Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l'intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all'immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo.
Abstract
La fusione degli scaffali palatali secondari per formare il palato secondario intatto è un processo chiave nello sviluppo mammifero e la sua rottura può portare a palato secondario, una comune anomalia congenita negli esseri umani. La fusione secondaria del palato è stata ampiamente studiata portando a diversi meccanismi cellulari proposti che possono mediare questo processo. Tuttavia, questi studi sono stati eseguiti principalmente su tessuti embrionali fissi a tempi progressivi durante lo sviluppo o in colture fisse esplorate analizzate a tempi statici. L'analisi statica è limitata per l'analisi di processi morfogenetici dinamici come una fusione di palato e quali tipi di comportamenti cellulari dinamici mediare la fusione palatale è incompleta. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di ex vivo fusione palato secondario in embrioni di topo. Per esaminare i comportamenti cellulari della fusione del palato, la chirurgia Keratin14 specifica epiteliale è stata usata per etichettare le cellule epiteliali del palato in ROSEmbrioni A26-mTmG flox reporter. Per visualizzare l'actina filamentosa, sono stati utilizzati topi reattore Lifeact-mRFPruby . L'imaging in vivo di fusione secondaria del palato è stato eseguito dissezionando i ripiani secondari palatali recentemente aderiti di embrioni di fase di embrione (E) 14.5 e coltivando in supporti contenenti agarosio su un piatto di fondo in vetro per consentire l'imaging con un microscopio confocale invertito. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato una varietà di nuovi comportamenti cellulari durante la fusione secondaria del palato. Un apprezzamento di come i comportamenti cellulari distinti sono coordinati nello spazio e nel tempo contribuiscono notevolmente alla nostra comprensione di questo processo morfogenetico dinamico. Questo protocollo può essere applicato alle linee del topo mutante o alle colture trattate con inibitori farmacologici per migliorare ulteriormente la comprensione di come viene controllata la fusione secondaria del palato.
Introduction
La fusione tissutale è un passo importante nello sviluppo di organi multipli. I principali difetti della nascita umana, quali il labbro e il palato, la bifida delle spine e le malformazioni del cuore possono derivare da difetti nella fusione tissutale 1 . La fusione del palato secondario del mouse è stata ampiamente studiata per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la fusione tissutale nello sviluppo 2 , 3 , 4 . Nel topo, lo sviluppo del palato secondario inizia a circa E11.5 con l'espansione di un ripiano secondario palatale da ognuno dei processi bilaterali maxillari. La crescita iniziale degli scaffali palatali si verifica verticalmente lungo la lingua, fino a circa l'E14.0, durante i quali gli scaffali palatari si elevano orizzontalmente sopra la lingua. La crescita medialmente diretta produce un contatto fisico tra l'epiteli apposita dei due ripiani palatari, formando l'epitelio della medianaAl seam (MES) a E14.5. Il MES interveniente deve essere rimosso tra gli scaffali palatali secondari per consentire la confluenza mesenchimale e lo sviluppo di un palato secondario intatto, completamente fuso, da E15.5 3 .
Come uno strato di cellule MES epiteliale condiviso tra due mensole palatine separate e poi rimosso per ottenere confluenza mesenchimale, è stata una questione centrale nello sviluppo del palato. Sulla base di studi sul microscopio istologico e elettronico del microscopio (EM), sugli studi sulla cultura esplosiva e sugli esperimenti funzionali di genetica del mouse, sono stati implicati diversi comportamenti di cellule fondamentali in questo processo. Le proiezioni simili a filopodie dall'epitelio mediale del bordo MEE di ogni mensola palatina facilitano il contatto iniziale 5 , 6 , seguito da intercalazione di queste cellule epiteliali a un singolo MES 6 , 7 condiviso. Rimozione della conseguente MES condivisaÈ stato proposto di procedere con tre meccanismi non esclusivi. Gli studi iniziali che impiegavano osservazioni istologiche e tracciamento lineare ex vivo con coloranti vitali indicavano che la MES potrebbe essere rimossa dall'epitelio alla transizione mesenchimale (EMT) delle cellule MES 8 , 9 , anche se più recentemente il tracciamento genetico delle cellule epiteliali ha aumentato l'incertezza Il contributo a lungo termine delle cellule epiteliali al mesenchimico palatale 10 , 11 , 12 . Un numero significativo di cellule apoptotiche e una riduzione del loro numero in alcuni mutanti che non subiscono una corretta fusione di palato hanno portato all'idea che l'apoptosi può essere un fattore importante della dissoluzione MES 2 , 3 . Infine, basata inizialmente su studi che coinvolgono l'etichettatura epiteliale e l'osservazione statica a tempi progressivi, le cellule MESSono stati proposti di migrare nelle dimensioni oronasali e anteroposterior 11 , 13 , ma tali comportamenti dinamici di cellule sono stati inizialmente non confermati a causa di una incapacità di osservarli nel tessuto palatale vivo. Recentemente siamo stati in grado di osservare direttamente questi comportamenti sviluppando una nuova metodologia di imaging dal vivo che combina i metodi genetici del mouse con l'etichettatura fluorescente con l'imaging live in confocale di scaffali palatali esplorati.
In primo luogo, per visualizzare i comportamenti cellulari dinamici nelle cellule epiteliali del palato durante la fusione del palato, abbiamo generato un mouse reporter specifico epiteliale attraversando i topi flox ROSA26-mTmG con i topi Keratin 14 -cre 14 , 15 . L'imaging in diretta confocale della cultura esplante del palato degli embrioni risultanti ha confermato alcuni comportamenti cellulari proposti in precedenza e ha identificato nuovi eventi nel processo di fusione 6 6 , 16 . Questo metodo di imaging può essere utilizzato con altre linee di reporter; Abbiamo utilizzato i topi transgenici Lifeact-mRFPruby 17 , 18 per esaminare le dinamiche citoscheletriche dell'atina durante il processo di fusione. Altri giornalisti possono anche essere impiegati per osservare altri aspetti specifici della fusione di palato e questo metodo può essere adattato sia alla microscopia confocale a scansione laser che alla microscopia confocale del disco di filatura, a seconda delle esigenze di imaging e della disponibilità del microscopio. L'imaging in diretta sta diventando sempre più un approccio fondamentale nella biologia dello sviluppo. PartiLa morfogenesi craniofacialica è complessa e le difese di nascita umane che colpiscono il viso sono comuni. Questo metodo di imaging live in confocale aiuterà a consentire una migliore comprensione dei meccanismi fondamentali di sviluppo fondamentali e delle origini delle anomalie craniofacciali umane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità ai protocolli dell'Università della California a San Francisco, istituto di cura e uso degli animali.
1. Preparazione di Media Live Imaging
- Preparazione di supporti di coltura liquida
- Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
NOTA: Il supporto di imaging live è stato appena fatto prima dell'immagine. Questo supporto contiene fenolo-rosso che può portare alla fototossicità lungo i corsi di imaging in tempo reale. Sostituendo per i media senza fenolo-rosso può migliorare l'imaging a lungo termine.
- Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
- Preparazione della soluzione di agarosio a bassa fusione
- Sciogliere 350 mg di agarosio a basso contenuto di fusione in 10 ml di acqua distillata autoclavata per ottenere una soluzione di riserva del 3,5%.
- Mescolare bene la soluzione agarosica e incubare a 70 ° C in un bagno d'acqua per sciogliere completamente l'agarosio.
- Riscaldare la soluzione agarosica in un bagno d'acqua di 37 ° C prima di aggiungerlo al supporto di imaging in diretta.
- Aggiungere 1 ml della soluzione di stock di agarosio a 5 ml del mezzo di imaging vivente liquido per ottenere una concentrazione finale (0,6%).
- Conservare i supporti con agarosio in un bagno d'acqua di 37 ° C per prevenire la solidificazione prematura.
2. Preparazione della cultura esplosiva del palato per l'imaging live
- Dissezione degli scaffali palatali secondari E14.5 recentemente aderiti
NOTA: nella nostra esperienza la fusione di immagini richiede l'avvio con una coppia leggermente aderita di mensole palatine; Questa aderenza evita movimenti esplosivi che impediscono la fusione durante la formazione dell'immagine.- Dissectare gli embrioni di stadio E14.5 in una soluzione salina con tampone fosfato (PBS) e scegliere la proteina fluorescente verde (GFP) - esprimere (daK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) o (Red fluorescente proteina) RFP- express (da Lifeact-mRFPruby ) embrioni positivi usando un microscopio di dissezione dotato di lampade fluorescenti. Trasferire il tessuto in un materiale pre-riscaldato di coltura in vivo senza agarosio.
- Tagliare la testa dell'embrione e rimuovere l'area superiore del cervello usando due pinze fine n. 5 ( Figura 1 A-C ). Usare una pinza n. 5 per tenere l'embrione mentre l'altro n. 5 pende per tagliare i tessuti extra fuori dagli scaffali palatari.
NOTA: Le forbici raffinate possono essere usate per tagliare la testa dell'embrione (il primo passo) anziché una pinza No. 5. Tuttavia, due pinze fine No. 5 daranno un migliore controllo per eseguire tagli precisi. - Rimuovere la mandibola attentamente senza danneggiare mensole palatali come mostrato in Figura 1 D e 1E . Per ridurre la possibilità di danneggiare i palati, mantenere la lingua attraverso la dissezione della mandibola, fDopo aver attentamente rimosso la lingua.
- Dopo aver rimosso la mandibola e la lingua, esaminare il lato orale del palato secondario con uno stereomicroscopio con fluorescenza per confermare il forte segnale reporter nel MES ( Figura 1 M ).
- Disseccare le parti posteriori, tra cui l'indice e lo stelo del cervello dopo aver rimosso la mandibola e la lingua ( Figura 1 F ).
- Rimuovere entrambi i maxilla con mensole palatine aderenti ( Figura 1 G ).
- Tagliare il tessuto anteriore superiore della ganascia mantenendo intatte sia il palato primario che quello secondario ( Figura 1 H e I ).
- Rimuovere il setto nasale sul lato nasale dell'esplosione esponendo la MES.
NOTA: Queste ultime fasi di dissezione richiedono un'attenta attenzione per non disturbare i contatti tra due ripiani secondari palatali. La rimozione del setto nasale aiutaRidurre il segnale di sfondo da altre aree e ridurre anche il movimento verticale dei tessuti, consentendo immagini stabili ( Figura 1 J-L ). - Dopo aver disseccato gli scaffali palatali, esaminare nuovamente il segnale del reporter della linea mediana per assicurarsi che non vi siano danni allo strato epiteliale tra i tessuti.
- Impostazione di esplanti del palato nel piatto di coltura con supporti di imaging live
- Mettete i supporti di imaging in diretta in un piatto di fondo in vetro da 35 mm.
- Mettete le mensole palatali scoperte rivolte verso il basso come vicino al fondo del vetro, per quanto possibile per l'imaging con un microscopio confocale invertito ( Figura 1 N ).
- Posizionare i pellets di ghiaccio secco su una superficie conduttiva vicina al piatto di coltura per accelerare la solidificazione agarosa diminuendo rapidamente la temperatura o mettere il piatto di coltura a 4 ° C. Una piastra fredda, come quella utilizzata per l'inserimento di paraffina, potrebbe anche essere utilizzata a questo stage.
NOTA: quando si utilizza ghiaccio secco, il cambiamento di agarosio deve essere monitorato con attenzione per evitare il congelamento.
3. Confocal Time-lapse Imaging di Palate Explant
- Imaging e acquisizione dati
- Dopo che l'agarosio è stato semi-solidificato, montare il piatto di coltura in un microscopio confocale invertito dotato di camera di incubazione a 37 ° C. Utilizzare un microscopio confocale a luce bianca e un microscopio confocale a spinning del disco di osservazione delle cellule.
NOTA: Abbiamo utilizzato un supporto modificato contenente 15 mM HEPES senza gas CO 2 . - Mettere la gelatina di petrolio tra il piatto di coltura e la copertura usando una siringa per evitare l'evaporazione dei supporti ( Figura 1 N ).
NOTA: Alcune condensazioni in cima alla copertura del piatto di coltura dopo la coltura durante la notte (O / N) si verificano ma il volume dei supporti non cambia, suggerendo che la gelatina di petrolio evita che i media si evaporino. - Individuare la regione di interesse con obiettivi di ingrandimento ridotti (10x) e utilizzare obiettivi di ingrandimento più elevati (obiettivo 20x con zoom digitale 3x o obiettivo 40x con Immersol W) per l'imaging in tempo reale.
NOTA: I ripiani secondari secchi secondari non sono piatti. Il palato secondario è una struttura curva e questo rende difficile l'immagine dell'intera MES nello stesso piano. L'imaging a basso ingrandimento (10x) può consentire l'imaging completo del palato, ma gli obiettivi 40x forniranno una migliore risoluzione delle immagini per esaminare movimenti cellulari dettagliati in posizioni più profonde Z. La curvatura è alta nella regione del palato medio. Il palato anteriore e posteriore sono relativamente piatti rispetto al palato medio. Spesso immaginiamo verso la metà anteriore del palato secondario per evitare regioni di massima curvatura. - Scansiona più stack Z con 5 μm ogni passo per 16-24 ore usando una giusta eccitazione laser (488 nm per GFP e 532/561 nm per RFP) ( Figura 2 ).
NOTA: Per ridurre la fototossicità potenziale, utilizzare il minimo potere laser e il tempo di esposizione. Ciò è importante soprattutto in caso di imaging multicolore. Utilizza il 22% del 552 nm di potenza laser per la membranaTomato (mT), il 30% della potenza laser di 495 nm per la membranaGFP (mG) e il 25% della potenza laser 561 nm per la membranaRFP. Il tempo medio di esposizione era di 550 ms. - Utilizzare il software di analisi delle immagini per eseguire il monitoraggio delle celle e l'analisi quantitativa.
- Dopo che l'agarosio è stato semi-solidificato, montare il piatto di coltura in un microscopio confocale invertito dotato di camera di incubazione a 37 ° C. Utilizzare un microscopio confocale a luce bianca e un microscopio confocale a spinning del disco di osservazione delle cellule.
4. Analisi delle immagini dei dati
NOTA: qui, è stato usato Imaris. Analisi analoghe di dati possono anche essere eseguite con pacchetti software ImageJ o Volocity.
- Rendering di superfici tridimensionali (3D) dalle sequenze di immagini.
NOTA: Questa sezione consente di generare una superficie da un filmato generato con un segnale GFP a membrana.- Fai clic su Modifica | Mostra la regolazione del display e utilizzare il cursore di istogramma per regolare l'intensità del segnale in modo che il segnale della membrana sia chiaroFuori la lunghezza del film ( Figura 3 A ).
- Correggere il segnale sbiancato utilizzando l'immagine Lavorazione | Correzione di attenuazione . Regolare i valori di Intensità anteriore e Intensità in modo che il segnale della membrana sia chiaro per tutta la lunghezza del filmato. Alcuni tentativi ed errori potrebbero essere necessari per l'impostazione di questi valori.
NOTA: Il valore di Intensità Indietro (profondità Z) sarà inferiore al valore dell'intensità del fronte (valore della superficie Z) a causa della limitata penetrazione del laser. Questi valori possono quindi essere modificati anche per normalizzare l'intensità del segnale nella serie Z. Entrambi i valori possono essere regolati per ottenere la correzione della candeggina. La correzione dell'attenuazione è anche chiamata correzione dell'attenuazione delle emissioni 19 . - Per generare una superficie dal segnale della membrana, selezionare Surpass | Superfici , scegli un canale di origine e un tipo di soglia (intensità assoluta) e sotto le impostazioni di algoritmolect Segmentare solo una Regione di Interesse E infine il processo dell'intera immagine , seguito dalla scorrimento della freccia in avanti; Continuare a spingere la freccia in avanti (utilizzare le impostazioni predefinite o specificare i livelli di dettaglio della superficie di superficie e il metodo di soglia di soglia per prova ed errore), verificando se la superficie generata rifletta il segnale di fluorescenza. Per specificare una regione di interesse, selezionare la regione e le ore da rendere tratteggiando le posizioni X, Y, Z.
NOTA: selezionare Processo dell'intera immagine finalmente in modo che le regolazioni e le soglie saranno applicate in tutto il filmato. - Creare una superficie facendo clic nuovamente sul pulsante freccia in avanti. Quindi regolare la soglia cambiando l'istogramma in Filtri per corrispondere al segnale della membrana.
- Dopo la generazione della superficie, scegliere la superficie in Superfici / Impostazioni per visualizzare il segnale di superficie e completare il processo di generazione della superficie spingendo il doppio forwPulsante freccia ARD ( Figura 3 B ).
- Vai a Surface | Modificare e fare clic su Maschera tutte le Proprietà maschera per generare un'immagine di canale mascherata.
- Dopo aver fatto clic su OK, la finestra Maschera si apre automaticamente; Selezionare il canale GFP, impostare voxels al di fuori della superficie al valore massimo di intensità del segnale (trovato nella regolazione Edit | Display ) e voxels all'interno della superficie al valore minimo di intensità GFP Modifica | Regolazione della visualizzazione ), in Impostazioni maschera per generare una maschera del segnale a membrana.
- Poiché la maschera del segnale della membrana verrà visualizzata in visualizzazione Volume , generare immagini invertite usando Image Processing | Contrasto cambiamento Inverti ( Figura 3 C ).
- Individuazione di macchie da immagini in superficie invertita.
NOTA: questa sezione consente di avere il centro di ciascuna cellaContrassegnato da un punto unico e tracciato nello spazio e nel tempo.- Seleziona Scena superamento. | Spots | Crea ; In Impostazioni di algoritmo selezionare il segmento solo una regione di interesse , il processo dell'intera immagine in ultima analisi e le tracce di punti (nel tempo) .
- Fare clic sulla freccia in avanti e specificare una Regione di interesse; Selezionare la regione e le ore per la traccia delle macchie; Continuare a spingere la freccia in avanti, scegliere il canale mascherato come canale di origine e determinare il diametro stimato di punti XY.
- Facendo clic sul pulsante freccia in avanti si apre automaticamente una finestra del filtro; Regolare la soglia di rilevamento del puntatore modificando i valori nell'istogramma per generare punti singoli al centro di ciascuna cella ( Figura 3 D ).
- Facendo clic sul pulsante freccia in avanti si apre la finestra Algoritmo , scegliete il modello di monitoraggio del movimento autoregressivo 20 e specificate il massimo tracking diPosizione e la dimensione massima del gap per collegare tracce che divengono discontinue per un breve periodo di tempo.
- Facendo nuovamente clic sul pulsante freccia in avanti si apre la finestra Filtri, imposta la soglia di durata della traccia regolando l'istogramma in modo che ogni cella venga tracciata. Facendo clic sul pulsante a doppia freccia avanti, verrà finalizzato il rilevamento del punto.
- Per correggere la deriva del tessuto, fare clic su Spots | Track Editor e selezionare Corretto Drift . Una finestra di algoritmo si apre automaticamente; Selezionare la deriva di transizione selezionata , Includi intero risultato e Correggere le posizioni degli oggetti .
- Generazione di diagrammi per analisi quantitativa.
NOTA: Lo Scatterplot del programma è uno strumento per generare grafici multidimensionali (X, Y, Z, Color e Scala) con più oggetti. Queste trame sono utili per visualizzare le tendenze di molti movimenti di cellule nel tempo.- Rendere 2D o 3D le tracce dei dati di tracciamento delle celle usando il comandoVantage-Aggiungi nuovo menu di trama Vantage ( Figura 3 E e 3F ).
- Seleziona Volume o Spots e scegli Crea / Categoria e Plot Type
- Regolare i valori di trama per generare diversi grafici Vantage.
- Esportare i grafici utilizzando la funzione Snapshot .
NOTA: i dati statistici possono anche essere esportati come fogli di calcolo per ulteriori analisi quantitativa facendo clic su Plot Numbers Area | Salva .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'imaging in vivo della cultura esplante del palato ha rivelato molteplici processi cellulari che mediano la fusione dei palati 6 . I contatti iniziali tra due cellule epiteliali sono fatti da protuberanze a membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando due strati epiteliali si incontrano, formano una MES stratificata a più cellule seguita da intercalazione per creare un unico MES a livello cellulare integrato attraverso la convergenza epiteliale ( Figura 2 A-2E e Figura 2 K-2O ). Le cellule epiteliali in livelli più profondi Z vengono inoltre progressivamente spostati verso il lato orale del MES che contribuisce al processo di convergenza epiteliale ( Figura 2 K ). La migrazione delle cellule posteriori è stata osservata nel mid-palate MES ( Figura 2 F-2J ). Inoltre, abbiamo trovato cellule epiteliali extEventi di fusione durante la fusione del palato suggerendo che le cellule epiteliali nel MES possono essere rimosse da questo processo attivo ( Figura 2 Q, 2T ). La cucitura epiteliale integrata si romperà in ultima analisi per ottenere confluenza mesenchimale ( Figura 2 S, 2T ).
Il palato Lifeact-mRFPruby ha mostrato dinamiche dinamiche dell'attin cytoskeletal durante la fusione del palato 6 . L'atina filamentosa si è arricchita al confine tra aree epiteliali e mesenchimali che formano una struttura a cavo lungo l'asse anteriore-posteriore ( Figura 2 K-2T) . La contrattilità di actomyosin conduce la convergenza epiteliale e la rottura del MES perché l'inibizione chimica dell'attività myosina o della polimerizzazione di actina ha bloccato questi processi dinamici 6 .
Hin-page = "1"> Il software è stato utilizzato per tracciare i comportamenti cellulari durante la fusione del palato. Il metodo migliore per il monitoraggio delle celle dipende dal segnale del reporter. Se viene utilizzato un mouse reporter nucleare, il programma può tracciare il centro dei segnali fluorescenti come centri cellulari 21 . Mouse reporter nucleare GFP come ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 può pertanto essere usato per etichettare le cellule epiteliali usando linee Cre-specifiche del tessuto; Nelle nostre mani, questo specifico reporter nucleare ha mostrato un più veloce sbiancamento sul lungo corso-corso utilizzato nell'immagine live. Pertanto, abbiamo utilizzato il reporter di membrana-GFP ( ROSA26-mTmG flox ) per seguire i movimenti delle cellule epiteliali nei nostri studi. Ciò richiede un metodo per identificare e tracciare le singole celle mediante un segnale a membrana. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato un metodo di monitoraggio delle celle modificato ( figura 3 e protocollo sezione 4 ).
Contenuto "per: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 1 : Vista schematica della dissezione del palato secondario del mouse. ( A ) Vista laterale dell'embrione del mouse E14.5. Per disseccare scaffali palatali, la testa è stata tagliata lungo la prima linea tratteggiata bianca, # 1. ( B, C ) Il cervello superiore (sopra la seconda linea bianca, # 2) è stato rimosso. ( D, E ) Vista orale della testa dissected. La mandibola inferiore (# 3) è stata disseccata e la lingua (# 4) è stata rimossa. ( F ) La parte posteriore della testa lungo la linea # 5 è stata tagliata. ( GI ) Entrambe le maxillae (# 6, # 7) e la parte anteriore della mascella superiore (# 8) sono state rimosse. ( JL ) Il setto nasale (# 9) è stato rimosso ( M ) i segnali GFP nel MES del palato dissecato da un K14-cre; ROSA26 embrione di mouse mTmG . ( N ) Impostazione delle immagini in tempo reale. Il lato orale del compagnoL'esplante era rivolto verso il basso per essere imaged con microscopio confocale invertito. MES è indicato con frecce bianche ( FI ). L'area fotografata è indicata da scatole puntate bianche in L e M. Barre di scala = 2 cm in A, 1 cm in BI, 500 μm in JM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Imaging live delle culture esplanti del palato. ( AE ) Imaging live del palato secondario anteriore da un K14-cre; ROSA26 mTmG esplante (profondità di 5 μm). La freccia in bianco mostra una protrusione della membrana da una cellula epiteliale ( FJ ) La rappresentazione in diretta del palato medio da K14-cre; ROSA26 mTmG esplante (5 μm dapprofondito lavoro). Le frecce bianche indicano la direzione delle migrazioni delle cellule dal palato anteriore al posteriore. ( KO ) Imaging vivo del palato anteriore da Explattente Lifeact-mRFPruby (profondità di 5 μm). Lo spostamento delle cellule epiteliali (freccia gialla) alla superficie orale e la convergenza per formare una MES integrata con strutture attiniche a cavo in linea mediana. ( PT ) Immaginazione in tempo reale del palato anteriore da esplosivo Lifeact-mRFPruby (profondità 25 μm). La freccia rossa indica un evento di estrusione delle cellule ( Q, T ). I punti di rottura futuri della cucitura sono indicati da due frecce verticali bianche in S e T. Barre scala = 20 μm. Tutti i dati sull'immagine live in questa figura derivano da esperimenti precedentemente pubblicati in 6 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
-page = "1"> 
Figura 3 : Analisi dei dati. ( AD ) Per tracciare le cellule epiteliali con segnali GFP a membrana da K14-cre; ROSA26 mTmG palate explant ( A ), Una superficie è stata generata dal rendering del volume del segnale GFP a membrana ( B ). Le immagini invertite sono state generate dopo aver mascherato la superficie creata ( C ). I centri cellulari sono stati identificati dalle immagini invertite utilizzando una funzione di rilevamento delle macchie in Imaris ( D ). ( E ) Le ricostruzioni 3D consentono di monitorare i movimenti delle cellule in più direzioni. A: un'analisi anteriore, P: posteriore, N: nasale, O: orale ( F ) 2D genera una trama di vantaggi che mostra le cellule che migrano dalla parte anteriore alla posteriore verso il mid palate MES. Barre scala = 20 μm in AD, 10 μm in EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video Figura 1: Imaging live di K14-cre; Palato anteriore del flox ROSA26-mTmG (profondità di 5 μm). Le immagini sono state catturate ogni 10 min (10 min / frame) per 16 h 20 min, barra di scala = 25 μm. Questo video è una diversa posizione Z di un film precedentemente pubblicato nel riferimento 6 . Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Video Figura 2: Imaging live di K14-cre; ROSA26-mTmG flox Palato medio (profondità di 5 μm). Le immagini sono state catturate ogni 15 min (15 min / frame) per 13 h 30 min, barra di scala = 25 μm. Questo video è stato precedentemente pubblicato nel riferimento 6 . Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Video Figura 3: Imaging vivo del palato anteriore Lifeact-mRFPruby (profondità di 5 μm).
Le immagini sono state prese ogni 10 min (10 min / frame) per 7 h 50 min. Barra di scala = 20 μm. Questo video è stato precedentemente pubblicato nel riferimento 6 . Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Video Figura 4: Imaging vivo del palato anteriore Lifeact-mRFPruby (profondità 25 μm).
Le immagini sono state prese ogni 10 min (10 min / frame) per 7 h 50 min. Barra di scala = 20 μm. Questo video è una diversa posizione Z di un film precedentemente pubblicato nel riferimento 6 . Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'imaging in tempo reale della morfogenesi tissutale con la cultura dell'esplosivo dell'organo 3D può fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari che non possono essere mostrati in analisi convenzionali di colorazione delle sezioni dei tessuti fissi. Utilizzando la cultura esplante in vitro del palato secondario embrionale del mouse, abbiamo osservato diversi comportamenti cellulari interessanti che ci hanno portato a proporre un nuovo meccanismo di fusione di palato che coinvolge la convergenza epiteliale e l'estrusione cellulare.
Una sfida comune negli studi di questo tipo è la fotopolimerizzazione mediante eccitazioni laser continue durante un lungo periodo di tempo. Nei nostri studi sono stati utilizzati un confocale di luce bianca e un microscopio confocale a disco di filatura. Alcune riduzioni dell'intensità del segnale nel tempo potrebbero essere corrette mediante correzioni di sbiancamento nel software di imaging (LAS-AF) (Protocollo 4.1). Poiché la correzione della candeggina è limitata, è importante ottimizzare accuratamente il tempo di esercizio e la potenza del laser in ogni sistema di imaging. Abbiamo anche controllatoChe la fusione del palato si verifica normalmente nei mezzi di imaging live dopo la cultura 3 giorni 6 .
Un secondo problema comune nell'immagine live è la deriva del tessuto. È fondamentale ridurre al minimo la deriva per ottenere immagini coerenti durante l'imaging in diretta poiché i cambiamenti nel piano focale possono confondere una comprensione dei cambiamenti morfogenetici nel tempo. Mentre il controllo della deriva termica può essere raggiunto in molti microscopi confocali (Focus definito nel microscopio), la deriva del tessuto rispetto al fondo del vetro non può essere corretto con questi metodi. L'utilizzo di agarosio, oltre a posizionare l'esplante contro il vetro, contribuisce a ridurre al minimo questo aspetto, ma bisogna prestare attenzione solo ad analizzare quei film che mantengono una posizione relativamente costante. Ciò può essere determinato seguendo più punti di controllo nel campo dell'immagine nel tempo per determinare se rimangono costanti, muovendosi con una tendenza simile o spostarsi in modo diverso. In una certa misura, utilizzando il post-elaborazione fuConsentono una correzione di una qualche deriva del tessuto nell'immagine live (Protocollo 4.2).
L'agarosio a bassa percentuale di fusione è stato impiegato in una concentrazione finale dello 0,6% nei mezzi di imaging live per immobilizzare i tessuti esplanti. Quando abbiamo sperimentato concentrazioni più elevate di agarosio, sembravano essere tali da compromettere la morfogenesi tissutale forse a causa di vincoli meccanici. È pertanto importante utilizzare la giusta concentrazione di agarosio per ridurre al minimo la deriva del tessuto senza disturbare la morfogenesi.
A causa della profondità di imaging confocale, questo metodo pone limiti nell'esame di piani Z molto profondi di fusione di palato. Utilizzando entrambi i microscopi confocali dei raggi WHITE LIGHT e di filatura, il segnale da profondità di 100 μm potrebbe essere imaged con successo anche se l'immagine cominciò a diventare noiosa e debole oltre questo limite. Poiché la fusione dei palati è un processo progressivo negli assi oronasali e anteroposteriali, proponiamo che le diverse posizioni di imaging consentano un'immagine di diversi deptHs di fusione di palato, ma la microscopia confocale di due fotoni o di fogli leggeri può essere impiegata in futuro per migliorare la profondità dell'immagine. Nella maggior parte dei nostri esperimenti, il lato orale degli esplanti del palato è stato imaged. L'imaging del lato nasale dell'esplosione del palato è difficile perché il setto nasale è fuso o molto vicino agli scaffali palatali secondari. Nei nostri tentativi di immagine di fusione dal lato nasale, era anche necessario rimuovere il tessuto extra nasale in modo che non interferisse con il segnale dall'epitelio del palato. Sebbene possibile, l'imaging del lato nasale dell'esplosione del palato è stato difficile perché la dissezione del setto nasale ha spesso causato danni agli esplanti del palato.
L'imaging in tempo reale di esplosivi del tessuto del mouse del giornalista è un metodo potente per studiare i meccanismi cellulari della morfogenesi tissutale durante lo sviluppo embrionale. Utilizzando tecniche di microscopia confocale e analisi quantitativa di imaging, possono essere basati processi di sviluppo come la fusione secondaria del palatoIndagato a livello cellulare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo M. Douglas Benson per le prime conversazioni riguardanti l'imaging secondario del palato. Riconosciamo anche David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) per il loro aiuto per regolare le condizioni di imaging in microscopia confocale. Apprezziamo Lynsey Hamilton (Bitplane) per suggerimenti utili per l'analisi quantitativa di immagini utilizzando il software Imaris. Questo lavoro è stato finanziato da NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
