Summary
Hier presenteren we protocollen voor wasmiddel-vrije homogenisering van gekweekte zoogdiercellen gebaseerd op stikstof cavitatie en latere scheiding van cytosolische en membraan-gebonden eiwitten door ultracentrifugatie. Deze methode is ideaal voor het toezicht op de partitionering van perifere membraaneiwitten tussen oplosbare en membraan breuken.
Abstract
Gekweekte cellen zijn nuttig voor het bestuderen van de subcellular verdeling van eiwitten, met inbegrip van perifere membraaneiwitten. Genetisch gecodeerd fluorescently tagged eiwitten hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van eiwit subcellular distributie. Het is echter moeilijk te kwantificeren van de verdeling met fluorescent microscopie, vooral wanneer de eiwitten zijn deels cytosolische. Bovendien is het vaak belangrijk om te studeren van endogene eiwitten. Biochemisch onderzoek zoals immunoblots blijven de gouden standaard voor de kwantificering van eiwit verdeling na subcellular fractionering. Hoewel er commerciële kits die gericht zijn zijn op het isoleren van cytosolische of bepaalde fracties membraan, zijn de meeste van deze kits gebaseerd op extractie met detergentia die mogelijk niet geschikt voor de studie van perifere membraaneiwitten die gemakkelijk membranen worden uitgepakt. Hier presenteren we een wasmiddel-gratis protocol voor cellulaire homogenisering door stikstof cavitatie en latere scheiding van cytosolische en membraan-gebonden eiwitten door ultracentrifugatie. Wij bevestigen de scheiding van subcellular organellen in oplosbare en pellet fracties over de verschillende soorten cellen, en vergelijk eiwit extractie onder verschillende gemeenschappelijke mechanische homogenisering wasmiddel gebaseerde methoden. Onder de verschillende voordelen van stikstof is cavitatie de superieure efficiëntie van verstoring van de cellulaire met minimale fysische en chemische schade aan gevoelige organellen. Gecombineerd met ultracentrifugatie, stikstof cavitatie is een uitstekende methode om te onderzoeken van de verschuiving van perifere membraaneiwitten tussen cytosolische en membraan breuken.
Introduction
Cellulaire eiwitten kunnen worden onderverdeeld in twee klassen: die membranen en die niet zijn gekoppeld. Non-membraan geassocieerde eiwitten worden aangetroffen in het cytosol, nucleoplasm en lumina van organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER). Er zijn twee klassen van membraan-geassocieerde eiwitten, integraal en perifere. Integraal membraaneiwitten zijn ook bekend als transmembraan eiwitten, omdat een of meer segmenten van de polypeptide keten omvat het membraan, meestal als een α-helix samengesteld uit hydrofobe aminozuren. Transmembraan eiwitten zijn co-translationally ingevoegd membranen in de loop van hun biosynthese en zo geconfigureerd blijven totdat zij zijn catabolized. Perifere membraaneiwitten zijn subsidiair naar membranen, meestal als gevolg van posttranslationele wijziging met hydrofobe moleculen zoals lipiden gereden. In tegenstelling tot integraal membraaneiwitten, de vereniging van perifere membraaneiwitten met cellulaire membranen is omkeerbaar en kan worden geregeld. Vele perifere membraan eiwitten functie in signaalroutes en gereglementeerde vereniging met een membraan is een mechanisme voor activeren of remming van een traject. Een voorbeeld van een signalering molecuul thats een perifere membraan eiwit is de kleine GTPase, RAS. Na een reeks van posttranslationele modificaties die wijziging met een lipide farnesyl, de gewijzigde C-terminus van een volwassen RAS-eiwit wordt ingevoegd in de cytoplasmatische bijsluiter van het cellulaire membraan. Het plasma-membraan is met name waar het RAS zijn downstream effector RAF1 bezighoudt. Om te voorkomen dat een constitutief activering van mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) traject, zijn meerdere niveaus van controle van RAS. Naast rendering RAS inactief door hydrolyseerd GTP in BBP, kan actieve RAS ook worden gelost van het plasma-membraan door wijzigingen of interacties met solubilizing factoren om te remmen signalering. Hoewel fluorescerende levende imaging cel biologen de gelegenheid biedt te observeren de subcellular localisatie van fluorescente proteïne-gelabeld perifere membraan eiwitten1, blijft er een kritische noodzaak om te evalueren van de membraan vereniging van endogene eiwitten semi-kwantitatief met eenvoudige biochemische benaderingen.
De juiste biochemische evaluatie van eiwit verdeling tussen membraan en oplosbare breuken is kritisch afhankelijk van twee factoren: cellulaire homogenisering en efficiënte scheiding van membraan en oplosbare breuken. Hoewel sommige protocollen, met inbegrip van de meest gebruikte gecommercialiseerd kits, is afhankelijk van wasmiddel gebaseerde cel homogenisering, kunnen deze methoden analyse verduisteren door winning van membraaneiwitten in oplosbare fase2. Dienovereenkomstig, niet-wasmiddel op basis, mechanische methoden van verstoring van de cel schonere resultaten opleveren. Er zijn verschillende methoden van mechanische verstoring van cellen gekweekt in cultuur of geoogst van bloed of organen. Het gaat hierbij om Dounce homogenisering, verstoring van de fijne naald, kogellager homogenisering, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie. Hier wij stikstof cavitatie te evalueren en te vergelijken met andere methoden. Stikstof cavitatie is afhankelijk van stikstof, dat wordt ontbonden in het cytoplasma van de cellen onder hoge druk. Na evenwichtsinstelling, wordt de celsuspensie abrupt blootgesteld aan atmosferische druk zodanig dat stikstof belletjes worden gevormd in het cytoplasma die traan open de cel als gevolg van hun bruisen. Als de druk voldoende hoog is, stikstof bruisen de kern3 kan verstoren en membraan gebonden organellen zoals lysosomen4. Echter, als de druk laag genoeg wordt gehouden, zal de decompressie verstoren het plasmamembraan en ER maar niet andere organellen, waardoor het morsen van zowel cytosol en intact cytoplasmatische organellen in het homogenaat die de cavitate5is aangewezen. Om deze reden is stikstof cavitatie de methode van keuze voor het isoleren van organellen zoals lysosomen- en mitochondriën.
Het is echter ook een uitstekende manier voor te bereiden op een homogenaat die gemakkelijk kan worden gescheiden in membraan en oplosbare breuken. Het drukvat (voortaan "de bom" genoemd) gebruikt tijdens cavitatie bestaat uit een dikke roestvast stalen behuizing die hoge druk, met een inham voor levering van de stikstofgas uit een tank en een retourzijde met een verstelbare spoelafsluiter doorstaat.
Stikstof cavitatie is gebruikt voor de cel homogenisering sinds de jaren 1960-6. In 1961 vestigde Hunter en Commerfold7 stikstof Cavitatie als een haalbare optie voor verstoring van de zoogdieren weefsel. Sindsdien onderzoekers hebben de techniek om de verschillende cellen en weefsels met succes, en aangepast stikstof cavitatie is uitgegroeid tot een nietje in meerdere toepassingen, waaronder membraan voorbereiding8,9, kernen en organel voorbereiding10,11, en onstabiele biochemische extractie. Op dit moment cel biologen vaker andere methoden gebruiken van cel homogenisering omdat de voordelen van stikstof homogenisering hebben niet veel geadverteerd, stikstof bommen duur zijn en er is een misvatting dat een relatief groot aantal cellen Vereist. Protocollen voor stikstof cavitatie tot cel-vrije homogenates met intact kernen niet zijn gepubliceerd, en in de meest gepubliceerde evaluaties volumes van 20 mL celsuspensie werden gebruikt. Aan te passen deze klassieke techniek te passen aan de huidige eisen van het werken met kleinschalige monsters, presenteren we een gewijzigde protocol van stikstof cavitatie speciaal ontworpen voor gekweekte cellen. Na stikstof cavitatie, het homogenaat wordt gescheiden in oplosbare (S) en membraan (P) breuken door differentiële centrifugeren, eerst met een lage snelheid spin kernen en ongebroken cellen te verwijderen, en vervolgens met een snelle spin (> 100.000 x g) om te scheiden membranen van de oplosbare fractie. Wij de efficiëntie van de scheiding met immunoblots analyseren en vergelijken van stikstof cavitatie met andere verstoring van de mechanische technieken. We onderzoeken ook de osmotische werking van homogenisering buffer tijdens stikstof cavitatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. buffer en apparatuur preparaten
- Chill 45 mL cel verstoring bommen, 15 mL buizen en ultracentrifugatie buizen bij 4 ° C.
- Voorbereiden en chill homogenisering buffer per 2 x 10 7 cellen bij 4 ° C. toevoegen een protease inhibitor tablet vlak voor gebruik 25 mL.
Opmerking: Homogenisering buffers bevatten doorgaans KCl in plaats van NaCl beter weerspiegelen intracellulaire zout samenstelling. Homogenisering buffer die wordt gebruikt in dit protocol bestaat uit 10 mM HEPES met een pH van 7,4, 10 mM KCl en 1,5 mM MgCl 2 (hierna te noemen hypotone homogenisering buffer). Meeste buffers kunnen worden aangepast voor stikstof cavitatie (Zie discussie). - Voorbereiden en chill 6 mL 1 x Phosphate-Buffered zoutoplossing (PBS) buffer per monster bij 4 ° C. toevoegen protease inhibitor tabletten vóór gebruik vers.
Opmerking: PBS buffer die wordt gebruikt in dit protocol bestaat uit 10 mM nb 2 HPO 4 met een pH van 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl en 2,7 mM KCl. - Voorbereiden en chill solubilisatie buffer per monster bij 4 ° C. toevoegen een protease inhibitor tablet vlak voor gebruik 4 mL.
Opmerking: Solubilisatie buffer die wordt gebruikt in dit protocol is 1 x Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer, die uit 25 mM Tris op pH 7.4, 150 mM NaCl, SDS 0,1% en 0,5% natrium deoxycholate 1 bestaat % NP-40. 4.6 zienoot.
2. Opruiming Cell
- Grow 2 x 10 7 -10 x 10 9 weefselkweek cellen met de aanbevolen voedingsbodems voor het celtype. Typisch, een 15-cm schotel levert 2 x 10 7 HEK-293 cellen gekweekt in DMEM op 90% confluentie ( Figuur 1).
- Verwijderen van het groeimedium door vacuüm.
- Voor Adherente cellen, plaatst u de cultuur gerechten op ijs, wassen van de cellen rechtstreeks in de cultuur-gerechten zachtjes met gekoeld homogenisering buffer tweemaal (10 mL buffer per 15 cm schotel per wasbeurt) en de cellen met een grote cel schraper in een passende omvang van de oogst homogenisering buffer; Voor schorsing cellen, verzamelen de cel pellet in gekoeld homogenisering buffer tweemaal (10 mL buffer per 50 mL cultuur per wasbeurt) met 500 x g spin bij 4 ° C gedurende 5 minuten wassen en resuspendeer de pellet gewassen cel in een passende omvang van homogenisering buffer op ijs.
Opmerking: het volume moet worden gebaseerd op de vereisten voor eiwitconcentratie in de voorgenomen experimenten, evenals het volume van de minimale/maximale toegestaan in de cel verstoring bom. Een algemene richtsnoer is 2-10 x 10 7 cellen/mL, of ongeveer 10 volumes van de cel pellet. Dit protocol is geoptimaliseerd voor drie 15-cm schotels van HEK-293 cellen in 2 mL zuiver homogenisering buffer.
3. Stikstof cavitatie
- de celsuspensie overdracht aan een schone en gekoelde bom in een ijsbad op een roer plaat.
Let op: De bom heeft hoge druk, lage temperatuur, stikstofgas – dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen . - Een micro magnetische roer staaf van de plaats binnen de bom en zet op het roer plaat om schorsing homogeniteit.
- Voegen een protease inhibitor tablet tot de schorsing en de bom per fabrikant te sluiten ' s instructie.
- Geleidelijk druk uitoefenen op de bom met een gastank stikstof per fabrikant ' s instructie tot de drukmeter bom leest 300 tot 600 psi. Sluit alle afsluiters en verbreken van de stikstof tank.
Opmerking: De vereiste druk kan variëren met het celtype. Hier hebben we uitgevoerd cavitatie bij 350 tot 400 psi voor HEK-293, NIH-3T3 en Jurkat cellen. - Wachten op 20 min om de stikstof te ontbinden en te bereiken evenwicht binnen de cellen.
- Verwijder overtollig water rond de spoelafsluiter met behulp van een doek handdoek. Open de spoelafsluiter zachtjes voor het bereiken van een dropwise versie van homogenaat en verzamelen in een tube pre gekoeld 15 mL.
Opmerking: In de buurt van het einde van de collectie zal er een spurt van homogenaat en gas zal ontstaan met een sissende geluid. Zorg ervoor dat het gas niet oorzaak eerder verzameld cavitate om te schieten uit de buis (vandaar het gebruik van 15 mL tubes in plaats van 1,5 mL buizen). Zodra de spurt begint, sluiten de spoelafsluiter en de stikstof ingangsafsluiter abrupt te depressurize de bom bereiken cavitatie van de resterende cellen in de bom te openen. Open de bom voor cavitate herstel en grondige reiniging.
Opmerking: De laatste cavitate moet een melkachtige uitstraling met schuim bovenop. Zachtjes roeren met een uiteinde van de pipet om het schuim te laten verdwijnen voordat centrifugeren.
Opmerking: Bestuderen de cavitate met fase contrast microscopie bepalen de homogenisering efficiëntie. Voeg een druppel 15 µL cavitate op het oppervlak van een microscopie dia en dek met een dekglaasje aan. Herhaal stap 3.4-3.6 alleen als teveel ongebroken cellen worden gedetecteerd met een 20 X doelstelling.
Opmerking: Als de homogenisering buffer bevat geen EDTA of EGTA, toevoegen aan de verzamelde cavitate op een eindconcentratie van 1 mM binnen 5 min na lozing.
4. Scheiding van Cytosolic en membraan breuken
- Centrifuge de cavitate bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot verwijderen ongebroken cellen en kernen.
Let op: Herhaal de centrifugeren stap totdat geen zichtbare pellet wordt geproduceerd en de Post nucleaire Supernatant (PNS) verzamelen terwijl het vermijden van het schuim drijvend op bovenkant. Opnieuw Centrifugeer het schuim om verder te verzamelen en combineren van PNS, indien nodig ( Figuur 1). - Verwerken de PNS desgewenst te verkrijgen van breuken van belang. Met het oog op scheiden cytosolische en membraan breuken, de PNS overbrengen in een buis ultracentrifuge en ultracentrifugatie desgewenst uit te voeren. Dit protocol is geoptimaliseerd voor een < 3,5 mL monster in de buis van een polycarbonaat ultracentrifuge en voor ultracentrifugatie bij 350.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Verzamelen het supernatant (de S-Fractie) met behulp van een precisiepipet 1 mL.
- Spoel zorgvuldig de pellet met 3 mL koude PBS zonder verstoring van het. Verwijderen van de PBS door vacuüm.
Opmerking: Als de besmetting van de membraan breuk door cytosolische eiwitten is een groter probleem dan het verlies van monster, resuspendeer de pellet in 3 mL koud PBS en re-ultracentrifuge zoals in stap 4.2. Verwijderen van de PBS door vacuüm. - Resuspendeer de pellet volledig in een juiste hoeveelheid wasmiddel-bevattende solubilisatie buffer van keuze. Om te bereiken cel gelijkwaardigheid, gebruiken dezelfde hoeveelheid buffer solubilisatie als de cytosolische breuk.
Opmerking: We raden aan 1 x RIPA buffer gebruiken als solubilisatie buffer voor efficiënte membraan eiwit extractie. Als geen downstream assay vereist voor membraan fractie is, gebruikt u 1 x laemmli monster buffer voor maximale membraan eiwit extractie.
Opmerking: We raden loskomen en de pellet in solubilisatie buffer overbrengen naar een schone buis op een buis rotator bij 4 ° C voor maximale membraan eiwit extractie.
Opmerking: Als de pellet te plakkerig (teveel lipiden) efficiënt worden verwijderd uit de the ultracentrifuge buis in solubilisatie buffer, wij stellen module voor bevriezing van de pellet in vloeibare stikstof en snel het loskomen van de pellet uit de ultracentrifuge buis met een mini metalen spatel, voordat de pellet ontdooit.
Opmerking: U kunt ook membraan pellets kunnen worden gewoon geresuspendeerde en niet ontbindend in een niet-wasmiddel-bevattende buffer te produceren een fractie P van membraan vesikel opschorting, in dat geval het centrifugeren stap in 4.6 niet vereist is. Dergelijke breuken P zijn nuttig bij het onderzoeken van functies zoals enzym-activiteiten die afhankelijk van de vereniging van de membraan zijn. - De schorsing van de volledig ontbindend pellet uit stap 4.5 bij 20.000 x g in een tafelblad centrifuge voor 10 min Centrifugeer bij 4 ° C. de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet 1 mL (de P-Fractie) verzamelen en negeren de pellet (onoplosbare lipiden).
- Uitvoeren van gewenste assays zoals het westelijke bevlekken met de cytosolische en/of membraan breuken, of ze bij-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont de partitionering van cellulaire eiwitten uit PNS in de oplosbare cytosolische fractie (S) of het membraan pellet breuk (P). Wij onderzochten drie representatieve cellijnen van verschillende celtypes: HEK-293 (epitheliale), NIH-3T3 (fibroblast) en Jurkat (lymfocyten). Rho Guanine dissociatie remmer (RhoGDI) en catie-onafhankelijke mannose-6-fosfaat receptor (CIMPR) werden gebruikt als positieve controles voor cytosolische en membraan breuken, respectievelijk. We bevestigden de efficiënte scheiding van het cytosol en membraan na stikstof cavitatie bij ~ 350 psi in hypotone buffer gevolgd door ultracentrifugatie bij 350.000 x g gedurende 1 h. De totale proteïne hersteld van de S en P breuken werden vervolgens geanalyseerd met markeringen voor de ER, Endosomen en lysosomes mitochondriën, Golgi en andere organellen. Alle transmembraan eiwitten aanwezig zijn in de membraan-fractie uitsluitend, met inbegrip van nb++ ATPase /K en epidermale groeifactor receptor (EGFR) uit het plasma-membraan, calnexin van ER, lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (LAMP1) van lysosomen, F0-ATPase van mitochondriën en Golgin 97 van de trans Golgi-netwerk. Zoals verwacht, veel perifere membraaneiwitten zijn losjes gekoppeld aan het membraan, zijn zowel in de cytosolische en membraan breuken zijhetelkinverschillende mate presenteren. Opmerkelijke voorbeelden zijn vroege endosome antigeen 1 (EEA1), Rab7/9 (late Endosomen) en hexokinase 1 (buitenste mitochondriën membraan). Dit toont het nut van deze techniek in de evaluatie van de membraan vereniging kracht van perifere eiwitten. Ons laboratorium heeft geprofiteerd van deze techniek cavitatie te onderzoeken van de status van de vereniging membraan van verschillende signalering moleculen5,12,13,14. Interessant, vonden we calregulin vrijwel uitsluitend in de oplosbare fractie, suggereren dat de microsomes gegenereerd op basis van ER-membranen hebben ook verstoord tijdens stikstof cavitatie en de eiwitten in het lumen ER worden vrijgegeven aan de oplosbare fractie. De integriteit van de mitochondriën na cavitatie is daarentegen afhankelijk van het celtype. We waargenomen F1-ATPase, een innerlijke mitochondriën perifere eiwitten, gedeeltelijk in de cytosolische fractie variërend van 2% voor NIH-3T3 cellen tot ~ 35% voor HEK-293 en Jurkat cellen. Dit betekent dat stikstof cavitatie bij 350 psi met hypotone buffer verzekert niet mitochondriale integriteit. Ondanks drie cycli van 500 x g draait de PNS genereren uit cavitate, werden niet alle kernen verwijderd. Histon deacetylase 1 (HDAC1) van nucleoplasm en fibrillarin van de nucleolus, bleken zowel in de PNS en de pellet. De aanwezigheid van HDAC1 in de pellet en niet in het supernatant suggereert dat de PNS is verontreinigd met kernen, in plaats van nucleaire verstoring tijdens cavitatie. Dit strookt met de rapporten die de bom aan 350 psi Drukbehandeling verlaat kernen intact10, hoewel het gebruik van hypotone buffer de kernen fragiel, maken kan zoals besproken in de sectie verderop.
We vergeleken de efficiëntie van de homogenisering van de stikstof cavitatie met die van andere gemeenschappelijke fysieke verstoring methoden. Gelijke hoeveelheden van Jurkat cellen werden opgeschort in identieke hypotone homogenisering buffer en onderworpen aan de verstoring van de verschillende methoden. Er was aantoonbaar verlies voor samples in Dounce homogenisering en stikstof cavitatie (in beide gevallen ongeveer 5-10% minder volume wordt verzameld). Nochtans, stikstof cavitatie gaf de hoogste eiwit extractie-efficiëntie; naald passage en Dounce leverde slechts 60% zo veel eiwit (Figuur 3). Vreemd genoeg, herstel van sommige eiwitten zoals bepaald door de immunoblot geen vertonen een significant verschil tussen de verschillende mechanische verstoring methoden. Het rendement van bepaalde perifere membraaneiwitten zoals hexokinase 1 en RAS was echter hoger in monsters bereid met stikstof cavitatie. Deze steunt die stikstof cavitatie kan worden optimaal voor homogenisering bij het onderzoeken van perifere membraaneiwitten. Herstel van HDAC1 eiwitten door stikstof cavitatie is vergelijkbaar met andere methoden, wat suggereert dat de kernen intact in alle omstandigheden blijven. Dus, de gegevens in Figuur 3 blijkt dat stikstof cavitatie biedt superieure homogenisering resultaten.
Vervolgens zijn we ten opzichte van de efficiëntie van de homogenisering tussen hypotone buffer en de dezelfde buffer maar maakte isotone met sacharose of natriumchloride (Figuur 4). Vergelijkbare hoeveelheden eiwit werden teruggevonden uit Jurkat cellen gehomogeniseerd in hypotone buffer versus NaCl isotone buffer na cavitatie bij 350 psi. Daarentegen werd minder eiwit teruggevonden in de PNS van cellen verstoord in buffer gemaakt isotone met sacharose. Meest individuele eiwitten door immunoblot onderzocht passen dit patroon. Een uitzondering was fibrillarin die relatief in de PNS gegenereerd in isotone buffer verrijkt werd.
Om te bepalen als ons protocol kan worden gebruikt om te onderzoeken compartimentering van de perifere membraaneiwitten tussen oplosbare en membraan breuken, vergeleken we patronen tussen NRI's vlag-gelabeld wild type en haar prenylation-deficiënte mutant, C186S (partitioneren Figuur 5). Steady-state was het wild type NRI's aanwezig in zowel cytosol en membranen, vergelijkbaar met de meest perifere membraaneiwitten, hoewel het gedeelte teruggevonden in de oplosbare fractie groter dan voor andere RAS eiwitten14 is. Wanneer de nationale regelgevende instanties is beroofd van haar prenyl-wijziging, het verliest de mogelijkheid om te koppelen met een membraan en wordt volledig cytosolische. De verwachte partitionering patronen van NRI's bevestigd dat ons protocol een betrouwbare optie is te bestuderen van de dynamiek van het partitioneren van perifere membraaneiwitten tussen cytosol en membranen.
Figuur 1: stroomdiagram samenvatten van stap 2 (blauw), stap 3 (rood) en 4 (geel) van het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: eiwit verdeling tussen de fracties cytosolische en membraan. HEK-293, NIH-3T3 en Jurkat cellen werden onderworpen aan stikstof cavitatie (~ 350 psi voor 20 min, geschorst in hypotone homogenisering buffer) en ultracentrifugatie (~ 350.000 x g voor 1 h) zoals beschreven in het protocol. Endogene eiwitniveaus in verschillende fracties werden geanalyseerd door immunoblot. PNS: Receptor-bindende kanker antigeen uitgedrukt op SiSo cellen (RCAS), nucleaire supernatant, S: supernatant, P: pellet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vergelijking van verschillende verstoring van de mechanische technieken. Equivalente hoeveelheid Jurkat cellen werden opgeschort in hypotone buffer en onderworpen aan bevriezen-ontdooien (3 cycli), passage (5 passeert, 28G½ naald), Dounce homogenisering (15 passeert, Kontes 2 mL Dounce buis met een weefsel grind stamper, Goedkeuringvande naald 0.01-0.06 mm) of stikstof cavitatie (~ 350 psi voor 20 min). Relatieve niveaus van endogene eiwitten in de PNS werden geanalyseerd door immunoblot voor elke methode. Totaal eiwit concentraties van PNS werden gekwantificeerd door BCA assay en genormaliseerd naar de waarde van de PNS bereid door stikstof cavitatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vergelijking van hypotone en isotone buffers gebruikt tijdens stikstof cavitatie. Gelijkwaardige hoeveelheid Jurkat cellen werden opgeschort in hypotone buffer of hypotone buffer aangevuld met 8,5% sacharose of 150 mM NaCl, en onderworpen aan stikstof cavitatie (~ 350 psi voor 20 min). Relatieve niveaus van endogene eiwitten in de PNS werden geanalyseerd door immunoblot voor elke buffer. Totaal eiwit concentraties van PNS werden gekwantificeerd door BCA assay en genormaliseerd naar de waarde van de PNS bereid in hypotone buffer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Farnesylated NRAS partities in zowel de P en S breuken. HEK-293 cellen werden Transient transfected met plasmiden regisseren van de expressie van vlag-gelabeld NRI's wild type of C186S mutant. Eiwit partitioneren werd uitgevoerd zoals beschreven in Figuur 2 en de aangegeven eiwitniveaus werden geanalyseerd door immunoblot. Gereproduceerd met toestemming (Zhou, M et al., 2016. Oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal van de biologie van de cel. https://Doi.org/10.1083/JCB.201604061). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voordelen van stikstof cavitatie boven andere methoden van mechanische storingen zijn spruitstuk. Misschien is het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid om voorzichtig nog efficiënt Meng exemplaren. De fysische principes van decompressie cools monsters in plaats van de veldgenerator lokale verwarming schade zoals ultrasone en wrijving/scheren technieken gebaseerd. Cavitatie is ook zeer efficiënt op het verstoren van het plasma-membraan. Omdat stikstof bubbels worden gegenereerd binnen elke afzonderlijke cel op decompressie, het proces van cavitatie is beperkt minder door de grootte van de cel, monstergrootte of genieten van de concentratie. Het biedt dus extra voordelen ten opzichte van goedkeuring gebaseerde Dounce of naald passage homogenisering. Stikstof cavitatie biedt ook meer consistente resultaten zoals de dezelfde vernietigende kracht die uniform wordt toegepast in de gehele van het monster kan worden gereproduceerd met dezelfde druk. Bovendien, elke cel alleen ervaringen de verstoring-proces voor één keer en subcellular componenten zijn derhalve niet voortdurend blootgesteld aan variabele ontwrichtende krachten. Dit beperkt de artefactual versnippering van organellen. Zorg voor oxidatie van onstabiele cellulaire componenten veroorzaakt door verstoring is ook beperkt, zoals stikstof wordt gebruikt om te verzadigen van de celsuspensie en is vrij van supplementaire zuurstof. De beperkte fysieke en chemische stress opgelegd door stikstof cavitatie maakt het een ideale techniek te studeren labile enzymen en fragiele organellen en de reproduceerbaarheid van deze homogenisering techniek is geschikt voor kwantificering.
Stikstof Cavitatie ook biedt aanzienlijke flexibiliteit wat betreft steekproefgrootte, de samenstelling van buffers van de homogenisering en de mate van organel integriteit. Als u wilt schalen van de homogenisering, moet men eenvoudig implementeren van drukvaten voor grotere capaciteiten, zonder de snelheid, het gemak of de efficiëntie van decompressie. Elke homogenisering buffer kan worden gebruikt voor stikstof cavitatie; keuze van de buffer kan worden aangepast voor compatibiliteit met de vereisten van elk experiment. Een kunt een homogenisering buffer die overeenkomt met de intracellulaire vloeistof (bijvoorbeeld, hoge kalium en natriumarm) tot een minimum beperken van wijzigingen in organellen ontwerpen. Bijvoorbeeld, ontwikkelen we een "ontspanning" buffer die ex vivo actine polymerisatie minimaliseert en daardoor helpt bij het verzamelen van intact cytoplasmatische blaasjes van granulocyten5. De osmotische en Ionische kenmerken van de buffer kunnen ook worden gewijzigd om te bepalen van de mate van homogenisering van de cel. De agressiviteit van de verstoring van de cellulaire kan bovendien worden gecontroleerd door de druk van de stikstof aan te passen. Matige druk vermindert de ontwrichtende kracht voor het behoud van de kernen, mitochondriën en andere organellen in een onbeschadigde toestand, terwijl hogedruk deze organellen verstoort. Brock et al. succes met verstoring van Rat basofiele leukemie cellen met behoud van de meeste kernen intact op 350 psi met hypotone buffer10, die de basis van druk van de stikstof gebruikt in onze huidige protocol vormt gemeld.
Beperkingen van stikstof cavitatie omvatten het feit dat homogenisering uniform in de gehele van de monsters en verschillende membraan structuren kunnen blaasjes vergelijkbare capaciteit; Dit kan verdere scheiding van het plasmamembraan, soepele microsomes, Endosomen en Golgi membranen bemoeilijken door tarief-zonale dichtheid kleurovergang centrifugeren. Een andere zorg is dat de organellen relatief kwetsbaar na homogenisatie als gevolg van de breuk van binnenuit geworden. Dus, deze methode vereist zorgvuldige optimalisatie te voorkomen organel breuk in latere manipulaties. We gericht op enkele van deze kwesties in deze studie.
Scheiding van cytosolische en membraan breuken door centrifugeren is onderzocht in beperkte verslagen waarin het partitioneren van eiwitfracties met een handvol eiwit markeringen15,16. Onze methode genereert een ruwe scheiding van oplosbare en membraan-gebonden eiwitten en geen isolatie van bepaalde organellen. Toch is het nog steeds een geldig zorg dat de homogene blaasjes van verschillende membranen geproduceerd door cavitatie kunnen van invloed zijn op de efficiëntie van de scheiding door ultracentrifugatie. We een uitgebreide enquête gepresenteerd door immunoblots van het isolement en de compartimentering van de gemeenschappelijke subcellular organellen na fractionering met ons protocol. Zoals verwacht, puur cytosolische eiwitten zoals RhoGDI zijn uitsluitend in de oplosbare fractie en transmembraan eiwitten op het plasma-membraan (PM) zoals EGFR en nb+/K+ ATPase, alleen in de pellet werden teruggevonden. Transmembraan eiwitten op organellen, zoals mitochondriën, Golgi, ER en Lysosomen werden ook teruggevonden in de pellet, bevestigen dat integraal membraaneiwitten van verschillende membranen en organellen met succes kunnen worden gescheiden van oplosbare eiwitten met onze methode. Deze fundamentele validatie is cruciaal voor de verdere analyse van perifere membraaneiwitten, die is het belangrijkste doel van dit protocol.
Allermeest naar de perifere membraaneiwitten bestaan in zowel de cytosolische en membraan breuken. Hoewel dit vaak een echte vertegenwoordiging van hun lokalisatie is, het kan in sommige gevallen vertegenwoordigen artefactual herverdeling van deze proteïnen van de cytoplasmatische oppervlak van membranen op de oplosbare fractie tijdens het proces van homogenisering, aangezien de kracht van hun associatie met membranen is niet zo sterk als die van integraal membraaneiwitten. Hoewel stikstof cavitatie minimaliseert de potentiële herverdeling door cellen aan een verstoring van de eenmalige, zachte bloot te leggen, moet men zich bewust van dergelijke artefacten van biochemische fractionering, en focus op de veranderingen in de partitionering van eiwitten tussen cytosolische en membraan fracties over experimentele omstandigheden. Niettemin is de behandeling van perifere membraaneiwitten in verschillende stadia van endosomal rijping mogelijk met deze methode. EEA1, een Rab5-effector die bemiddelt couperen van clathrin beklede blaasjes aan de vroege Endosomen, lokaliseert de cytoplasmatische oppervlak van vroege Endosomen en vooral in de pellet-Fractie werd teruggevonden. Laat-endosome-gerelateerde Rab7 en Rab9 eiwitten zijn ook in de pellet-Fractie. Er blijft echter een aanzienlijke hoeveelheid Rab7/9 in het cytosol. Want RabGDI is in staat om te communiceren met prenylated Rabs en maken deze anders onoplosbare eiwitten cytosolische, Rab eiwitten zijn vaak meer cytosolische dan andere endosome-gerelateerde perifere membraaneiwitten.
Te karakteriseren van de integriteit van het nucleaire en organel met homogenisering door stikstof cavitatie, wij immunoblotted de geïsoleerde breuken voor zowel de luminal als de cytoplasmatische compartimenten. In deze analyse, wordt de calregulin volledig gestort op de oplosbare fractie, waaruit blijkt dat ER aan formulier microsomes is verstoord en daardoor luminal inhoud lekken. Gezien dat men de helft van de totale oppervlakte van het membraan in een eukaryotische cel omsluit de labyrintische ruimten van de ER, het is niet verrassend dat haar uitgebreid netwerk van sac-achtige of buisvormige structuur niet tijdens de uitbreiding van stikstof bubbels intact blijven. Aan de andere kant, onze analyse van mitochondriale integriteit na cavitatie blijkt duidelijk afhankelijkheid van het celtype, zoals we F1 gezien-ATPase, een eiwit dat wordt ook geassocieerd met het binnenste membraan van de mitochondriën, in de cytosolische Fractie mindere mate (~ 35% voor HEK-293- en Jurkat, 2% voor NIH-3T3). Dit betekent dat stikstof cavitatie bij 350 psi met hypotone buffer garandeert niet mitochondriale integriteit. Inderdaad, anderen hebben gemeld dat voor het behoud van mitochondriën, cavitatie bij druk lager dan 150 psi17moet worden uitgevoerd. We vonden daarentegen dat katalase blijft in het lumen van de peroxisomen. Intrigerend, worden nucleaire eiwitten waargenomen in de PNS en pellet breuken. Specifiek, HDAC1, een histone deacetylase aanwezig in de nucleoplasm, ontbreekt in de oplosbare fractie, die aangeeft dat de nucleaire integriteit niet in gevaar komt. Dit suggereert dat de nucleaire envelop niet is gescheurd door cavitatie, zoals men dat de introductie van HDAC1 in de solub verwachten zouLe breuk in dat scenario. Het blijft waarschijnlijk kernen zijn niet volledig verwijderd tijdens het proces van voorbereiding van de PNS, waardoor het eiwit blijft in de pellet na ultracentrifugatie. Deze kans wordt verder ondersteund door het feit dat er geen lekkage van DNA wordt gedetecteerd in de oplosbare fractie. We sluiten, daarom, dat met behulp van hypotone homogenisering buffer tijdens cavitatie bij ~ 350 psi met de toevoeging van Mg2 + vermag nucleaire integriteit in meerdere cellijnen behouden blijft.
Onze resultaten tonen ook aan dat de ribosomen volledig in de membraan pellet fractie verzamelen, suggereren dat zelfs gratis ribosomen in het cytoplasma die niet-afhankelijke aan de ER-membranen kunnen volledig gesedimenteerd in een niet-sacharose-kussen buffer na centrifugeren bij 350.000 x g gedurende 1 h. nederbuigen, identificatie van de autophagy-gerelateerde eiwitten 12 (Atg12)-Atg5 geconjugeerde als een marker van autophagosomes, onthult strikte segregatie naar de pellet breuken. Haar aanwezigheid in het cytosol kan worden veroorzaakt door het feit dat de covalente-gehechtheid van Atg12 en Atg5 wordt voorafgegaan door de vorming van de autophagosomes. Cytoskeletal eiwitten zijn moeilijk te beoordelen wegens ex vivo polymerisatie. Dit fenomeen kan worden geminimaliseerd met een buffer van ontspanning, maar in het protocol beschreven hier, tubuline is waarschijnlijk gepolymeriseerde ex vivo op chelatie van calcium 18. In onze voorbereidingen is tubuline gevonden in de pellet suggereren polymerisatie overwegende dat actine is gevonden in zowel de P en S breuken.
We bezien karakteriseren de potentiële voordelen van stikstof cavitatie homogenisering efficiëntie, sommige gemeenschappelijke verstoring van de mechanische technieken. Methoden die zijn geoptimaliseerd voor weefselsteekproeven zoals blender of mortel/stamper waren niet geëvalueerd. Ultrasoonapparaat werd ook uitgesloten als het is moeilijk te verstoren de oppervlakte membraan terwijl de interne organellen intact. Onze analyse richtte zich op de volgende manieren: bevriezen-ontdooien, naald passage en homogenisering van de Dounce, zoals ze zijn makkelijk te presteren en vereisen geen speciale apparatuur, zoals een kogellager homogenizer. Jurkat cellen werden gebruikt in deze analyse vanwege het kleine formaat, waardoor ze moeilijk te homogeniseren efficiënt met traditionele vloeibare schuintrekken technieken die afhankelijk van goedkeuring, zoals naald passage en Dounce zijn. Beoordeeld door de concentratie van de totale proteïne hersteld, vonden we dat onafhankelijke verstoring van de celgrootte methoden zoals stikstof cavitatie en bevriezen-ontdooien inderdaad Toon superieure efficiëntie van eiwit extractie. Soortgelijke analyse met cellen van grotere maten geopenbaard kleinere verschillen in de efficiëntie van de homogenisering, hoewel stikstof cavitatie nog steeds superieur aan alternatieve fysieke methoden getest (gegevens niet worden weergegeven is).
Vele cytosolische, endosomal en cytoskelet eiwitten werden efficiënt teruggevorderd met alle beproefde methoden. Daarentegen zijn eiwitten op de ER en Golgi optimaal hersteld met behulp van stikstof cavitatie. De iets lagere opbrengst van F1-ATPase in stikstof cavitatie ten opzichte van de andere methoden kan bedenken dat mitochondriën meer kans zijn om tijdens het cavitatie intact blijven en derhalve meer efficiënt verwijderd in de trage spin gebruikt de PNS genereren. De observatie die hexokinase 1, een perifere membraan eiwit vond zowel in het cytosol en gekoppeld aan de mitochondriale buitenmembraan, gedragen op de tegenovergestelde manier ten opzichte van de F-1-ATPase waarschijnlijk weerspiegelt de labiliteit van de vereniging van hexokinase 1 ten opzichte van F1-ATPase, die binnen de mitochondria wordt afgezonderd. Nog belangrijker is, hoewel geschikt voor het verstoren van cellen met een vergelijkbare efficiëntie, gaf mechanische verstoring van de alternatieve methoden relatief arme herstel van bepaalde perifere membraaneiwitten (hexokinase 1 en RAS). Cavitatie is dus onze homogenisering techniek van keuze met het oog op het onderzoeken van de partitie van perifere membraaneiwitten. Omdat Dounce homogenisering wijd gebruikt wordt om intact kernen, we gewend Dounce als benchmark nucleaire integriteit over andere verstoring van de mechanische methoden te evalueren. In onze analyse bevestigen de vergelijkbare niveaus van terugwinning van HDAC1 eiwitten dat kernen in Jurkat homogenates bereid door stikstof cavitatie bij ~ 350 psi met hypotone buffer intact blijven.
Het was duidelijk dat de homogenisering buffer die wordt gebruikt tijdens de stikstof cavitatie de verstoring van de efficiëntie en organel integriteit aanzienlijk kan beïnvloeden. Hoewel de samenstelling van homogenisering buffer moet aan de eisen van de beoogde toepassing worden geoptimaliseerd, is het vermeldenswaard dat onderzoekers uitvoeren van stikstof decompressie van dierlijke weefsels buffer met een lage osmotische druk gebruiken uitpakken van nucleaire inhoud. Hunter en Commerford toonde kernen zwelling en breuk wanneer de oplossingen verdund waren, en kernen behoud bij gebruik van isotone oplossingen7 (die kan worden bereikt door het toe te voegen anorganische zouten zoals natrium chloride of organische opgeloste stoffen, zoals sacharose of glycerol). De standaard isotone buffer die wordt gebruikt voor het isoleren van subcellular organellen dan kernen van zoogdiercellen is 0,25 M sacharose met 1 mM EDTA en gebufferd met Tris, HEPES of Tricine bij pH 7.0-7,6. Maar niet alle cultuur cellen kunnen efficiënt worden gehomogeniseerd in één van de isotone buffers. Hypotone buffer (meestal 10 mM Tris, HEPES, etc.) wordt vaak gebruikt om de nodige osmotische stress geven bepaalde celtypen om volledige homogenisering. Echter, zoals eerder vermeld, hypotone buffers neiging om weer te geven van de kernen kwetsbaar en gevoelig voor lekkage van DNA wanneer EDTA opgenomen is. Ter bevordering van de nucleaire integriteit, vervangen wij door EDTA KCl en lage concentraties van divalente kationen zoals MgCl2 of MgSO4. Mg2 + is meestal voorkeur meer dan Ca2 + omdat laatstgenoemde kunt activeren van bepaalde phospholipases en proteasen en remmen van RNA-polymerase. Zodra cavitatie is voltooid, kan EDTA of EGTA worden toegevoegd terug naar de homogenates naar de chelaat de catie, als vereist voor de remming van de metalloproteinasen.
Jurkat cellen weergeven een relatief grote kern naar cytoplasma verhouding, waardoor ze een ideale cellijn te bestuderen van nucleaire integriteit. De toename van homogenisering efficiëntie met behulp van hypotone buffer is minimaal wanneer het vergelijken bij isotone buffer aangevuld met NaCl. Cavitatie in een isotone buffer aangevuld met sacharose herstelt echter ongeveer de helft de eiwitten geëxtraheerd met behulp van een hypotone buffer tegenhanger. Dit is waarschijnlijk niet een direct gevolg van isotonicity en het verschil tussen het gebruik van NaCl en met behulp van sacharose tot isotonicity moet verder onderzocht worden. Een mogelijke verklaring is dat zout Elektrostatische interacties tussen eiwitten verstoort terwijl sucrose niet. Dus, zelfs bij de dezelfde tonus, NaCl heeft een activiteit die relevant zijn voor eiwit extractie dat sacharose ontbreekt. WITH verwijzing aan het behoud van nucleaire integriteit, vonden we een verhoogde fibrillarin eiwitten met isotone buffers, ondanks isotone buffers theoretisch wordt meer beschermende van de kernen teruggekregen. Vreemd genoeg, was de mitochondriale fractie efficiënter geëxtraheerd met isotone buffer aangevuld met NaCl, suggereren dat de omstandigheden met weinig zout suboptimaal voor extractie van de mitochondriën kunnen zijn. Overwegen van cavitatie met hypotone buffer behaalt het beste evenwicht tussen efficiëntie van homogenisering en nucleaire integriteit, wordt de hypotone buffer de buffer van keuze in ons protocol van cavitatie. Echter, wij de lezers waarschuwen dat geen buffer een waarborg voor optimale homogenisering resultaten is. Ons protocol dient te fungeren als een sjabloon voor optimalisatie en piloot testen met gewenste buffers, cellijnen van belang, en andere variabelen (druk, buffer samenstelling, enz.) moeten worden vastgesteld voor de beste resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door GM055279, CA116034 en CA163489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
References
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
