler inställdes i hypoton buffert eller hypoton buffert kompletteras med 8,5% sackaros eller 150 mM NaCl och utsättas för kväve kavitation (~ 350 psi för 20 min). Relativa nivåer av endogena proteiner i PNS analyserades av immunoblot för varje buffert. Totalprotein koncentrationer av PNS var kvantifieras enligt BCA assay och normaliserade till värdet av PNS beredd i hypoton buffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Farnesylated NRAS mellanväggar till både P och S fraktioner. HEK-293 celler var övergående transfekterade med plasmider styra uttrycket av flagg-taggade de nationella Regleringsmyndigheterna vildtyp eller C186S mutant. Protein partitionering framfördes som beskrivs i figur 2 och de angivna proteinnivåerna analyserades av immunoblot. Reproducerad med tillstånd (Zhou, M et al., 2016. Ursprungligen publicerad i Journal of Cell Biology. https://Doi.org/10.1083/JCB.201604061). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelarna med kväve kavitation över andra metoder för mekaniska störningar är mångfaldiga. Kanske är mest betydande fördelen dess förmåga att skonsamt men effektivt homogenisera exemplar. Dekompression kyler prover istället för att generera lokala värme skador fysikaliska principer som ultraljud och friktion/klippning baserade teknik. Kavitation är också extremt effektiva på störa plasmamembranet. Eftersom kväve bubblor genereras inom varje enskild cell vid dekompression, kavitation processen begränsas mindre Cellstorlek, prova storlek eller prova koncentration. Det erbjuder därför ytterligare fördelar över clearance-baserade Dounce eller nål passage homogenisering. Kväve kavitation erbjuder också mer konsekventa resultat som samma störande kraft som tillämpas enhetligt i hela provet kan återskapas med samma tryck. Dessutom, varje cell endast upplevelser störningar processen för en enda gång och subcellulära komponenter, därför utsätts inte ständigt för variabel störande krafter. Detta begränsar tingsliga fragmenteringen av organeller. Oro för oxidation av labil cellulära komponenter som orsakas av störningar mildras också, eftersom kväve används för att mätta cellsuspensionen och är fri från extra syrgas. De begränsade fysiska och kemiska påfrestningarna som införts av kväve kavitation gör det en idealisk teknik att studera labila enzymer och bräckliga organeller och reproducerbarheten för homogenisering tekniken är väl lämpad för kvantifiering.
Kväve kavitation erbjuder också stor flexibilitet när det gäller provstorlek, sammansättningen av homogenisering buffertar och graden av organell integritet. För att skala upp homogenisering, behöver man helt enkelt distribuera tryckkärl av större kapacitet, utan att offra hastighet, bekvämlighet och effektivitet av dekompression. Någon homogenisering buffert kan användas för kväve kavitation; buffert val kan skräddarsys för kompatibilitet med kraven i varje experiment. Man kan utforma en homogenisering buffert som matchar den intracellulära vätskan (t.ex., hög kalium och låg natrium) att minimera förändringar i organeller. Exempelvis har vi utvecklat en ”avkoppling” buffert som minimerar ex vivo aktin polymerisation och därmed hjälper till att samla intakt cytoplasmiska blåsor från granulocyter5. Osmotisk och Joniska funktioner i bufferten kan också ändras för att styra graden av cell homogenisering. Dessutom kan aggressivitet i cellulära störning styras genom att justera kväve trycket. Måttligt tryck minskar störande kraft att bevara atomkärnor, mitokondrier och andra organeller i en intakt stat, medan högtryck stör dessa organeller. Brock et al. rapporterat framgång med störningar av råtta basofila leukemi celler samtidigt som de flesta kärnor intakt vid 350 psi med hypoton buffert10, som utgör grunden för kväve trycket används i vårt nuvarande protokoll.
Begränsningar av kväve kavitation inkluderar det faktum att homogenisering är enhetliga i hela proverna och olika membranstrukturer kan ge blåsor i liknande storlekar; Detta kan komplicera ytterligare separation av plasmamembranet, smidig mikrosomer, endosomes och Golgi membran genom kurs-zonal täthet lutning centrifugering. Ett annat bekymmer är att organeller blir relativt bräckliga efter homogenisering på grund av bristning inifrån. Alltså kräver den här metoden noggrann optimering för att förhindra organell brott i efterföljande manipulationer. Vi syftar till att ta itu med några av dessa frågor i denna studie.
Separation av cytosoliska och membran fraktioner genom centrifugering har undersökts i begränsad rapporter beskriver en uppdelning av proteinet fraktioner med en handfull av protein markörer15,16. Vår metod genereras en rå separation av lösliga och membran-bundna proteiner och innebär inte isolering av särskilda organeller. Ändå är det fortfarande en giltig oro att de homogen blåsor av olika membran produceras av kavitation kan påverka effektiviteten av separation av ultracentrifugering. Vi lade fram en omfattande undersökning av immunoblots av isoleringen och partitionering av gemensamma subcellulär organeller efter fraktionering med våra protokoll. Som förväntat, rent cytosoliska proteiner som RhoGDI är uteslutande i lösliga fraktionen och transmembrana proteiner på plasmamembranet (PM) till exempel EGFR och Na+k+ ATPas, återfanns endast i pelleten. Transmembrana proteiner på organeller såsom ER, Golgi, mitokondrier och lysosomer återfanns också i pelleten, bekräftar att integrerad membranproteiner från olika membran och organeller framgångsrikt kan hållas åtskilda från lösliga proteiner med vår metod. Denna grundläggande validering är avgörande för ytterligare analys av perifera membranproteiner, vilket är det huvudsakliga syftet med detta protokoll.
De flesta av de perifera membranproteiner finns i båda de cytosoliska och membran fraktionerna. Men detta är ofta en sann bild av deras localization, det kan i vissa fall representerar tingsliga omfördelning av dessa proteiner från cytoplasmiska ytan av membran till den lösliga fraktionen under homogenisering, eftersom den styrkan av deras förening med membran är inte lika stark som för integrerad membranproteiner. Om kväve kavitation minimerar potentiella omfördelning genom att utsätta celler till en engångsavgift, mild störning, bör man vara uppmärksam på sådana artefakter av biokemiska fraktionering, och fokus på förändringar i delningen av proteiner mellan cytosoliskt och membran fraktioner över försöksbetingelser. Undersökning av perifera membranproteiner i olika skeden av endosomal mognad är dock möjliga med denna metod. EEA1, en Rab5-effektor som medierar dockning av clathrin-belagda blåsor till den tidiga endosomes, lokaliserar på cytoplasmiska ytan av tidig endosomes och återfanns främst i pellet fraktionen. Sen-endosome-relaterade Rab7 och Rab9 proteiner är också i pellet fraktionen. Dock återstår det en märkbar mängd Rab7/9 i cytosolen. Eftersom RabGDI är kunna interagera med prenylated Rabs och återge dessa annars olösliga proteiner cytosoliska, tenderar Rab proteiner att vara mer cytosoliska än andra endosome-relaterade perifera membranproteiner.
Att karakterisera den kärn- och organell integriteten med homogenisering av kväve kavitation, vi immunoblotted isolerade fraktioner för både luminala och cytoplasmiska fack. I denna analys är calregulin fullt ut i den lösliga fraktionen, visar att ER störs till formuläret mikrosomer och därmed läcker luminala innehåll. Med tanke på att en hälften av det sammanlagda området av membranet i en eukaryot cell omsluter de labyrintiska utrymmena av ER, det är förvånande att dess omfattande nätverk av sac-liknande eller tubulär struktur inte förbli intakt under utbyggnaden av kväve bubblor. Däremot, visar vår analys av mitokondriernas integritet efter kavitation tydlig beroende på celltyp, som vi observerade F1-ATPas, ett protein som är perifert kopplad till det inre membranet av mitokondrier, i cytosoliskt fraktionen i varierande grad (~ 35% för HEK-293 och Jurkat, 2% för NIH-3T3). Detta indikerar att kväve kavitation vid 350 psi med hypoton buffert garanterar inte mitokondriernas integritet. Andra har faktiskt rapporterat att bevara mitokondrier genom kavitation bör utföras vid tryck lägre än 150 psi17. Vi hittade däremot att katalas kvar i lumen av peroxisomes. Spännande, kan nukleära proteiner observeras i PNS och pellet fraktioner. Specifikt, HDAC1, en Histon histondeacetylas närvarande under hela nukleoplasman, är frånvarande i lösliga fraktionen, som anger att kärnkraft integritet inte äventyras. Detta tyder på att kärn kuvertet inte är spruckit av kavitation, som man skulle förvänta sig utsättning av HDAC1 i solubLe fraktion i scenariot. Det är fortfarande sannolikt att atomkärnor inte helt tas bort under processen för PNS förberedelse, och proteinet kvarstår i pelleten efter ultracentrifugering. Denna sannolikhet stöds ytterligare av det faktum att inget DNA läckage upptäcks i lösliga fraktionen. Vi avsluta, därför att använda hypoton homogenisering buffert under kavitation vid ~ 350 psi med tillägg av Mg2 + förmår bevara nukleära integritet i flera cellinjer.
Våra resultat visar också att ribosomerna samlar in helt i membran pellet fraktionen, vilket tyder på att även fri ribosomer i cytoplasman som är obundna till ER membranen kan vara helt sedimenterade i en icke-sackaros-kudde buffert efter centrifugering vid 350 000 x g för 1 h. likaså identifiering av proteinet autofagi-relaterade 12 (Atg12)-Atg5 konjugat som markör för autophagosomes, avslöjar strikt segregering att pelleten fraktioner. Dess närvaro i cytosolen kan orsakas av det faktum att kovalent-fastsättning av Atg12 och Atg5 föregår autophagosomes bildning. Cytoskeletal proteiner är svårt att bedöma på grund av ex vivo polymerisation. Detta fenomen kan minimeras med en avkoppling buffert men i protokollet som beskrivs här, tubulin är sannolikt polymeriserat ex vivo vid kelering av kalcium 18. I våra förberedelser finns tubulin i pelleten tyder på polymerisation medan aktin finns i både P och S fraktioner.
För att karakterisera potentiella fördelar med kväve kavitation i homogenisering effektivitet, igenom vi några vanliga tekniker för mekaniska störningar. Metoder som optimerats för vävnadsprover såsom mixer eller murbruk/mortel utvärderades inte. Ultraljudsbehandling uteslöts också eftersom det är svårt att störa ytan membranet samtidigt som de inre organeller intakt. Vår analys fokuserade på följande metoder: frysning-tining, nål passage och Dounce homogenisering, eftersom de är lätta att utföra och kräver inte särskild utrustning såsom en kullager Homogenisatorer. Jurkat celler har använts i denna analys på grund av sin storlek, vilket gör dem svåra att homogenisera effektivt med traditionella flytande klippning tekniker som är beroende av clearance, såsom nål passage och Dounce. Bedömas av koncentrationen av det totala proteinet återhämtat sig, hittade vi att cell-storlek oberoende störningar metoder såsom kväve kavitation och frysning-tining verkligen visar överlägsen effektivitet av protein utvinning. Liknande analys med celler av större storlekar visade mindre skillnader i homogenisering effektivitetsvinster, även kväve kavitation är fortfarande överlägsen alternativa fysiska metoder testade (inga data anges).
Många cytosoliska, endosomal och cytoskelettet proteiner återfanns effektivt med alla testade metoder. Däremot återfanns optimalt proteiner på ER och Golgi använder kväve kavitation. Något lägre avkastningen av F1-ATPas i kväve kavitation i förhållande till de andra metoderna kan återspegla det faktum att mitokondrierna är mer sannolikt att förbli intakt under kavitation och därför mer effektivt bort i låg hastighet spin för att generera PNS. Observationen att hexokinas 1, en perifer membranprotein hittade både i cytosolen och förknippas med det yttre mitokondriella membranet, uppfört på motsatt sätt i förhållande till F1-ATPas sannolikt återspeglar labilitet i sammanslutningen av hexokinas 1 i förhållande till F1-ATPas, som är binds inuti mitokondrierna. Ännu viktigare, även om kan störa celler med jämförbara effektivitetsvinster, gav alternativa mekaniska störningar metoder relativt dålig återhämtning av vissa perifera membranproteiner (hexokinas 1 och RAS). Kavitation är alltså vår homogenisering teknik med val i syfte att undersöka delningen av perifera membranproteiner. Eftersom Dounce homogenisering är ofta används för att förbereda intakt atomkärnor, använde vi Dounce som ett riktmärke för att utvärdera nukleära integritet över andra mekaniska störningar metoder. I vår analys bekräfta liknande nivåer av återvinning av HDAC1 proteiner att atomkärnor förblir intakta i Jurkat homogenates utarbetats av kväve kavitation vid ~ 350 psi med hypoton buffert.
Det var uppenbart att den homogenisering buffert används under kväve kavitation kan påverka avbrott effektivitet och organell integritet. Även sammansättningen av homogenisering buffert bör optimeras till kraven på den avsedda användningen, är det värt att notera att forskare som utför kväve dekompression av djurvävnader använder buffert med ett lågt osmotiskt tryck för att extrahera kärn innehållet. Hunter och Commerford visade atomkärnor svullnad och brista när lösningarna var utspädd och atomkärnor bevarande när du använder isoton lösningar7 (som kan uppnås genom att lägga till oorganiska salter såsom natriumklorid eller organiska föroreningar såsom sackaros eller glycerol). Standard isoton bufferten används för att isolera subcellulär organeller än kärnor från däggdjursceller är 0,25 M sackaros som innehåller 1 mM EDTA och buffras med Tris, HEPES eller Tricine vid pH 7,0-7,6. Men inte alla kultur celler kan vara effektivt homogeniseras i en av isoton buffertar. Hypoton buffert (vanligtvis 10 mM Tris, HEPES, etc.) används ofta för att ge nödvändiga osmotisk stress till vissa celltyper att uppnå fullständig homogenisering. Men som tidigare nämnts, tenderar hypoton buffertar att återge atomkärnor sköra och benägna till läckage av DNA när EDTA ingår. För att främja kärnkraft integritet, ersätter vi EDTA med KCl och låga koncentrationer av divalenta katjoner såsom MgCl2 eller MgSO4. Mg2 + föredras oftast över Ca2 + eftersom de senare kan aktivera vissa phospholipases och proteaser och hämma RNA-polymeras. När kavitation är klar, kan EDTA eller EGTA läggas tillbaka till homogenates till kelat cationen, om krävs för att hämma metalloproteaser.
Jurkat celler visar förhållandet för relativt stora nucleus-till-cytoplasman, vilket gör dem ett perfekt cellinje att studera nukleära integritet. Ökningen av homogenisering effektivitet med hjälp av hypoton buffert är minimal när jämförande till isoton buffert kompletteras med NaCl. Dock återvinner kavitation i en isotonisk buffert kompletteras med sackaros cirka hälften de proteiner som utvunnits med hjälp av en hypoton buffert motsvarighet. Detta är sannolikt inte ett direkt resultat av isotonicity och skillnaden mellan använder NaCl och använder sackaros för att uppnå isotonicity kräver ytterligare utredning. En möjlig förklaring är att salt stör elektrostatiska interaktioner mellan proteiner medan sackaros inte. Således även vid den samma tonicity har NaCl en verksamhet som är relevant för protein utvinning som sackaros saknar. WITH hänsyn till nukleära bevara, fann vi ökad fibrillarin proteiner återhämtat sig med isoton buffertar, trots isoton buffertar teoretiskt vara mer skyddande av atomkärnor. Den mitokondriella fraktionen extraherades nyfiket, mer effektivt med isoton buffert kompletteras med NaCl, vilket tyder på att låg salt villkor kan vara suboptimal för mitokondrierna extraktion. Med tanke på kavitation med hypoton buffert uppnår den bästa balansen mellan homogenisering effektivitet och nukleära integritet, blir hypoton bufferten bufferten av val i vårt protokoll av kavitation. Men försiktighet vi läsarna att ingen buffert är en garanti för optimal homogenisering resultat. Våra protokoll bör fungera som en mall för optimering och pilot testning med önskad buffertar, cellinjer av intresse och andra variabler (tryck, buffert sammansättning, etc.) måste fastställas för bästa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av GM055279, CA116034 och CA163489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
References
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
