Summary
Здесь мы представляем протоколы для моющих средств свободный гомогенизации культивируемых клеток млекопитающих, азота кавитации и последующее разделение белков цитозольной и мембраны привязкой на основе ultracentrifugation. Этот метод идеально подходит для мониторинга секционирование периферийных мембранных белков между растворимых и мембраны фракции.
Abstract
Культивируемых клеток являются полезными для изучения субцеллюлярные распределение белков, включая периферийные мембранных белков. Генетически закодированный дневно тегами белки революционизировал изучение распределения внутриклеточных белков. Однако трудно дать количественную оценку распределения с помощью флуоресцентной микроскопии, особенно когда белки являются частично цитозольной. Кроме того важно изучить эндогенного белков. Биохимическая assays, такие, как иммуноблотов остаются золотой стандарт для количественной оценки распределения белка после субцеллюлярные фракционирования. Хотя есть коммерческие наборы, которые стремятся изолировать цитозольной или определенных фракций мембраны, большинство этих комплектов основаны на добычу с моющих средств, которые могут быть неподходящими для изучения периферических мембранных белков, которые легко извлекаются из мембраны. Здесь мы представляем бесплатный стиральный порошок протокол для сотовых гомогенизации азота кавитации и последующее разделение белков цитозольной и мембраны прыгните на ultracentrifugation. Мы подтверждаем разделение внутриклеточных органелл в растворимые и Пелле фракции через различных типов клеток и сравните экстракции белка среди нескольких общих методов на основе моющих средств механической гомогенизации. Среди нескольких преимуществ азота кавитации является превосходной эффективности клеточных нарушений с минимальными физические и химические повреждения тонкий органеллы. В сочетании с ultracentrifugation, кавитация азота является отличным способом для изучения сдвиг периферийных мембранных белков между цитозольной и мембраны фракции.
Introduction
Клетчатые протеины можно разделить на два класса: те, которые связаны с мембраны и те, которые не являются. Non мембранных белков и связанные находятся в цитозоле, нуклеоплазмы и lumina органеллы например эндоплазменный ретикулум (ER). Существует два класса связанный мембранами белков, неотъемлемой и периферийных устройств. Неотъемлемой мембранных белков, также известный как трансмембранные белки, потому что один или несколько сегментов цепи полипептида охватывает мембраны, как правило в α-спирали состоит из гидрофобных аминокислот. Трансмембранные белки co-translationally вставляются в мембраны в ходе их биосинтез и остаются так настроен до тех пор, пока они являются голодании. Периферические мембранных белков вынуждены вторично мембраны, обычно вследствие столб-поступательные изменения с гидрофобные молекулы, такие как липиды. В отличие от составной мембранных белков Ассоциация периферийных мембранных белков с клеточных мембран является обратимым и может регулироваться. Многие функции белков периферийных мембраны в сигнальных путей и регулируемых ассоциацией с мембран является одним из механизмов для активации или препятствующих путь. Одним из примеров сигнальной молекулы, что периферической мембранный белок является небольшой ГТФазы, ран. После серии столб-поступательные изменения, которые включают модификации с Фарнезилпирофосфат липидов изменение C-конечная зрелой белок RAS вставляет в цитоплазматических листовка клеточной мембраны. В частности плазматической мембраны является, где ран занимается ее течению эффекторных RAF1. Чтобы предотвратить учредительный активации Митоген активированный протеин киназы (MAPK) пути, несколько уровней управления РАН находятся на месте. Кроме предоставляемых РАН неактивных гидроизолирующей GTP в ВВП, активные РАН также могут быть освобождены от плазматической мембраны путем изменения или взаимодействия с растворяющие факторы для подавления сигналов. Хотя флуоресцентные живых изображений дает клеточных биологов возможность наблюдать за субцеллюлярные локализации флуоресцентный протеин тегами периферийных мембранные белки1, остается крайне необходимо оценить мембраны ассоциации эндогенные белки полу количественно с простой биохимических подходов.
Надлежащей оценки биохимических белка перегородки между мембраной и растворимых фракций зависит от двух факторов: сотовой гомогенизации и эффективное разделение мембраны и растворимых фракций. Хотя некоторые протоколы, включая наиболее широко используемых коммерциализированной наборы, зависят от гомогенизации ячейки на основе моющих средств, эти методы могут запутывать анализа путем извлечения мембранных белков в растворимые фаза2. Соответственно без моющих средств на основе, механические методы разрушения клеток предоставляют результаты уборщика. Существует несколько методов механического разрушения клеток выросли в культуре или заготавливаемым из крови или органов. К ним относятся Dounce гомогенизации, нарушения тонкой иглой, -подшипник гомогенизации, sonication и азота кавитации. Здесь мы оцениваем азота кавитации и сравнить его с другими методами. Кавитация азота зависит от азота, растворенных в цитоплазме клеток под высоким давлением. После уравновешивания суспензию клеток резко подвергается воздействию атмосферного давления таким образом, что в цитоплазме, разорвать клеток вследствие их вскипания образуются пузырьки азота. Если давление является достаточно высоким, пузырьков азота может нарушить ядра3 и мембраной связаны органеллы как лизосомы4. Однако если давление сохраняется достаточно низкий, декомпрессия нарушит плазматической мембраны и ER, но не другие органеллы, тем самым разлив цитозоле и нетронутыми цитоплазматических органелл в огневки, который обозначается cavitate5. По этой причине кавитации азота является методом выбора для изоляции как лизосом и митохондрии органеллы.
Однако это также отличный способ подготовки огневки, который может быть легко разделена на мембраны и растворимых фракций. Сосуд под давлением (отныне называется «бомба») используется в процессе кавитации состоит из корпуса из нержавеющей стали толщиной, выдерживает высокое давление, с входом для доставки газ азот из танка и напорный канал с регулируемой разгрузочный клапан.
Кавитация азота был использован для гомогенизации клеток начиная с 1960-х6. В 1961 году Хантер и Commerfold7 создана кавитации азота как жизнеспособный вариант для млекопитающих тканей срыв. С тех пор исследователи приспособились технику для различных клеток и тканей с успехом, и азота кавитации стал штапель в нескольких приложениях, включая мембраны подготовка8,9, ядер и органелл Подготовка10,11и лабильных биохимических добычи. В настоящее время клеточных биологов чаще используют другие методы клеток гомогенизации, потому что преимущества азота гомогенизации широко не объявлена, бомбы азота являются дорогостоящими и есть заблуждение, что относительно большое количество клеток Обязательно. Протоколы для кавитации азота для достижения свободных клеток гомогенатах с нетронутыми ядра не были опубликованы, и в наиболее опубликованных оценок использовались объемы 20 мл суспензии клеток. Чтобы адаптировать этот классический метод для удовлетворения текущих требований работы с небольших образцов, мы представляем измененный Протокол азота кавитации, специально предназначенные для культивируемых клеток. После азота кавитации, огневки разделяется на водорастворимые (S) и мембранные (P) фракции, дифференциального центрифугирования, сначала с низкой скорости отжима для удаления ядра и нерушимой клетки, а затем с высокоскоростным вращением (> 100 000 x g) для разделения мембраны из растворимых фракции. Мы анализируем эффективность разделения с иммуноблотов и сравните азота кавитации с другими методами механического нарушения. Мы также расследовать осмотического эффекта гомогенизации буфера во время азота кавитации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. буфер и оборудование подготовки
- Chill 45 мл клеток нарушения бомбы, 15 мл трубы и трубы ultracentrifugation на 4 ° C.
- Подготовка и холод 25 мл гомогенизации буфера за 2 x 10 7 клеток на 4 ° C. добавить один протеазы ингибитор планшета непосредственно перед употреблением.
Примечание: Гомогенизации буферы обычно содержат KCl, вместо того, чтобы NaCl лучше отражать внутриклеточных солевой состав. Гомогенизация буфер, используемые в настоящем Протоколе состоит из 10 мм HEPES на рН 7,4, 10 мм KCl и 1,5 мм MgCl 2 (именуемой в дальнейшем гипотонический гомогенизации буфера). Большинство буферы могут быть адаптированы для кавитации азота (см. обсуждение). - Подготовка и холод 6 мл 1 x Phosphate-Buffered солевой (PBS) буфера на сэмпл в 4 ° C. Добавить протеазы ингибитор аксессуарами свежий перед использованием.
Примечание: PBS буфер, используемые в настоящем Протоколе состоит из 10 мм Na 2 HPO 4 на рН 7,4, 1.8 мм х 2 PO 4, 137 мм NaCl и 2,7 мм KCl. - Подготовка и холод 4 мл солюбилизация буфера на сэмпл в 4 ° C. добавить один протеазы ингибитор планшета непосредственно перед употреблением.
Примечание: Солюбилизация буфер, используемые в настоящем Протоколе — 1 x Radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера, который состоит из 25 мм трис на рН 7,4, 150 мм NaCl, 0.1% SDS, Дезоксихолат натрия 0,5% и 1% NP-40. 4.6 см.
2. Сотовый заготовка
- растут 2 x 10-7 -10 x 10 9 клетки культуры ткани с рекомендуемым культуры средств массовой информации для типа ячейки. Как правило, одна 15-см блюдо дает 2 x 10-7 ГЭС-293 клетки культивировали в среде DMEM на 90% confluency ( рис. 1).
- Удалить средство роста вакуум.
- Для адэрентных клеток, место культуры блюда на льду, мыть ячейки непосредственно на культуру блюда нежно с охлажденной гомогенизации буферу дважды (10 мл за 15 см блюдо за мыть) и урожай клетки с крупноклеточный скребок в соответствующий объем гомогенизация буфер; Для подвески клеток собирать и помыть лепешка клеток в охлажденной гомогенизации буферу дважды (10 мл в 50-мл культуры за мыть) с 500 x g спина на 4 ° C за 5 мин и Ресуспензируйте Пелле мыть ячейки в соответствующий объем буфера гомогенизации на льду.
Примечание: объем должен основываться на требованиях для концентрации белка в предполагаемой эксперименты, а также минимальный/максимальный объем в бомба разрушение клеток. Общая рекомендация — 2-10 x 10 7 кл/мл, или около 10 томов ячейки Пелле. Этот протокол оптимизирован для трех блюд 15см ГЭС-293 клеток в 2 мл буфера гомогенизации.
3. Кавитация азота
- передачи суспензию клеток чистой и охлажденные бомбу в ледяной ванне на сенсацию пластина.
Предупреждение: Бомба имеет высокое давление, низкая температура, газ азот – носить личной охраны . - Место микро магнитные перемешать бар внутри бомбы и включите перемешать пластины для поддержания однородности подвеска.
- Добавить одну таблетку ингибитор протеазы к приостановлению и закрыть бомбу за производителя ' s инструкция.
- Постепенно давление бомба с баком газа азота за производителя ' s инструкция до бомба манометр читает 300 до 600 psi. Закройте все клапаны и отсоединить бак азота.
Примечание: Давление, необходимое может меняться с типом ячейки. Здесь мы провели кавитации на 350-400 psi для ячеек ГЭС-293, низ 3T3 и Jurkat. - Ждать 20 минут позволить азота распустить и достичь равновесия внутри клетки.
- Удалить излишки воды вокруг сливного клапана, используя ткань полотенце. Откройте клапан сброса осторожно, чтобы достичь прикапывают релиз огневки и собирать в предварительно охлажденные 15 мл.
Примечание: В конце коллекции будет рывок огневки и газовые выйдет с шипящим звуком. Убедитесь, что газ не причиной ранее собранных cavitate стрелять из трубки (отсюда использование 15 мл пробирок вместо 1.5 мл пробирок). Как только начинает рывок, закройте сливной клапан и откройте клапан впуска азота внезапно для того бомбу и достижения кавитация остальных ячеек в бомбы. Открытые cavitate бомбу для восстановления и тщательной очистки.
Примечание: Последний cavitate должны иметь Млечный возникновение с пены на вершине. Аккуратно перемешайте с кончиком пипетки разрешить пены спадать перед центрифугированием.
Примечание: Изучите cavitate, фазово контрастной микроскопии для определения эффективности гомогенизации. Добавить каплю 15 мкл cavitate на поверхности крышки с coverslip и микроскопии слайд. Повторите шаг 3.4-3.6 только если слишком много непрерывной клетки обнаруживаются с 20 X цель.
Примечание: Если гомогенизации буфера не содержит ЭДТА или EGTA, добавить его в собранных cavitate в конечной концентрации 1 мм в течение 5 мин после выписки.
4. Разделение Cytosolic и мембраны фракции
- центрифуги cavitate на 500 x g 10 мин при 4 ° C для удаления непрерывной клетки и ядер.
Примечание: Повторите шаг центрифугирования до тех пор, пока не видны гранулы производятся и собирать пост ядерной супернатанта (ПНС), избегая пены, плавающей на вершине. Повторно центрифуга пены для дальнейшего сбора и объединить ПНС, при необходимости ( рис. 1). - Процесс ПНС нужным получить фракций интерес. Целью разделения цитозольной и мембраны фракций ПНС передавать ультрацентрифуга трубки и выполнять ultracentrifugation нужным. Этот протокол оптимизирован для < 3,5 мл образца в трубке ультрацентрифуга поликарбоната и для ultracentrifugation на 350 000 x g на 1 ч в 4 ° C.
- Собирать супернатант (фракция S) с помощью пипетки 1мл.
- Тщательно промойте лепешка с 3 мл холодного PBS не нарушая его. Удаление PBS вакуум.
Примечание: Если загрязнение мембраны дроби, цитозольной белки большую озабоченность, чем потери образца, Ресуспензируйте гранулы в 3 мл холодного PBS и ре ультрацентрифуга как в шаге 4.2. Удаление PBS вакуум. - Ресуспензируйте гранулы полностью в соответствующий объем моющих средств содержащих солюбилизация буфера выбора. Для достижения эквивалентности ячейки, используйте такой же объем солюбилизация буфера в цитозольной фракции.
Примечание: Мы рекомендуем использовать 1 x RIPA буфер как солюбилизация буфер для эффективного мембранных белков добычи. Если не ниже по течению пробирного требуется для фракция мембраны, используйте 1 буфер образца x laemmli для максимальной мембранных белков извлечения.
Примечание: Мы предлагаем выбивании и передачи Пелле в буфере солюбилизация чистой трубки на вращателе трубки на 4 ° C для максимальной мембранных белков извлечения.
Примечание: Если гранулы слишком липким (слишком много липиды) эффективно удаляться из йe ультрацентрифуга трубки в буфере солюбилизация, мы предлагаем оснастки замораживания гранулы в жидком азоте и быстро выбивании гранулы из трубки ультрацентрифуга с мини-металлической лопаткой до гранулы таяет.
Примечание: в качестве альтернативы, мембраны окатышей может быть просто высокомобильна и не солюбилизирован в буфере моющих средств содержащих производить P часть мембраны везикул подвеска, в которой дело центрифуги шаг в 4.6 не требуется. Такие дроби P полезны при расследовании функций, таких как ферментативной активности, которые зависят от Ассоциации мембраны. - Центрифуга подвеска полностью растворимых гранул из шага 4.5 на 20000 x g в настольная центрифуга для 10 мин на 4 ° C. собирать супернатанта, с помощью пипетки (фракция P) 1 мл и отбросить Пелле (нерастворимых липиды).
- Выполнения желаемых анализы как Западный blotting с дробями цитозольной и/или мембраны, или сохранить их на-80 ° C для использования в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показано секционирование клеточных белков от ПНС в растворимые цитозольной фракции (S) или мембраны Пелле дроби (P). Мы рассмотрели три представителя клеточных линий из различных типов клеток: ГЭС-293 (эпителия), низ 3T3 (фибробласты) и Jurkat (лимфоцитов). Ро гуанина диссоциации ингибиторы (RhoGDI) и катион независимых рецепторов маннозы-6-фосфат (CIMPR) были использованы в качестве позитивных элементов управления для цитозольной и мембраны фракции, соответственно. Мы подтвердили эффективное разделение цитозоле и мембраны после азота кавитации в ~ 350 psi в гипотонический буфера следуют ultracentrifugation на 350 000 x g за 1 ч. Общий белок оправился от S и P фракций затем были проанализированы с маркеров для ER, endosomes и лизосомы, митохондрии, Гольджи и другие органеллы. Все трансмембранные белки присутствуют в мембраны фракции исключительно, включая Na++ АТФаза /K и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) от плазматической мембраны, calnexin от ER, лизосомальных связанные мембранный белок 1 (LAMP1) от лизосомы, F0-АТФазы из митохондрий и Golgin 97 от транс Гольджи сети. Как и ожидалось, многие периферийные мембранных белков, которые слабо связаны с мембраной, присутствуют как в цитозольной и мембраны фракций в различной степени. Известные примеры включают ранние endosome antigen 1 (ЕЕА1), Rab7/9 (поздний endosomes) и гексокиназа 1 (митохондрий наружной мембраны). Это свидетельствует о полезности этой техники в оценке ассоциации прочность мембраны периферийных белков. Наша лаборатория воспользовался этой кавитация технику для изучения статуса ассоциации мембраны нескольких сигнальных молекул5,12,,1314. Интересно, что мы нашли calregulin почти исключительн в растворимая фракция, предполагая, что микросом, образующиеся ER мембраны также пострадали во время кавитации азота и белков в просвете ER выпускаются растворимая фракция. Напротив целостность митохондрий после кавитационной зависит от типа ячейки. Мы наблюдали F1-АТФазы, внутренний митохондрий периферийных белка, частично в цитозольной фракции от 2% на низ 3T3 клеток до ~ 35% для ГЭС-293 и Jurkat клетки. Это означает, что азот кавитации в 350 psi с гипотонический буфера не обеспечивает митохондриальной целостности. Несмотря на три цикла 500 x g прокруток для создания ПНС из cavitate были удалены не все ядра. Гистоновых деацетилаз 1 (HDAC1) из нуклеоплазмы и fibrillarin от ядрышка, были найдены в ПНС и Пелле. Наличие HDAC1 в гранулах, а не в надосадке предполагает, что ПНС загрязнена с ядрами, вместо того, чтобы ядерные нарушения во время кавитации. Это согласуется с отчетами, которые герметизирующего бомбы до 350 psi оставляет нетронутыми ядер10, хотя наши использование гипотонический буфера может сделать ядер хрупкие, как описано ниже в разделе.
Мы сравнили эффективность гомогенизации азота кавитации с деятельностью других общих методов физического срыва. Равное количество клеток Jurkat были приостановлены в буфере идентичные гипотонический гомогенизации и подвергнуты различные нарушения методов. Было обнаружено потеря образцов в Dounce кавитационной гомогенизации и азота (в обоих случаях около 5-10%, которые собрали меньше объем). Однако азота кавитации дал самую высокую эффективность извлечения белков; прохождения иглы и Dounce принесли только 60% столько белка (рис. 3). Любопытно восстановления некоторых белков определяется immunoblot не показывают существенное различие между методами различные механические нарушения. Однако урожайность некоторых периферийных мембранных белков например гексокиназа 1 и ран была выше в образцах, приготовленные азота кавитации. Это поддерживает что азота кавитация может быть оптимальным для гомогенизации при расследовании периферийных мембранных белков. Восстановление HDAC1 белков, азота кавитации сопоставима с другими методами, предполагая, что ядра остаются нетронутыми в любых условиях. Таким образом данные в рисунке 3 доказывает, что что азота кавитации предлагает улучшенный гомогенизации результаты.
Далее мы сравнивали эффективность гомогенизации между гипотонический буфер и тот же буфер но сделал изотонический с сахарозы или хлорида натрия (рис. 4). Аналогичные суммы белка были извлечены из Jurkat клеток, гомогенизации в гипотонический буфера против NaCl изотонический буфера после кавитации на 350 psi. В отличие от этого меньше белка была восстановлена в ПНС клеток нарушена в буфере, сделал изотонический с сахарозой. Большинство индивидуальных белков, рассмотренных immunoblot подходит этот шаблон. Единственным исключением был fibrillarin, который был относительно обогащенный ПНС, сгенерирована изотонический буфера.
Чтобы определить, если наш протокол может использоваться для расследования секционирование периферийных мембранных белков между растворимых и мембраны фракций, мы сравнили секционирование структуры между тегами Флаг НКО дикого типа и его prenylation недостаточным мутант, C186S ( Рисунок 5). В устойчивом состоянии дикого типа НКО присутствовал в цитозоле и мембран, похожими на наиболее периферийных мембранных белков, хотя часть, восстановленные в растворимая фракция больше, чем для других рас белки14. Когда НКО лишается его модификации prenyl, он теряет способность связывать с мембраны и становится полностью цитозольной. Предполагаемой структуры секционирования НКО подтвердил, что наш протокол является надежным вариантом для изучения динамики секционирования периферийных мембранных белков цитозоле и мембраны.
Рисунок 1: схема, резюмируя шаг 2 (синий), шаг 3 (красный) и 4 (желтый) протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: белка перегородки между цитозольной и мембраны фракций. ГЭС-293, низ 3T3 и Jurkat клетки были подвергнуты азота кавитации (~ 350 psi для 20 минут, приостановлено в гипотонический гомогенизации буфера) и ultracentrifugation (~ 350 000 x g за 1 ч) как описано в протоколе. Уровня эндогенного белка в различных фракций были проанализированы immunoblot. ПНС: Рецептор привязки рака антигена выражено на SiSo клетки (души), ядерная супернатанта, S: супернатанта, P: Пелле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сравнение методов различных механических срыв. Эквивалентное количество клеток Jurkat были приостановлены в гипотонический буфера и подвергаются замораживания оттаивания (3 циклов), игла проход (5 проходов, через 28G½ иглы), Dounce гомогенизации (15 проходит, Kontes 2 мл Dounce трубки с ткани растереть пестиком, Оформление 0,01-0,06 мм) или азота кавитации (~ 350 psi для 20 мин). Относительные уровни эндогенных белков в ПНС были проанализированы immunoblot для каждого метода. Общий белок концентрации ПНС были количественно, BCA assay и нормализованное значение ПНС, подготовленный азота кавитации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: сравнение гипотонические и изотонический буферов, используемых во время азота кавитации. Эквивалентные суммы Jurkat клетки были приостановлены в гипотонический буфер, или гипотонические буфера с 8,5% сахарозы или 150 мм NaCl и подвергается азота кавитации (~ 350 psi для 20 мин). Относительные уровни эндогенных белков в ПНС были проанализированы immunoblot для каждого буфера. Общий белок концентрации ПНС были количественно BCA assay и нормализуется к значению ПНС, подготовленный в гипотонический буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Farnesylated НКО перегородки на P и S фракций. ГЭС-293 клетки были временно transfected с плазмид, направляя выражение с тегами Флаг НКО дикого типа или C186S мутант. Разделение белков была выполнена, как описано в рисунке 2 и уровни указанных белка были проанализированы immunoblot. Воспроизводится с разрешения (Чжоу, M et al., 2016. Первоначально опубликовано в Журнале клеточной биологии. HTTPS://DOI.org/10.1083/JCB.201604061). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества кавитации азота над другими методами механического разрушения многообразны. Возможно наиболее значительные выгоды является его способность мягко, но эффективно гомогенизировать образцов. Физические принципы декомпрессии охлаждает образцы вместо создания местного нагрева ущерб как ультразвуковой и трения/стрижки на основе методов. Кавитация также является чрезвычайно эффективным на срыв плазматической мембраны. Потому что азота, сгенерированная пузыри внутри каждой отдельной ячейки после декомпрессии, процесс кавитации ограничен меньше размер ячейки, размер выборки или отведайте концентрации. Поэтому он предлагает дополнительные преимущества по сравнению на основе Распродажа Dounce или иглы проход гомогенизации. Кавитация азота также предлагает более устойчивые результаты, как же разрушительной силой, которая применяется равномерно по всей выборки могут быть воспроизведены с идентичными давления. Кроме того каждая ячейка только опытом процесс нарушения за один раз и субцеллюлярные компоненты следовательно, подвергаются не постоянно переменной разрушительной силы. Это ограничивает артефакта фрагментации органеллы. Интерес для окисления лабильной клеточных компонентов, вызванные нарушением также снижается, как азот используется для насыщения суспензию клеток и без дополнительного кислорода. Ограниченные физические и химические подчеркивает, введенного азота кавитации делает его идеальной техникой для изучения лабильной ферментов и хрупкие органеллы и воспроизводимость этой техники гомогенизации хорошо подходит для количественной оценки.
Кавитации азота также предоставляет значительную гибкость в отношении размера выборки, состав гомогенизации буферов и степень целостности органеллы. Чтобы масштабировать до гомогенизации, просто необходимо развернуть сосуды под давлением больших мощностей, без ущерба для скорости, удобства и эффективности декомпрессии. Любые гомогенизации буфер может быть использован для кавитации азота; Выбор буфера может быть адаптирована для совместимости с требованиями каждого эксперимента. Можно конструировать гомогенизации буфер, который соответствует внутриклеточную жидкость (например, высоким содержанием калия и низким содержанием натрия) для сведения к минимуму изменения в органеллы. Например мы разработали «релаксация» буфер, который минимизирует ex vivo полимеризацию миозина и таким образом помогает в сборе нетронутыми цитоплазматических везикул от гранулоцитов5. Осмотического и ионной функции буфера также можно изменять для управления степенью гомогенизации клеток. Кроме того агрессивность клеточных нарушений можно управлять путем корректировки давления азота. Умеренное давление уменьшает разрушительные силы для сохранения ядра, митохондрии и другие органеллы в состоянии нетронутым, в то время как высокого давления нарушает эти органеллы. Брок и др. сообщили успех с нарушением крыса базофильная лейкозных клеток при сохранении большинство ядер нетронутыми на 350 psi с гипотонический буфер10, который образует основу давления азота, используемые в нашей текущей протокола.
Ограничения азота кавитации включают тот факт, что гомогенизации единым для всей образцы и различных мембранных структур может производить везикулы аналогичных размеров; Это может осложнить дальнейшее разделение плазматической мембраны, гладкая микросом, endosomes и Гольджи мембраны, ставка зональный плотность градиентного центрифугирования. Другой проблемой является, что органеллы становятся относительно хрупкие после гомогенизации из-за разрыва изнутри. Таким образом этот метод требует тщательной оптимизации для предотвращения поломки органелл в последующих манипуляций. Мы стремились решить некоторые из этих вопросов в настоящем исследовании.
Разделение цитозольной и мембраны фракций путем центрифугирования была изучена в ограниченных подробные отчеты о секционирование белковых фракций с горсть белковых маркеров15,16. Наш метод генерирует сырой разделение белков растворимых и мембраны граница и не предполагает изоляция частности органеллы. Тем не менее это все еще действительный интерес что однородных везикулы различных оболочек, производимые кавитации может повлиять на эффективность разделения по ultracentrifugation. Мы представили всеобъемлющий обзор иммуноблотов изоляции и разделять общие внутриклеточных органелл после ректификации с нашей протокола. Как и ожидалось, исключительно цитозольной белки как RhoGDI являются исключительно в растворимая фракция и трансмембранные белки на плазматической мембране (PM) как EGFR и Na+/k+ АТФаза, были обнаружены только в гранулы. Трансмембранные белки на органеллы ER митохондрий, Гольджи, лизосомы были также обнаружены в гранулах, подтверждающий, что неотъемлемой мембранных белков из различных мембран и органелл могут быть успешно отделены от растворимые белки с Наш метод. Это основные проверки имеет решающее значение для дальнейшего анализа периферической мембранных белков, которая является главной целью настоящего Протокола.
Большинство из периферийных мембранных белков существует в цитозольной и мембраны фракций. Хотя это часто истинное представление о их локализации, она может в некоторых случаях представлять артефакта перераспределения этих белков от поверхности цитоплазматической мембраны растворимая фракция во время процесса гомогенизации, поскольку сила их ассоциации с мембраны не так сильны, как которое неотъемлемой мембранных белков. Хотя кавитации азота минимизирует потенциальные перераспределения, подвергая клетки к нарушению одноразовый, нежный, один следует памятовать о таких артефактов биохимических фракционирования, и сосредоточить внимание на изменения в разделение белков между цитозолевая и мембраны фракций в экспериментальных условиях. Тем не менее изучение периферической мембранных белков на разных стадиях созревания от англ возможен с помощью этого метода. ЕЕА1, Rab5 эффектор, которая опосредует, стыковка с покрытием Клатрин везикулы в начале endosomes, локализуется на поверхности цитоплазматической ранних endosomes и был восстановлен главным образом во фракции Пелле. Также в Пелле фракции конце endosome-связанных с Rab7 и Rab9 белки. Однако остается достаточное количество Rab7/9 в цитозоль. Потому что RabGDI способен взаимодействовать с prenylated Rabs и оказывают эти смытии нерастворимых белков цитозольной, Rab-белков клонат быть более цитозольной чем другие связанные с endosome периферийных мембранных белков.
Характеризовать ядерной и органелл целостности с гомогенизации, азота кавитации, мы immunoblotted изолированные фракции Люминал и цитоплазматических отсеках. В этом анализе calregulin полностью попадает в растворимая фракция, демонстрируя что ER нарушается в форме микросом и тем самым утечки Люминал содержание. Учитывая, что одной половины общей площади мембраны в эукариотической клетке заключает лабиринт пространства ER, это не удивительно, что его обширной сети sac как или трубчатые структуры не остаются неизменными во время расширения пузырьков азота. С другой стороны, наш анализ митохондриальной целостности после кавитационной показывает четкую зависимость от типа клеток, как мы наблюдали F1-АТФазы, белок, который является периферически связанных с внутреннюю мембрану митохондрий, в цитозольной фракции в различной степени (~ 35% для ГЭС-293 и Jurkat, 2% для низ 3T3). Это означает, что азот кавитации в 350 psi с гипотонический буфера не гарантирует целостность митохондрий. Действительно другие сообщили, что для сохранения митохондрий, кавитация должно быть выполнено при давлениях ниже 150 psi17. Напротив мы обнаружили, что каталаза остается в просвете пероксисомы. Интригующе ядерных белков наблюдаются в ПНС и Пелле фракций. В частности, HDAC1, деацетилаз гистонов, на всей территории нуклеоплазмы, отсутствует в растворимая фракция, указав, что ядерная целостность не нарушалась. Это свидетельствует о том, что ядерная оболочка не разрыв, кавитация, как можно было бы ожидать выпуска HDAC1 в solubLe фракция в этом сценарии. Он по-прежнему вероятно что ядер не удаляются полностью во время процесса подготовки ПНС, и после ultracentrifugation белок остается в гранулы. Эта вероятность подтверждается тот факт, что в растворимая фракция подтекания не ДНК. Таким образом, мы заключаем, что использование гипотонический гомогенизации буфера при кавитации на ~ 350 psi с добавлением мг2 + возможность сохранить ядерные целостность в несколько клеточных линий.
Наши результаты также показывают, что рибосомы собирают полностью в мембраны фракция гранул, предполагая, что даже свободные рибосомы в цитоплазме, которые несвязанных ER мембраны может быть полностью осевших в буфере не сахароза подушки после центрифугирование в 350 000 x g за 1 ч. Аналогичным образом, выявление связанных с autophagy белка 12 (Atg12)-конъюгат Atg5 как маркер autophagosomes, раскрывает строгой сегрегации в Пелле фракций. Его присутствие в цитозоле может быть вызвано тем, что ковалентной вложение-Atg12 и Atg5 предшествует autophagosomes формирования. Белки цитоскелета трудно оценить из-за ex vivo полимеризации. Это явление может быть сведено к минимуму с буфером релаксации, но в протоколе, описанные здесь, тубулин является вероятно полимеризованной ex vivo после chelation кальция 18. В наших препаратов тубулин находится в Пелле, предлагая полимеризации, тогда как актин находится в S и P фракций.
Охарактеризовать потенциальные преимущества азота кавитационной гомогенизации эффективности, мы рассмотрели некоторые общие методы механического нарушения. Не были оценены методы оптимизированы для образцов тканей, таких как блендер или раствора/пестиком. Sonication был также исключен как трудно нарушить поверхности мембраны при сохранении внутренней органеллы. Наш анализ сосредоточены на следующие методы: замораживания оттаивания, игла прохода и Dounce гомогенизации, как они легко выполнить и не требуют специального оборудования, например подшипники гомогенизатор. Jurkat клетки были использованы в этом анализе из-за их малого размера, что делает их трудно эффективно гомогенизировать с традиционными жидких режа методов, которые зависят от оформления, таких как иглы прохода и Dounce. Судя по концентрации общего белка оправился, мы обнаружили, что размер ячейки независимые срыв методы, такие как азот кавитации и замораживания оттаивания действительно показывают Улучшенный эффективность извлечения белков. Аналогичный анализ с клеток больших размеров показали меньше различия в эффективности гомогенизации, хотя кавитации азота по-прежнему превосходит альтернативных физические методы испытания (данные не показаны).
Многие цитозольной, от англ и Цитоскелет белки были эффективно восстановлены с всех проверенными методами. В отличие от белков на ER и Гольджи оптимально были восстановлены с помощью кавитации азота. Немного ниже выход F1-АТФазы в кавитации азота по сравнению с другими методами может отражать тот факт, что митохондрии, скорее всего, остаются неизменными в процессе кавитации и поэтому более эффективно удаляются в медленной скорости отжима используется для генерировать ПНС. Наблюдение что гексокиназа 1, периферийных мембранные белки как в цитозоле и связанные с внешней митохондриальной мембраны, вели себя в противоположном моды по отношению к F1-АТФазы вероятно отражает лабильность ассоциации гексокиназа 1 относительно F1-АТФазы, который поглощенных внутри митохондрий. Важно отметить, что хотя способное нарушить клетки с сопоставимой эффективности, методы альтернативного механические нарушения дал относительно бедных восстановления некоторых периферийных мембранных белков (гексокиназа 1 и РАН). Таким образом кавитация методика нашей гомогенизации выбора для целей расследования раздела периферийных мембранных белков. Потому что Dounce гомогенизации широко используется для подготовки нетронутыми ядер, мы использовали Dounce как ориентир для оценки ядерной целостности через другие методы механического нарушения. В нашем анализе аналогичные уровни восстановления HDAC1 белков подтверждают, что ядра остаются нетронутыми в гомогенатах Jurkat, подготовленный азота кавитации в ~ 350 psi с гипотонический буфера.
Было очевидно, что гомогенизации буфер, используемый во время азота кавитации может существенно повлиять на целостность эффективность и органелл нарушения. В то время как состав гомогенизации буфера должны быть оптимизированы к требованиям предполагаемого применения, стоит отметить, исследователи, выполняя азота декомпрессии тканей животных использовать буфер с низким осмотическим давлением для извлечения ядерной содержание. Охотник и Коммерфорд показал ядер отеки и разрыв, когда решения были разбавленных и сохранения ядра при использовании изотонический решения7 (которое может быть достигнуто путем добавления что неорганических солей натрия хлорида или растворенных органических веществ таких как Сахароза или глицерин). Стандартный изотонический буфер, используемый для изоляции внутриклеточных органелл помимо ядра от mammalian клеток — 0,25 М сахарозы, содержащие 1 мм ЭДТА и буферизацией с трис, HEPES или Трицин при pH 7,0-7,6. Но не все культуры клетки могут эффективно гомогенизации в одном из изотонический буферов. Гипотонический буфера (обычно 10 мм трис, HEPES, и т.д.) часто используется для предоставления необходимых осмотического стресса для некоторых типов клеток для достижения полной гомогенизации. Однако как упоминалось ранее, гипотонические буферов, как правило, визуализации ядер хрупкими и подверженными утечки ДНК при ЭДТА. Для содействия ядерной целостность, мы заменяем ЭДТА KCl и низких концентрациях двухвалентной катионов например MgCl2 или4MgSO. MG2 + предпочтительнее обычно Ca2 + потому что последний может активировать определенные фосфолипаз и протеаз и подавляют РНК-полимеразы. После завершения кавитации, ЭДТА или EGTA могут добавляться обратно в гомогенатах хелат катион, если требуется для подавления металлопротеаз.
Jurkat клетки отображения относительно большой коэффициент ядра в цитоплазму, что делает их идеальным клеточная линия для изучения ядерной целостности. Повышение эффективности усреднения с помощью гипотонический буфера является минимальным, при сравнении изотонический буфер с NaCl. Однако кавитации в изотонический буфере с сахарозой восстанавливает приблизительно половину белков, извлечены с помощью гипотонический буфера коллегой. Это вряд ли может быть прямым результатом isotonicity, и несоответствие между использованием NaCl и сахарозы для достижения isotonicity требует дальнейшего расследования. Одно из возможных объяснений является, что соль разрушает электростатического взаимодействия белков, тогда как сахароза не. Таким образом даже в том же тонус, NaCl имеет отношение к добыче белка, что сахароза не хватает деятельность. Wотношении к сохранению ядерных целостности, мы обнаружили увеличение fibrillarin белков, восстановленные с изотоническим буферов, несмотря на изотонический буферов, теоретически, более защитные ядер. Любопытно митохондриальных фракции более эффективно был извлечен с изотоническим буфера, дополнена NaCl, предполагая, что условиях низкой соли может быть оптимальным для извлечения митохондрий. Учитывая, что кавитации с гипотонический буфера достигает наилучший баланс между эффективностью гомогенизации и ядерных целостности, гипотонические буфер становится буфер выбора в нашем протоколе кавитации. Однако мы предостерегаем читателей, что буфер не является гарантией оптимального усреднение результатов. Наш протокол должен служить в качестве шаблона для оптимизации, и пилотного тестирования с желаемой буферов, клеточных линий, представляющих интерес и другие переменные (давление, буфер состав и т.д.) должен быть создан для достижения наилучших результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась GM055279, CA116034 и CA163489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
References
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
