Summary
Her presenterer vi protokoller for vaskemiddel uten homogenisering kulturperler pattedyrceller basert på nitrogen kavitasjon og påfølgende separasjon av cytosolic og membran-bundet proteiner av ultracentrifugation. Denne metoden er ideelt for overvåking partisjonering av ytre membran proteiner mellom vannløselige og membran fraksjoner.
Abstract
Kultivert celler er nyttige for å studere subcellular distribusjon av proteiner, inkludert eksterne membran proteiner. Genetisk kodet fluorescently har merket proteiner revolusjonert studiet av subcellular protein distribusjon. Men er det vanskelig å kvantifisere distribusjon med fluorescerende mikroskopi, spesielt når proteiner er delvis cytosolic. Videre er det ofte viktig å studere endogene proteiner. Biokjemisk søk som immunoblots være gullstandarden for kvantifisering av protein fordeling etter subcellular fraksjoneres. Selv om det kommersielle kits som mål å isolere cytosolic eller visse membran brøker, er de fleste av disse pakkene basert på ekstraksjon med vaskemidler, som kan være uegnet for å studere ytre membran proteiner som er lett ut membraner. Her presenterer vi en vaskemiddel uten protokoll for mobilnettet homogenisering av nitrogen kavitasjon og påfølgende separasjon av cytosolic og membran-bundet proteiner av ultracentrifugation. Vi bekrefte separasjon av subcellular organeller i løselig og pellets fraksjoner over forskjellige celletyper, og sammenligne protein utvinning blant flere vanlige ikke-vaskemiddel-baserte mekanisk homogenisering metoder. Blant flere fordeler av nitrogen er kavitasjon overlegen effektiviteten av mobilnettet avbrudd med minimal fysiske og kjemiske skade delikat organeller. Kombinert med ultracentrifugation, nitrogen kavitasjon er en utmerket metode for å undersøke skifte av ytre membran proteiner mellom cytosolic og membran fraksjoner.
Introduction
Mobilnettet proteiner kan deles inn i to klasser: de som er forbundet med membraner og de som ikke. Non-membran tilhørende proteiner finnes i stoffer, nucleoplasm og lumina av organelles som det endoplasmatiske retikulum (ER). Det er to klasser av membran-assosiert proteiner, integrert og tilbehør. Integrert membran proteiner er også transmembrane proteiner fordi ett eller flere segmenter av polypeptid kjeden spenner over membranen, vanligvis som en α-helix består av hydrofobe aminosyrer. Transmembrane proteiner inn co-translationally membraner i deres biosyntesen og være så konfigurert til de er catabolized. Ytre membran proteiner er sekundært kjørt til membraner, vanligvis av post-translasjonell modifikasjon med hydrofobe molekyler som lipider. I motsetning til integrert membran proteiner, foreningen av ytre membran proteiner med mobilnettet membraner er reversibel og kan reguleres. Mange ytre membran proteiner funksjonen signalveier og regulert tilknytning membraner er en mekanisme for aktivering eller hemme en sti. Et eksempel på en signalnettverk molekyl som er et protein som ytre membran er den lille GTPase, RAS. Etter en rekke post-translasjonell endringer omfatter modifisering med en farnesyl lipid, endret C-terminus en eldre RAS protein setter inn i cytoplasmatiske heftet av mobilnettet membranen. Spesielt er plasma membranen der RAS engasjerer sin nedstrøms effektor RAF1. For å hindre konstituerende aktivering av mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) veien, er flere nivåer av kontroll av RAS på plass. Foruten gjengivelse RAS inaktive av hydrolyzing GTP i BNP, kan aktive RAS også frigis fra plasma membranen av endringer eller interaksjon med solubilizing faktorer å hemme signalering. Selv om fluorescerende live bildebehandling gir celle biologer muligheten til å observere den subcellular lokaliseringen av fluorescerende protein-merket eksterne membran proteiner1, fortsatt det kritisk behov for å vurdere membran sammenslutning av endogene proteiner semi kvantitativt med enkle biokjemiske tilnærminger.
Riktig biokjemiske evalueringen protein partisjonering mellom membranen og løselig fraksjoner er kritisk avhengig av to faktorer: cellular homogenisering og effektiv separasjon av membran og løselig fraksjoner. Selv om enkelte protokoller, inkludert den mest brukte kommersialiserte prosjektpakker, avhengig av vaskemiddel-baserte celle homogenisering, kan disse metodene Beskytt analyse av utdrager membran proteiner i løselig fase2. Følgelig, ikke-rengjøringsmiddel basert, mekanisk metoder for celle avbrudd gir renere resultater. Det finnes flere metoder for mekanisk avbrudd i celler dyrket i kultur eller høstet fra blod eller organer. Disse inkluderer Dounce homogenisering, tynn nål avbrudd, kulelager homogenisering, sonication og nitrogen kavitasjon. Her vi evaluerer nitrogen kavitasjon og sammenligne den med andre metoder. Nitrogen kavitasjon, avhengig av nitrogen som oppløses i cytoplasma cellene under høyt trykk. Etter balanse vises cellen suspensjon brått for lufttrykk slik at nitrogen bobler dannes i cytoplasma som rive åpne cellen av deres effervescence. Dersom trykket er tilstrekkelig høy, nitrogen effervescence kan forstyrre kjernen3 og membran-bundet organeller som lysosomer4. Men hvis trykket er lav nok, vil dekomprimeringen forstyrre plasma membranen og ER men ikke andre organeller, dermed smitte både stoffer og intakt cytoplasmatiske organeller til homogenate som er angitt på cavitate5. Derfor er nitrogen kavitasjon metoden for valg for å isolere organelles som lysosomer og mitokondrier.
Men er det også en utmerket måte å forberede en homogenate som lett kan deles inn i membranen og løselig fraksjoner. Trykk fartøyet (heretter kalt "bombe") under kavitasjon består av en tykk rustfri stålet casing som tåler høyt trykk, med en vik for levering av nitrogen gassen fra en tank og en stikkontakt-port med en justerbar tømmeventil.
Nitrogen kavitasjon har vært brukt i cellen homogenisering siden 1960-tallet6. I 1961 etablerte jeger og Commerfold7 nitrogen kavitasjon som et levedyktig alternativ for pattedyr vev avbrudd. Siden da forskere har tilpasset teknikken til ulike celler og vev med suksess, og nitrogen kavitasjon har blitt en stift i flere programmer, inkludert membran forberedelse8,9, kjerner og organelle Forberedelse10,11og labil biokjemiske utvinning. Foreløpig ansette celle biologer oftere andre metoder for cellen homogenisering fordi fordelene av nitrogen homogenisering ikke har blitt viden annonseres, nitrogen bomber er dyrt og det er en misforståelse som et relativt stort antall celler nødvendig. Protokoller for nitrogen kavitasjon å oppnå celle-fri homogenates med intakt kjerner ikke er publisert, og mest publiserte evalueringer av 20 mL celle suspensjon ble brukt. For å tilpasse denne klassiske teknikken for gjeldende krav til arbeider med småskala prøver, presenterer vi endret protokollen nitrogen kavitasjon spesielt utformet for kulturperler celler. Etter nitrogen kavitasjon, homogenate deles i løselig (S) og membran (P) fraksjoner av differensial sentrifugering, først med en lav hastighet spin å fjerne kjerner og ubrutt celler, og deretter med en høyhastighets spinn (> 100 000 x g) å skille Membraner fra løselig brøkdel. Vi analysere effektiviteten av separasjon med immunoblots og sammenligne nitrogen kavitasjon med andre mekaniske avbrudd teknikker. Vi undersøker også osmotisk effekten av homogenisering buffer under nitrogen kavitasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. buffer og utstyr forberedelser
- Chill 45 mL celle avbrudd bomber, 15 mL rør og ultracentrifugation rør på 4 ° C.
- Forberede og chill 25 mL av homogenisering buffer per 2 x 10 7 cellene på 4 ° C. Legg en protease hemmer tablett like før bruk.
Merk: Homogenisering buffere vanligvis inneholde KCl stedet NaCl bedre reflektere intracellulær salt komposisjon. Homogenisering bufferen i denne protokollen består av 10 mM HEPES ved pH 7.4, 10 mM KCl og 1,5 mM MgCl 2 (heretter referert til som hypotonisk homogenisering buffer). De fleste buffere kan tilpasses for nitrogen kavitasjon (se diskusjon). - Forberede og chill 6 mL 1 x Phosphate-Buffered saltvann (PBS) buffer per prøve på 4 ° C. Legg protease hemmer tabletter frisk før bruk.
Merk: PBS bufferen i denne protokollen består av 10 mM Na 2 HPO 4 ved pH 7.4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl og 2,7 mM KCl. - Forberede og chill 4 mL solubilization buffer per prøve på 4 ° C. Legg en protease hemmer tavle like før bruk.
Merk: Solubilization bufferen i denne protokollen er 1 x Radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer, som består av 25 mM Tris på pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natrium deoxycholate og 1% NP-40. Se 4.6 merknad.
2. Cellen høsting
- vokse 2 x 10 7 -10 x 10 9 vev kultur celler med de anbefalte kultur medier for den cellen. Vanligvis en 15 cm rett gir 2 x 10 7 HEK-293 celler kultivert i DMEM på 90% confluency ( figur 1).
- Fjerne vekstmediet av vakuum.
- For tilhenger celler, plasser kultur rettene på is, vaske cellene direkte på kultur rettene forsiktig med kjølt homogenisering buffer to ganger (10 mL buffer per 15 cm parabolen per vask) og høste celler med en stor celle skraper i en passende mengde homogenisering buffer; Samle suspensjon celler, og vask celle pellet kjølt homogenisering buffer to ganger (10 mL buffer per 50 mL kultur per vask) med 500 x g spinn ved 4 ° C i 5 min og resuspend vasket celle pellet i en passende mengde homogenisering buffer på is.
Merk: volumet bør være basert på kravene for protein konsentrasjon i den tiltenkte eksperimenter i tillegg til minimal/maksimal volumet tillatt i celle avbrudd bomben. En generell retningslinje er 2-10 x 10 7 celler/mL, eller ca 10 mengder cellen pellets. Denne protokollen er optimalisert for tre 15 cm retter HEK-293 celleområde i 2 mL homogenisering bufferen.
3. Nitrogen kavitasjon
- overføring celle suspensjon til en ren og kjølt bombe i en isbadet på oppsikt plate.
FORSIKTIG: Bombe har høyt trykk, lav temperatur, nitrogen gass – bruke riktig personlig verneutstyr . - Plasser en mikro magnetic røre bar inne bomben og slå på rør plate å opprettholde suspensjon homogenitet.
- Legger til en protease hemmer tablett til suspensjon og lukker bomben per produsent ' s instruksjon.
- Gradvis presse bomben med en nitrogen gasstanken per produsent ' s instruksjon til trykkmåleren bombe leser 300 til 600 psi. Lukk alle ventiler og koble nitrogen tanken.
Merk: Trykket kreves kan variere med hvilken celle. Her vi utført kavitasjon på 350 400 psi for HEK-293, NIH-3T3 og Jurkat celler. - Vente 20 min til å tillate nitrogen å oppløse og nå likevekt i cellene.
- Fjern overflødig vann rundt tømmeventilen med en klut håndkle. Åpne tømmeventilen forsiktig å oppnå en dropwise versjon av homogenate og samle inn i en pre kjølt 15 mL tube.
Merk: På slutten av samlingen vil det være en sprute av homogenate og gass vil dukke opp med et hvesende. Kontroller at gassen ikke årsaken tidligere samlet kaviterer for å skyte ut av røret (dermed bruk av 15 mL rør i stedet for 1,5 mL rør). Når sprute begynner, lukker tømmeventilen og åpner nitrogen inntak ventil brått å depressurize bomben og oppnå kavitasjon gjenværende cellene i bomben. Åpne bomben til kaviterer utvinning og grundig rengjøring.
Merk: Den siste cavitate bør ha hvitaktig med skum på toppen. Forsiktig røre med Pipetter tips å tillate skum å avta før sentrifugering.
Merk: Undersøke cavitate ved kontrast mikroskopi å bestemme homogenisering effektiviteten. Legge en 15 µL dråpe kaviterer på overflaten av en mikroskopi lysbilde og dekk med en dekkglassvæske. Gjenta trinn 3.4-3.6 bare hvis for mange ubrutt celler ble oppdaget med en 20 X målsetting.
Merk: Hvis homogenisering buffer ikke inneholder EDTA eller EGTA, legge den til de innsamlede kaviterer i en siste konsentrasjon av 1 mM innen 5 min etter utskrivning.
4. Separasjon av Cytosolic og membran fraksjoner
- sentrifuge cavitate på 500 x g i 10 min på 4 ° C fjerne ubrutt celler og atomkjerner.
Merk: Gjenta sentrifugering trinn til ingen synlige pellets er produsert og samle innlegget kjernefysiske Supernatant (PNS) mens du unngår skum flyter på toppen. Nytt sentrifuge skum for å samle og kombinere PNS, ytterligere hvis nødvendig ( figur 1). - Behandle PNS som ønsket å få fraksjoner av interesse. For å skille cytosolic og membran fraksjoner, overføre PNS til en ultracentrifuge rør og utføre ultracentrifugation som ønsket. Denne protokollen er optimalisert for en < 3,5 mL utvalg i et polykarbonat ultracentrifuge rør og ultracentrifugation på 350 000 x g 1t på 4 ° C.
- Samle nedbryting (S brøken) ved hjelp av en 1 mL pipette.
- Nøye skyll pellets med 3 mL kaldt PBS uten å forstyrre den. Fjerne PBS av vakuum.
Merk: Hvis forurensning av membran brøkdel av cytosolic proteiner er et større problem enn tapet av prøven, resuspend pellet i 3 mL kaldt PBS og re-ultracentrifuge som i trinn 4.2. Fjerne PBS av vakuum. - Resuspend pellet fullt i en passende mengde vaskemiddel inneholder solubilization buffer valgfrihet. For å oppnå celle ekvivalens, bruke samme volum solubilization bufferen som cytosolic brøken.
Merk: Vi foreslår med 1 x RIPA buffer som solubilization buffer for effektiv membran protein utvinning. Hvis ingen nedstrøms analysen er nødvendig for membran brøk, bruker 1 x laemmli eksempel buffer for maksimal membran protein utvinning.
Merk: Vi anbefaler at dislodging og overføre pellet solubilization buffer til en ren rør på et rør rotator på 4 ° C for maksimal membran protein utvinning.
Merk: Hvis pellet for klissete (for mange lipider) fjernes effektivt fra the ultracentrifuge tube solubilization buffer, foreslår vi snapin frysing av pellet i flytende nitrogen og raskt dislodging pellets fra ultracentrifuge tube med mini metall spatula før pellet thaws.
Merk: Alternativt membran pellets kan bare resuspended og ikke solubilized i en ikke-vaskemiddel-inneholder buffer til å produsere en P brøkdel av membran vesicle suspensjon som saken på sentrifugering trinn i 4.6 ikke er nødvendig. Slike P fraksjoner er nyttige når undersøke funksjoner som enzym aktiviteter som er avhengige av membran association. - Sentrifuge fullt solubilized pellets suspensjon fra trinn 4.5 20.000 x g i en tabletop centrifuge for 10 min 4 ° C. samle nedbryting ved hjelp av en 1 mL pipette (P brøken) og kast pellet (uløselig lipider).
- Utføre ønsket analyser som vestlige blotting med cytosolic og/eller membran fraksjoner, eller lagre dem på-80 ° C for fremtidig bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser partisjonering av mobilnettet proteiner fra PNS i enten løselig cytosolic brøkdel (S) eller membran pellet brøkdel (P). Vi undersøkte tre representant linjer fra ulike celletyper: HEK-293 (epithelial), NIH-3T3 (fibroblast) og Jurkat (lymfocytter). Rho Guanine dissosiasjon Inhibitor (RhoGDI) og kasjon uavhengig mannose-6-fosfat reseptor (CIMPR) ble brukt som positive kontroller for cytosolic og membran fraksjoner, henholdsvis. Vi bekreftet effektiv separasjon av stoffer og membran etter nitrogen kavitasjon på ~ 350 psi i hypotonisk buffer etterfulgt av ultracentrifugation på 350 000 x g 1t. Totalt protein utvunnet fra S og P fraksjoner ble deretter analysert med indikatorer for ER, endosomes og lysosomer, mitokondrier, Golgi og andre. Alle transmembrane proteiner er tilstede i membranen fraksjonen utelukkende, inkludert Na+/K+ ATPase og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) fra plasma membranen, calnexin fra ER, lysosomale-assosiert membran protein 1 (LAMP1) fra lysosomer, F0-ATPase fra mitokondrier og Golgin 97 fra trans Golgi nettverk. Som forventet, mange ytre membran proteiner som er løst tilknyttet membranen, presentere både i cytosolic og membran fraksjoner i varierende grad. Kjente eksempler tidlig endosome antigen 1 (EEA1), Rab7/9 (sent endosomes) og hexokinase 1 (ytre mitokondrier membran). Dette viser nytten av denne teknikken i evaluering av membran association styrken av eksterne proteiner. Vårt laboratorium har utnyttet dette kavitasjon teknikk for å undersøke statusen membran association for flere signalnettverk molekyler5,12,13,14. Interessant, fant vi calregulin nesten utelukkende i løselig fraksjonen, antyder at microsomes generert fra ER membraner har også blitt forstyrret under nitrogen kavitasjon og proteiner i ER lumen frigis til løselig brøk. Derimot er integriteten til mitokondrier etter kavitasjon avhengig av hvilken celle. Vi observerte F1-ATPase, en indre mitokondrier perifere protein, delvis i cytosolic fraksjonen varierer fra 2% for NIH-3T3 celler til ~ 35% for HEK-293 og Jurkat celler. Dette indikerer at nitrogen kavitasjon på 350 psi med hypotonisk buffer sikrer ikke mitokondrie integritet. Til tross for tre sykluser på 500 x g spinner generere PNS fra cavitate, ble ikke alle atomkjerner fjernet. Histone deacetylase 1 (HDAC1) fra nucleoplasm og fibrillarin fra kjerne, fant både PNS og pellet. Tilstedeværelsen av HDAC1 i pellet og ikke i nedbryting antyder at PNS er forurenset med atomkjerner, i stedet for kjernefysisk avbrudd under kavitasjon. Dette er konsistent med rapporter som pressurizing bomben til 350 psi forlater kjerner intakt10, men vår bruk av hypotonisk buffer kan gjøre kjerner skjøre, som beskrevet i delen senere.
Vi sammenlignet homogenisering effektiviteten av nitrogen kavitasjon at andre felles fysiske avbrudd metoder. Like mye Jurkat celler ble suspendert i identiske hypotonisk homogenisering buffer og utsatt for ulike avbrudd metoder. Det var synlig tap av prøver Dounce homogenisering og nitrogen kavitasjon (i begge tilfeller ca 5-10% mindre volum samles). Men ga nitrogen kavitasjon høyeste protein utvinning effektiviteten; p passasje og Dounce gitt bare 60% så mye protein (Figur 3). Merkelig, utvinning av noen proteiner som immunoblot ikke viser en betydelig forskjell mellom ulike mekaniske avbrudd metodene. Men var avkastningen av visse ytre membran proteiner som hexokinase 1 og RAS høyere i prøver med nitrogen kavitasjon. Dette støtter det nitrogen kavitasjon kan være optimal for homogenisering når undersøke eksterne membran proteiner. Utvinning av HDAC1 proteiner av nitrogen kavitasjon kan sammenlignes med andre metoder, antyder at kjerner beholdes under alle forhold. Dataene i Figur 3 viser dermed at nitrogen kavitasjon tilbyr overlegen homogenisering resultater.
Neste, vi sammenlignet homogenisering effektiviteten mellom hypotonisk buffer og den samme bufferen men gjorde isotonic sukrose eller natriumklorid (Figur 4). Lignende mengder protein ble gjenopprettet fra Jurkat cellene homogenisert hypotonisk buffer mot NaCl isotonic bufferen etter kavitasjon på 350 psi. I kontrast, ble mindre protein gjenopprettet i PNS celleområde forstyrret i buffer gjort isotonic med sukker. De fleste individuelle proteiner undersøkt av immunoblot passer dette mønsteret. Unntaket var fibrillarin som var relativt beriket i PNS generert i isotonic buffer.
Å avgjøre hvis våre protokollen kan brukes til å undersøke partisjonering av ytre membran proteiner mellom vannløselige og membran fraksjoner, vi sammenlignet partisjonering mønstre mellom flagg-merket NRAS villtype og dens prenylation-mangelfull mutant, C186S ( Figur 5). I steady state finnes wild type NRAS både stoffer og membraner, ligner mest ytre membran proteiner, selv om delen utvinnes i løselig fraksjonen er større enn for andre RAS proteiner14. Når NRAS er fratatt sin prenyl endring, den mister evnen til å knytte membraner og blir helt cytosolic. Forventet partisjonering mønstre av NRAS bekreftet at våre protokollen er en pålitelig mulighet til å studere dynamikken i partisjonering av ytre membran proteiner mellom stoffer og membraner.
Figur 1: flytskjema oppsummerer trinn 2 (blå), trinn 3 (rød) og 4 (gul) protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Protein partisjonering mellom cytosolic og membran fraksjoner. HEK-293, NIH-3T3 og Jurkat celler ble utsatt for nitrogen kavitasjon (~ 350 psi for 20 min, suspendert i hypotonisk homogenisering buffer) og ultracentrifugation (~ 350 000 x g 1t) som beskrevet i protokollen. Endogene protein nivå i forskjellige fraksjoner ble analysert av immunoblot. PNS: Reseptor-bindende kreft antigen uttrykt på SiSo celler (RCAS), kjernefysiske nedbryting, S: nedbryting, P: pellets. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sammenligning av ulike mekaniske avbrudd teknikker. Tilsvarende beløp Jurkat celler ble suspendert i hypotonisk buffer og utsatt for fryse-opptining (3), p passasje (5 pass, gjennom 28G½ nål), Dounce homogenisering (15 går, Kontes 2 mL Dounce t med en vev grind støter, rydding av 0,01-0.06 mm) eller nitrogen kavitasjon (~ 350 psi for 20 min). Relativ nivåer av endogen proteiner i PNS ble analysert av immunoblot for hver metode. Totalt protein konsentrasjoner av PNS kvantifisert av BCA assay og normalisert verdi av PNS utarbeidet av nitrogen kavitasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sammenligning av hypotonisk og isotonic buffere under nitrogen kavitasjon. Tilsvarende mengder av Jurkat celler ble suspendert i enten hypotonisk buffer og hypotonisk buffer supplert med 8,5% sukrose eller 150 mM NaCl, og utsatt for nitrogen kavitasjon (~ 350 psi for 20 min). Relativ nivåer av endogen proteiner i PNS ble analysert av immunoblot for hver bufferen. Totalt protein konsentrasjoner av PNS kvantifisert ved BCA analysen og normalisert verdi av PNS forberedt hypotonisk buffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Farnesylated NRAS partisjoner i både P og S brøker. HEK-293 celler var transiently transfekterte med Plasmidene regi uttrykk for flagg-merket NRAS villtype eller C186S mutant. Protein partisjonering ble utført som beskrevet i figur 2 og de angitte protein nivåene ble analysert av immunoblot. Gjengitt med tillatelse (Zhou, M et al., 2016. Opprinnelig publisert i Tidsskriftet Cell Biology. https://doi.org/10.1083/JCB.201604061). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelene av nitrogen kavitasjon over andre metoder for mekanisk avbrudd er mange. Kanskje er den viktigste fordelen dens evne til å forsiktig, men effektivt homogenize eksemplarer. De fysiske prinsippene av dekompresjon avkjølt prøver i stedet for å generere lokale oppvarming skade som Ultralydutstyr og friksjon/klippe basert teknikker. Kavitasjon er også svært effektiv på å forstyrre plasma membranen. Fordi nitrogen bobler genereres i hver celle ved dekomprimering, kavitasjon prosessen begrenses ved cellestørrelsen, prøve størrelse eller prøve konsentrasjon. Derfor tilbyr ekstra fordeler over clearance-baserte Dounce eller p passasje homogenisering. Nitrogen kavitasjon tilbyr også mer enhetlige resultater som samme nedbrytende kraft som brukes jevnt over hele utvalget kan gjengis med identisk trykk. Videre hver celle bare opplever avbrudd prosessen for én gang og subcellular komponenter er derfor ikke stadig utsatt variabel forstyrrende styrker. Dette begrenser artefactual fragmentering av organeller. Bekymring for oksidasjon av labilt cellulære komponenter forårsaket av forstyrrelse er også begrenset, som nitrogen brukes å mette celle suspensjon, uten ekstra oksygen. Begrensede fysiske og kjemiske stress pålagt av nitrogen kavitasjon gjør en ideell teknikk å studere labil enzymer og skjøre organeller og reproduserbarhet av denne homogenisering teknikken er velegnet for kvantifisering.
Nitrogen kavitasjon tilbyr også betydelig fleksibilitet med hensyn til utvalgsstørrelsen, sammensetningen av homogenisering buffere og graden av organelle integritet. For å skalere opp homogenisering, trenger man bare å distribuere trykkbeholdere av større kapasitet, uten å ofre hastigheten, bekvemmelighet eller effektiviteten av dekompresjon. Noen homogenisering bufferen kan brukes til nitrogen kavitasjon; buffer valg kan skreddersys for kompatibilitet med kravene i hvert eksperiment. Man kan designe en homogenisering buffer som tilsvarer intracellulær væske (f.eks, høyt kalium og lav natrium) å minimere endringer i organeller. For eksempel utviklet vi en "avslapping" buffer som minimerer ex vivo begrepsordbok polymerisasjon og dermed hjelper samle intakt cytoplasmatiske blemmer granulocytter5. Funksjonene osmotisk og ioniske bufferstørrelsen kan også endres for å styre graden av cellen homogenisering. I tillegg kan aggressivitet av mobilnettet avbrudd kontrolleres ved å justere nitrogen trykket. Moderate trykk reduserer forstyrrende kraften å bevare kjerner, mitokondrier og andre organeller i intakt tilstand, mens høytrykk forstyrrer disse organeller. Brock et al. rapportert suksess med avbrudd i rotte Basophilic leukemi celler mens de fleste kjerner intakt på 350 psi med hypotonisk buffer10, som danner grunnlaget for nitrogen press brukes i våre nåværende protokollen.
Begrensninger av nitrogen kavitasjon inkluderer det faktum at homogenisering uniform gjennom prøvene og ulike membran strukturer kan produsere blemmer i lignende størrelser; Dette kan komplisere ytterligere separasjon av plasma membran, glatt microsomes, endosomes og Golgi membraner av rente-sonal tetthet gradert sentrifugering. En annen bekymring er at organeller bli relativt skjøre etter homogenisering på grunn av brudd innenfra. Dermed krever denne metoden forsiktig optimalisering å hindre organelle brudd i senere manipulasjoner. Vi som mål å ta opp noen av disse problemene i denne studien.
Separasjon av cytosolic og membran brøker med sentrifugering har blitt utforsket i begrenset rapporter detaljering partisjonering av protein fraksjoner med en håndfull protein markører15,16. Våre metoden genererer en grov separasjon av løselig og membran-bundet proteiner og involverer ikke isolering av bestemt organeller. Likevel, er det fortsatt et gyldig bekymring at homogen blemmer av ulike membraner produsert av kavitasjon kan påvirke effektiviteten av separasjon av ultracentrifugation. Vi presentert en omfattende undersøkelse av immunoblots av isolasjon og partisjonering av felles subcellular organeller etter fraksjoneres med våre protokollen. Som forventet, rent cytosolic proteiner som RhoGDI er utelukkende i løselig brøk og transmembrane proteiner i plasma membranen (PM) som EGFR og Na+/K+ ATPase, ble gjenopprettet i pellet. Transmembrane proteiner på organeller som ER, mitokondrier, Golgi og lysosomer gjenvunnet også i det pellet, bekrefter at integrert membran proteiner fra ulike membraner og organelles kan være vellykket segregert fra løselig proteiner med vår metode. Denne grunnleggende validering er avgjørende for videre analyse av ytre membran proteiner, som er det viktigste formålet med denne protokollen.
De fleste av ytre membran proteiner finnes i begge cytosolic og membran fraksjoner. Selv om dette er ofte en sann representasjon av deres lokalisering, kan i noen tilfeller det representere artefactual omfordeling av disse proteinene fra cytoplasmatiske overflaten av membraner til løselig brøk i løpet homogenisering prosessen, siden den styrken i tilknytningen membraner er ikke så sterk som integrert membran proteiner. Om nitrogen kavitasjon minimerer potensielle omfordeling ved å utsette cellene engangs, milde forstyrrelser, bør man være oppmerksom på slike gjenstander av biokjemiske fraksjoneres og fokus på endringene i partisjonering av proteiner mellom cytosolic og membran fraksjoner over eksperimentelle forhold. Likevel er undersøkelse av ytre membran proteiner på ulike stadier av endosomal modning mulig med denne metoden. EEA1, en Rab5 effektor som formidler dokking av clathrin-belagt blemmer til tidlig endosomes, regionaliserer til cytoplasmatiske overflate tidlig endosomes og ble gjenopprettet i pellet brøken. Sen-endosome-relaterte Rab7 og Rab9 proteiner er også i pellet fraksjonen. Det er imidlertid en betydelig mengde Rab7/9 i stoffer. Fordi RabGDI kan samhandle med prenylated Rabs og gjengi disse ellers uløselig proteiner cytosolic, pleier Rab proteiner å være mer cytosolic enn andre endosome-relaterte eksterne membran proteiner.
Å karakterisere kjernefysiske og organelle integritet med homogenisering av nitrogen kavitasjon, vi immunoblotted isolert fraksjoner for både luminal og cytoplasmatiske avdelinger. I denne analysen var er calregulin fullt ut i løselig brøkdel, viser at ER avbrytes til skjemaet microsomes og dermed lekker luminal innhold. Gitt at en halvparten av det totale arealet av membranen i en eukaryot celle omslutter labyrintiske mellomrom er, er det overraskende at dens nettverk av sac-lignende eller rørformet struktur ikke beholdes under utvidelse av nitrogen bobler. På den annen side, vår analyse mitokondrie integritet etter kavitasjon viser klart avhengighet av hvilken celle som observerte vi F1-ATPase, et protein som er perifert knyttet indre membran av mitokondriene, i cytosolic fraksjonen i varierende grad (~ 35% for HEK-293 og Jurkat, 2% for NIH-3T3). Dette indikerer at nitrogen kavitasjon på 350 psi med hypotonisk buffer garanterer ikke mitokondrie integritet. Andre har rapportert at for å bevare mitokondrier, bør kavitasjon utføres på trykk lavere enn 150 psi17. Derimot fant vi at catalase forblir i lumen av peroxisomes. Intriguingly, er kjernefysiske proteiner observert i PNS og pellets fraksjoner. Spesielt HDAC1, en histone deacetylase tilstede gjennom nucleoplasm, er fraværende i løselig fraksjonen, indikerer at kjernefysisk integritet ikke er i fare. Dette tyder på at den kjernefysiske konvolutten ikke er utløst av kavitasjon, som man ville forvente at HDAC1 i solubLe fraksjon i det scenariet. Det er sannsynlig at kjerner ikke er fullstendig fjernet under av PNS forberedelse, og protein forblir i pellet etter ultracentrifugation. Denne sannsynligheten støttes av det faktum at ingen DNA-lekkasje er oppdaget i løselig fraksjonen. Vi konkluderer, derfor det bruker hypotonisk homogenisering buffer under kavitasjon på ~ 350 psi med tillegg av Mg2 + er kjøpedyktig bevare kjernefysiske integritet i flere linjer.
Våre resultater viser også at ribosomer samler helt i membranen pellet fraksjonen, antyder at med gratis ribosomer i cytoplasma som hint til ER membraner kan være helt sedimented i en ikke-sukrose-pute buffer etter sentrifugering 350.000 x g for 1 h. likeledes, identifikasjon av autophagy-relaterte protein 12 (Atg12)-Atg5 konjugert som en markør av autophagosomes, avslører streng segregering pellet fraksjoner. Sin tilstedeværelse i stoffer skyldes det faktum at kovalente-vedlegget Atg12 og Atg5 foran autophagosomes formasjon. Cellen cytoskjelett proteiner er vanskelig å vurdere på grunn av ex vivo polymerisasjon. Dette fenomenet kan reduseres med en avslapning buffer men protokoll beskrevet her, tubulin er sannsynligvis polymerized ex vivo på chelation kalsium 18. I forberedelsene er tubulin funnet i pellet foreslå polymerisasjon mens begrepsordbok finnes i både P og S fraksjoner.
Betegner potensielle fordelene av nitrogen kavitasjon i homogenisering effektivitet, gjennomgått vi noen vanlige mekanisk avbrudd teknikker. Metoder optimert for vevsprøver som blender eller mørtel/pistil ble ikke vurdert. Sonication ble også utelatt som det er vanskelig å forstyrre overflaten membranen mens beholder interne organeller. Vår analyse fokusert på følgende: fryse-tine, p passasje og Dounce homogenisering, som de er enkle å utføre og krever ikke spesielt utstyr som en kulelager homogenizer. Jurkat celler ble brukt i denne analysen på grunn av sin lille størrelse, som gjør dem vanskelig å homogenize effektivt med tradisjonell flytende klipping teknikker som er avhengige av fortolling, som p passasje og Dounce. Bedømt av konsentrasjonen av totale protein utvunnet, fant vi at Cellestørrelse uavhengig avbrudd metoder som nitrogen kavitasjon og fryse-Tin faktisk vise overlegen effektiviteten av protein utvinning. Lignende analyse med celler i større størrelser viste mindre forskjeller i homogenisering effektivitet, men nitrogen kavitasjon er fortsatt bedre enn alternative fysiske metoder testet (data ikke vist).
Mange cytosolic, endosomal og cytoskjelett proteiner gjenvunnet effektivt med alle testet metoder. Proteiner ER og Golgi gjenvunnet derimot optimalt ved hjelp av nitrogen kavitasjon. Litt lavere avkastningen av F-1-ATPase i nitrogen kavitasjon i forhold til de andre metodene kan gjenspeile at mitokondrier er mer sannsynlig å forbli intakt under kavitasjon, og derfor mer effektivt fjernet i sakte fart spinn brukes til å generere PNS. Observasjon at hexokinase 1, en ytre membran protein funnet både i stoffer og knyttet til den ytre mitokondrie membranen, opptrådt i motsatt mote i forhold til F-1-ATPase sannsynligvis gjenspeiler lability for foreningen av hexokinase 1 i forhold til F-1-ATPase, som er sequestered i mitokondrier. Viktigere, selv om det kan forstyrre celler med sammenlignbare effektivitet, ga alternative mekaniske avbrudd metoder relativt dårlig gjenvinning av visse ytre membran proteiner (hexokinase 1 og RAS). Dermed er kavitasjon våre homogenisering teknikk av valget for å undersøke delingen av ytre membran proteiner. Fordi Dounce homogenisering er mye brukt til å forberede intakt kjerner, brukte vi Dounce som en målestokk for å evaluere kjernefysiske integritet over andre mekaniske avbrudd metoder. I vår analyse bekrefter lignende nivåer av utvinning av HDAC1 proteiner at kjerner forblir intakt i Jurkat homogenates utarbeidet av nitrogen kavitasjon på ~ 350 psi med hypotonisk buffer.
Det var tydelig at bufferen homogenisering under nitrogen kavitasjon kan påvirke avbrudd effektivitet og organelle integritet. Mens sammensetningen av homogenisering bufferen skal være optimalisert kravene til det aktuelle programmet, er det verdt å merke seg at forskere utfører nitrogen dekompresjon av dyr vev bruker buffer med en lav osmotisk trykk trekke ut kjernefysiske innholdet. Jeger og Commerford viste kjerner hevelse og ruptur når løsningene var fortynne og kjerner bevaring ved isotonic løsninger7 (som kan oppnås ved enten å legge uorganiske salter som natriumklorid eller organisk solutes som sukrose eller glyserol). Standard isotonic bufferen for å isolere subcellular organeller enn kjerner fra pattedyrceller er 0,25 M sukrose som inneholder 1 mM EDTA og bufret Tris, HEPES eller Tricine ved pH 7.0 – 7,6. Men ikke alle kultur celler kan være effektivt homogenisert i en av isotonic bufferne. Hypotonisk buffer (vanligvis 10 mM Tris, HEPES, etc.) er ofte brukt til å gi nødvendige osmotisk stress til visse celletyper å oppnå komplett homogenisering. Men som nevnt før, pleier hypotonisk buffere å gjengi kjerner sårbar og utsatt for lekkasje av DNA når EDTA er inkludert. For å fremme kjernefysiske integritet, erstatte vi EDTA med KCl og lave konsentrasjoner av divalent kasjoner som MgCl2 eller MgSO4. Mg2 + foretrekkes vanligvis over Ca2 + fordi sistnevnte kan aktivere bestemte phospholipases og proteaser og hemme RNA polymerase. Når kavitasjon er ferdig, EDTA eller EGTA kan legges til homogenates til chelate kasjon, eventuelt å hemme metalloproteases.
Jurkat cellene viser en relativt stor kjernen til cytoplasma forhold, noe som gjør dem til et ideelt celle linje å studere kjernefysiske integritet. Økningen av homogenisering effektivitet ved hjelp hypotonisk buffer er minimal sammenlignet til isotonic bufferen med NaCl. Imidlertid gjenoppretter kavitasjon i en isotonic buffer med sukrose omtrent halvparten proteiner trukket ut ved hjelp av en hypotonisk buffer motpart. Dette er neppe være en direkte følge av isotonicity, og avviket mellom bruke NaCl og sukrose for å oppnå isotonicity krever videre etterforskning. En mulig forklaring er at salt forstyrrer elektrostatisk interaksjoner mellom proteiner mens sukrose ikke. Dermed, selv på den samme tonicity, NaCl har en aktivitet som er relevant for protein utvinning som sukrose mangler. Wi. hensyn til å bevare kjernefysiske integritet, fant vi økt fibrillarin proteiner med isoton buffere, til tross for isotonisk buffere teoretisk blir mer beskytter av kjerner. Merkelig, mitokondrie brøken var mer effektivt hentet med isoton buffer med NaCl, tyder på at lav salt forhold kan være ikke mitokondrier utvinning. Vurderer kavitasjon med hypotonisk buffer oppnår den beste balansen mellom homogenisering effektivitet og kjernefysiske integritet, blir hypotonisk bufferen bufferen valgfrihet i våre Protokoll for kavitasjon. Men forsiktighet vi leserne at ingen buffer er en garanti for optimal homogenisering resultater. Våre protokollen bør tjene som en mal for optimalisering og pilot testing med ønsket buffere, linjer av interesse, og andre variabler (press, buffer komposisjon, etc.) må opprettes for best resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av GM055279, CA116034 og CA163489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
References
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
