Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56077
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4,5
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

מאמר זה מתאר שיטה להוספת צינור חלול בין גדמי חוט השדרה לאחר חיתוך מלא מילוי עם תאי שוואן (SCs), קרום המרתף להזרקה מטריקס על מנת לגשר, לקדם התחדשות האקסון על פני הפער.

Abstract

בין מודלים שונים עבור פגיעה בחוט השדרה אצל חולדות, המודל החבורה משמש לעתים קרובות ביותר כי הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעה בחוט השדרה האנושית. המודל המלא חיתוך, אמנם לא כמו קלינית הרלוונטיים כמודל החבורה, היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להעריך את האקסון התחדשות. במודל החבורה, קשה להבחין מחדש של אקסונים נבט או והבחירה הנכונה מצילה בשל נוכחותם של הנותרים רקמות שלאחר הפציעה. במודל חיתוך מלאה, שיטת הגישור יש צורך למלא את הפער וליצור המשכיות של rostral גדמי סימטרית על מנת להעריך את האפקטיביות של הטיפולים. ניתוח גישור אמין חיוני כדי לבדוק את התוצאה אמצעים על-ידי הפחתת מידת ההשתנות בשל שיטת. הפרוטוקולים המתוארים כאן משמשים להכנת שוואן תאים (SCs), תעלות לפני ההשתלה, חיתוך מלאה של חוט השדרה החזי רמה 8 (T8), הכנס את הצינור ולאחר השתלת SCs לתוך הצינור. גישה זו משתמשת גם בחיי עיר ג'לי של מטריקס קרום המרתף בזריקות עם השתלת SC המאפשר צמיחה האקסון משופרת על פני הממשקים rostral וסימטרית עם רקמת המארח.

Introduction

תיקון פגיעה בחוט השדרה הוא בעיה מורכבים ומאתגרים שיחייבו טיפול קומבינטורית אסטרטגיה מעורבים, לדוגמה, השימוש של תאים biomaterial לפרנס microenvironment חיובית ותפקוד התאים המושתלים האקסון התחדשות באתר של פציעה. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 , חיתוך מלא10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 מודלים משמשים לעתים קרובות כדי להעריך את ההשפעות של biomaterial מבוססי טיפולים גישור. היתרון של שימוש דגם hemisection הוא כי הוא מספק יציבות יותר הבונה גישור לעומת חיתוך מלאה. עם זאת, hemisection דגמים, קשה להוכיח התחדשות האקסון כפועל של השיטה הטיפולית יישומית בשל נוכחותם של רקמות והבחירה הנכונה מצילה. המודל חיתוך מלאה היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להדגים האקסון התחדשות.

חומרים טבעיים וסינתטיים שונים נחקרו לשימוש ג'ל להזרקה, ג'ל הקבועים מראש להציב החבורה או מודלים hemisection, או כצינור תקשורת מובנית לתוך hemisection או להשלים חיתוך מודלים (מפורט את הדעת23 , 24 , 25). בחיי עיר ג'לי של תערובת להזרקה מטריקס/SC יוצר ממשק יותר מתירני בין ההשתלה את כבל מארח האקסון המעבר26,27 לעומת מטריקס וג'ל מראש/SC שתלים 5 , 18 , 19 , 28. בחיי עיר ג'לי מותר המטריקס כדי ליצור מתאר סביב הממשקים המארח לא סדיר בעוד צינור קשיח ומובנים יותר או פחות moldable ג'ל הקבועים מראש לא יכול. צינור מובנים לעיתים קרובות מספק הדרכה קשר ויציבות השתל לעומת מטריקס להזרקה. הפרוטוקולים המובאת כאן לתאר את הליך כירורגי מנצל של מטריקס להזרקה קרום המרתף (למשל, matrigel, ראה הטבלה של חומרים, המכונה כמו מטריקס להזרקה כאן) והן צינור מובנים הערכת האקסון התחדשות במודל פגיעה בחוט השדרה ואינטלקטואלית.

Electrospun פולי-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) מיושר תעלות חלול סיביים משמשים בגישתנו ניסיוני. PVDF-TrFE הוא פולימר פיזואלקטריים יוצר מטען ארעי כאשר מכנית מעוות ולא הוכח לקדם התחדשות האקסון והסיומת neurite הן במבחנה29,30 , ויוו בתוך 31. Electrospinning היא שיטה נפוצה לגרדום פבריקציה נוספת שיכול לייצר במהירות אמין פיגומים סיביים באמצעות מגוון של פולימרים עם מאפיינים לשליטה כגון יישור סיבים, סיבים בקוטר עובי לגרדום עבור 33,32,עצבית ויישומים אחרים34.

מחקרים רבים של עכברוש SCs מושתלים לתוך חוט השדרה פגיעה באתרים הראו הטיפול היעילות5,9,18,19,20,21 ,26. השתלות אלה הן neuroprotective בשביל לרקמות שמסביב לפצע, לצמצם את גודל חלל הנגע, לקדם התחדשות האקסון לתוך הנגע/השתלת האתר ואת myelination של האקסונים מחדש. יכול להיות מושתלים autologously SCs אנושי, יתרון לעומת שאר עצביות הקשורות תאים24. לאחר ביופסיה במערכת העצבים ההיקפית, SCs יכול להיות מבודדת וטיהרו ו ותתנהל כדי הסכום הרצוי עבור השתלת לתוך בני אדם. עצמיים השתלת SC לחולים חוט השדרה נפגע הוכח כדי להיות בטוחים איראן35,36,37,38,39,סין40, ו ארצות הברית41,42. SCs ידועים להפריש מספר גורמים neurotrophic של מטריצה חוץ-תאית חלבונים חשובים לצמיחה האקסון וכדי לשחק תפקיד חיוני האקסון התחדשות לאחר פגיעה במערכת העצבים ההיקפית. מטרתנו כאן היא לתאר את שיטות אשר יכולים לחקור conduit עיצובים כדי לשפר את התוצאה של השתלת SC במודל חיתוך בחוט השדרה עכברוש שלם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חולדות פישר למבוגרים נקבות (180-200 גרם משקל) שוכנות על פי הנחיות משרד החקלאות ו- NIH. המוסדיים חיה אכפת שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי אישר כל ההליכים בבעלי חיים-

1. הכנה לפני השתלת

  1. הכנה Conduit-
    1. לחתוך לצינור 5 מ"מ אורך באמצעות סכין #10 תחת מיקרוסקופ ויבתר.
      הערה: הקוטר הפנימי של הצינור הוא בין 2.4-2.7 מ"מ; הקוטר החיצוני הוא בין 2.5-2.8 מ מ.
    2. מקפלים הצינור בעדינות לאורך הצד האורך ( איור 1 א'). חותכים ארבעה חתכים קטנים אודות 0.4 מ"מ לפחות 1 מ מ הפתחים של הצינור אותם על 1 מ מ בנפרד באמצעות שוליים ישרים Vannas מספריים ( איור 1B).
      1. נפרשים הצינור ( איור 1C) וחותכים בין שני חתכים לאורך באותו הצד יצירת שני חלונות זה לצד זה ( איור 1D). להבטיח כי החלונות יכול להיות נפתח ונסגר כראוי לאורך הצד נימולים.
    3. לחטא המוליכים 75% אתנול במשך 25 דקות בצלחת פטרי 10-ס מ. לשטוף מתים פעם אחת במשך 4 דקות עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ולהעביר המוליכים עם מלקחיים עקר פטרי ס מ-10 החדש. לשטוף את המוליכים פעמיים עם PBS 1 x 25 דקות כל אחד.
    4. לאחסן המוליכים ב- PBS 1 x עד הניתוח.
      הערה: תעלות רבים יכולים להיות מעוקר בבת אחת. לאחסן המוליכים mL 1.5 סטרילי נפרד צינורות צנטריפוגה כדי לשמור על סטריליות.
  2. ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP)-הכנה תאי שוואן (SC)
    1. להכין את תרבויות SC מטוהרים מן העצבים בשוקה של פישר נקבה בוגרת חולדות כפי שתואר לעיל 43. בסיום שלב זה, לוח ה-SCs-פולי-L-ליזין (PLL)-מצופה ס מ-10 פטרי ולתחזק במדיום D10/3 מ'; SCs אלה מוגדרים מעבר 0-
      הערה: D10/3 מ' בינוני מורכב מהפעולות הבאות: 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת), יותרת המוח µg/mL 20 לחלץ, forskolin 2 מיקרומטר, 2.5 ננומטר heregulin ב Dulbecco ' s ששינה הנשר ' s בינוני (DMEM).
    2. לחדש D10/3 מ' טריים בינונית (7 מ ל/10-ס מ פטרי) כל 3-4 ימים.
    3. תרבות פיצול SC ברגע שהוא מגיע למפגש 70-80%.
      1. בינוני להסיר ולשטוף פעמיים עם האנק ' s מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) ללא סידן או מגנזיום.
      2. להוסיף 5 מ של 0.25% טריפסין/EDTA כל ס מ-10 פטרי, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      3. הוסף 5 מ של D10 בינוני (10% FBS ו 1% עט/דלקת ב- DMEM) לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL לנטרל טריפסין.
      4. בעדינות pipet טריפסין/EDTA פתרון לתוך פטרי צלחת מספר פעמים להתנתק SCs. להסיר את המתלים תא מתוך קערה ולמקם אותו לתוך הצינור צנטריפוגה מוכן בשלב הקודם. לשטוף את הצלחת עם 5 מיליליטר D10 בינוני ומניחים אותו לתוך הצינור צנטריפוגה כדי למקסם את הקציר תא.
      5. Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום D10/3 מ מ ל 4 עבור כל פיצול פטרי.
      6. לוותר על 1 מ"ל של השעיה SC ו 6 מ של בינוני D10/3 מטר לתוך צלחת פטרי 10-ס מ; כל פיצול פטרי תגרום 4 צלחות פטרי. SCs אלה מוגדרים מעבר 1.
      7. לחדש D10/3 מ' טריים בינונית היום לאחר ציפוי, כל 3-4 ימים לאחר ציפוי.
      8. פעם ה-SCs להגיע למפגש 70-80%, חזור על שלבים כ- 1.2.3.1 כדי 1.2.3.6. ה-SCs נמצאים על המעבר 2.
    4. מגלי ה-SCs פעם להגיע למפגש 50%, עם וקטור lentiviral קידוד GFP ב- D10/3 מ' בינוני בן לילה-ריבוי של זיהום של 30 כאמור תיאר 44 , 45 .
    5. לחדש בינונית טרייה-D10/3 מ' יום למחרת, כל 3-4 ימים לאחר ציפוי.
    6. לאחר ה-GFP-SCs להגיע למפגש 70-80%, חזור על שלבים כ- 1.2.3.1 כדי 1.2.3.5 אבל resuspend ה-GFP-SCs ב 6 מ של בינוני D10 במקום. לוותר על µL 15 של השעיה GFP-SC לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 מ"ל ולהוסיף µL 15 של 0.4% trypan blue פתרון. קפיצי הצינור צנטריפוגה בעדינות, לוותר על 10 µL של התערובת לתא של השקופית ספירת תאים.
      1. מקום השקופית לתוך מונה הניתן תא אוטומטיות ולקבוע את צפיפות תא.
    7. Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend 1.5 מ של מדיום מקפיא עבור כל 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1.5 מ ל GFP-SC השעיה לתוך המבחנה קריוגני, הקפאת ב-80 o C עבור פחות 24 שעות לפני העברת חנקן נוזלי לאחסון.
      הערה: הקפאת בינוני: 25% FBS ו- 8% דימתיל סולפוקסיד ב- DMEM.
    8. להפשיר GFP-SCs שבוע לפני הניתוח.
      1. להוסיף 10 מ"ל D10 בינוני לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל.
      2. להפשיר צלוחיות של GFP-SCs קפוא באמבט מים-37 o C עד חלקית הקרת.
      3. להסיר את המתלים GFP-SC המבחנה קריוגני ולמקם אותו לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ ל בכיכר 1.2.8.1. בעדינות pipet הפתרון למעלה ולמטה שוב ושוב.
      4. Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום D10/3 מ מ ל 4 עבור כל בקבוקון הקרת.
      5. לוותר על 2 מ"ל של השעיה GFP-SC ו- 5 מ של מדיום D10/3 מטר לתוך צלחת פטרי 10-ס מ; כל בקבוקון יביא 2 צלחות פטרי. ה-GFP-SCs מוגדרים מעבר 3.
        הערה: צלחת פטרי ס מ-10 שמשפר בדרך-כלל בסביבות 8 x 10 6 GFP-SCs אחרי שבוע אחד.
    9. ביום של הניתוח, חזור על שלב 1.2.6. השתמש צפיפות התאים שחושבו בצעד 1.2.10.
    10. Dispense aliquots של 3 x 10 6 GFP-SCs לתוך צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי צינורות בהתבסס על צפיפות תא מחושב מהשלב 1.2.9. Centrifuge את aliquots GFP-SC ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C ולהסיר את תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל של DMEM/F12 בינוני לכל aliquot ולכל צנטריפוגה-370 x g...
      הערה: כל בעל חיים מקבל 3 x 10 6 GFP-SCs-בינוני עם הנסיוב נמצא בשימוש עם GFP-SCs עד שלב זה.
    11. SCs GFP לשמור בקירור עד הזמן של השתלת.

2. להשלים את חיתוך בשמונה רמת בית החזה (T8)

  1. בעלי חיים הכנה לניתוח
    1. Anesthetize פישר נקבה לעכבר (180-200 גרם) עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לפקח העומק של הרדמה לפני שתמשיך לשלב הבא על ידי בדיקת הבוהן צובט, עין תגובות מהבהב.
    2. לגלח האחורי של העכברוש עם קוצץ חשמלי ונגב את העור עם 70% אתנול. חומר סיכה אופטלמולוגיות חלות על שתי העיניים. להעביר את החיה אל שולחן הניתוחים על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף כ 37 o C. המקום החיה על הגל, אז החוליות ניתנים לגישה בקלות.
      הערה: ניתן לבצע את הגליל מגבת נייר או 2 ב x2 הבנתם זה יכולים להיות מעוקר. לחמניות גדולות מומלץ כאשר T7-T9 צריך להיות מונח שטוח מעל לגלגל את.
  2. T7 כדי T9 laminectomy
    1. לאתר את הציון עבור התהליכים קוצניים T9-T11.
      הערה: הפערים בין T9, T10 T11 קטנים בהשוואה מקטעים אחרים אניn באזור. לאחר הנחת העכבר על הסליל, תהליכים קוצניים T9-T11 תרגיש בליטה משולש קטן דרך העור.
    2. עושים חתך קו האמצע 4 עד 5 ס מ של העור בעזרת סכין #10 מ- T4 כדי T11. עושים חתך קטן בשכבת שומן שטחית עם מספריים מעוגלים עם קצוות קהים לנתח את השומן.
      הערה: סוגים אחרים של כלי נגינה ניתן להשתמש כדי להפריד את השומן אך מספריים מעוקל, עם קצוות קהים לאפשר השיטה היעילה ביותר, לפחות פולשני עבור הפרדת השמן.
    3. לאתר את T7 לתהליכים קוצניים T9 באמצעות גב הלהב #10. . תחזיק את השריר-על T4 עם מלקחיים בוטה, לבצע חתך בשריר לאורך כל צד של החוליות T6-T10. . תחתוך כמה שיותר קרוב החוליות ככל האפשר לעשות חור נקי, תגרום לפגיעה מינימלית החיה.
    4. לבודד כל בודדים תהליכים קוצניים מ- T7 T9 על ידי חיתוך של השרירים והרצועות בין T6, T7, T7 ו T8, T8 T9, ושל T9 T10 עם להב #10-
    5. השתמש rongeur כדי להסיר כל השרירים והרצועות על שנבזזו T7 כדי T9. להסיר את השרירים והרצועות רוחבית ככל האפשר עד הפערים בין התהליכים רוחבי של T7 כדי T9 גלויים.
    6. להסיר תהליך קוצניים T9 עם rongeur. להחזיק את תהליכים קוצניים T8 עם מלקחיים בוטה ולהרים בעדינות כדי לרומם את הנדן T9 בפתח קטן בין התהליכים T9, T10-
    7. להסיר את הנדן החל מפתיחת ונע rostrally עם rongeur-T9. להסיר את הנדן רוחבית ככל האפשר; שורשי העץ יהיו גלויים לאחר laminectomy.
    8. ברגע הנדן מוסר, חזור על התהליך עבור T8 ו- T7.
      הערה: במהלך laminectomy, להשתמש הקליטה ספירס להסיר דם בעוד בהמשך laminectomy. אם עודף דימום מתרחשת, למקם ספוג דחוס באתר דימום ולהוסיף מלח כדי לעזור עם קרישת הדם-
  3. חיתוך-T8
    1. למקם את המדחק סביב T7 כדי T9. לאחר כל שנבזזו מוסרות, ודא כי הפערים בין התהליכים רוחבי גלויים, במיוחד בזמן T8. גם לבחון את העצמות לאורך שני הצדדים בין T7 כדי T9 כדי להבטיח ישנם אין שברי עצמות בולטות כלפי חוץ.
      הערה: את הפער הזה-T8 חשוב עבור ביצוע של חיתוך מלאה. החוליות לאורך להסירם עבור הכניסה צינור קל יותר.
    2. לחתוך את הגבי ו הגחוני / שורשים מעל ומתחת T8 שימוש בזווית מעיין מספריים. הוסף תמיסת מלח בחוט השדרה ולחכות על הדם הקריש.
      הערה: השלב זה חשוב להכנסה צינור מתאים.
    3. למקם את המספריים האביב בזווית מעל חוט השדרה הפערים בין התהליכים רוחבי-T8 ולעשות אחד1 לנתק לחלוטין את חוט השדרה. מניחים חתיכה קטנה של קצף דחוס לתוך הפער שנוצר 2-2.5 ממ ולהוסיף את תמיסת מלח לאזור מיד.

3. צינור הכניסה

  1. בעת המתנה גדמי כבל קטועה להגיע hemostasis, להוציא את צינור מהערוץ 1 x. לחתוך את המשולשים הקליטה לחתיכות ארוך דק, למקם אותם לתוך הצינור כדי להסיר עודפי PBS. בדוק כי החלונות חתוכות מראש פתוחות.
  2. להסיר את תמיסת מלח ודם באמצעות דק פיסות הקליטה משולשים. הרם את שני העצים הגדועים של חוט השדרה באמצעות microspatula כדי להבטיח הפרדה טובה. בעדינות הרם את הגדם rostral עם microspatula, להחליק את הצינור על הגדם עם החלונות הפונים עצמו. להבטיח הגדם כולו מוכנס אין עודף דימום לתוך הצינור.
  3. בעדינות הרם את הגדם סימטרית, להחליק את הקצה השני של התעלה על הגדם. ודא כי הגדם כולו מוכנס, החלונות הם על המשטח הגבי ( איור 2 א).

4. תאי שוואן / מטריקס להזרקה (ראה טבלה של חומרים) הכנה, הזרקת

  1. בעת המתנה חוט קטועה להגיע hemostasis, להסיר את המדיום מעל בגדר GFP-SC (להכין בשלב 1.2). Resuspend ה-GFP-SCs ב 10 µl של DMEM קר/F12. להוסיף 10 µl של ג'ל להזרקה קר התליה תא ומערבבים היטב על ידי חזר pipetting. לשמור את התערובת מטריקס GFP-SC/DMEM/F12/להזרקה על הקרח עד צינור הכניסה הושלמה.
  2. אחרי שתוודא כי החלונות על פני השטח הם הגבי לפתוח ( איור 2 א), להזריק µl 20 של תערובת מטריקס GFP-SC/DMEM/F12/להזרקה לתוך הצינור דרך לאחד windows חתוכות מראש 46 באמצעות אבן חשופה המערבי טעינת עצה ו- micropipette. אם התערובת מטריקס SC/DMEM/F12/להזרקה צריך תמלא יותר מדי הצינור, להסיר את עודף עם הקליטה משולשים. סגור את החלון לאחר ההזרקה; תפירת אינו זקוק ( איור 2B).

5. פצע הסגר ולדאוג לאחר הניתוח

  1. תפר השריר שכבות ושכבות שומן שטחית. לנקות את העור עם 70% אתנול והידוק ואז (למשל, באמצעות סרטוני הפצע) סגור העור. שמור את החיות חממה תרמית מוסדר עד שהם ישובו להכרה. העברת החיות בחזרה לתוך הכלובים. לספק מים צינור האכלה ארוך ומניחים באוכל שלהן על מצעים לגישה קלה.
  2. מנהל הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) פעמיים ביום למשך 3 ימים subcutaneously מתחיל מיד לאחר הניתוח כדי להפחית את הכאב. מזריקים gentamycin (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) subcutaneously פעם ביום במשך 7 ימים מיד לאחר הניתוח כדי למנוע ולצמצם את זיהום. להזריק 10 מ"ל של פתרון פלאפונים lactated subcutaneously פעמיים ביום במשך 7 ימים לטיפול בהתייבשות.
    3. שלפוחיות
  3. ריק באופן ידני פעמיים ביום עד שלפוחית השתן הפונקציה מחזירה. אם מתרחשת דלקת בשלפוחית השתן, ואז לנהל 10 מ ל תמיסת מלח subcutaneously עד השתן הופך ברור. אם אין שיפור תוך יומיים, להזריק gentamycin (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ופעם ביום) subcutaneously עד השתן הופך ברור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת השימוש בטכניקה כירורגית זו היא להעריך את השימוש של צינור מובנית ו מטריצה להזרקה בדימונה SC פונקציה לאחר השתלת לתוך שידרה transected הושלמה. שלושה שבועות לאחר ההשתלה, החיות הן perfused עם 4% paraformaldehyde, העמודות השדרה בגסות גזור, תיקנו את לשבועיים זהה עבור עוד 24 שעות ביממה. חוט השדרה הוא לאחר מכן גזור, הדגימות למקטעי הווריד cryostat ממוקמים בתוך 30% סוכרוז פתרון עבור cryoprotection. חתכי רוחב בעובי 1 מ מ מבודד באמצע הגשר SC של קבוצה נוספת של ביתור שידרה ממוקמים לתוך גלוטראלדהיד מקבע לעבד עבור מקטעים פלסטיק. הדגימות נחשפים לעמוד בלוח זמנים להכנה מיקרוסקופית אלקטרונים כמפורט מאת בייטס. et al. 47. סעיפים הווריד cryostat היו immunostained עם נוגדן ראשוני נגד ה-GFP, גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP), שרשרת כבדה neurofilament (RT97), neurofilament שרשרת בינונית (NF) ואחריו נוגדנים משניים כולל עז-נגד-עוף-488, עז-נגד-ארנב-546, עז-נגד-עכבר-647, עז-נגד-ארנב 647, בהתאמה. GFP-SCs היו מפוזרים בצורה שווה לאורך ובתוך התעלה (איור 3A; קירות פנימיים שמציינים קווי צהוב). האקסון התחדשות נצפית (איור 3B) והיא קשורה קשר הדוק עם הנוכחות של GFP-SCs (3A איור , איור 3C) המציינת כי טכניקה זו מוצלחת במתן גשר SC בתוך צינור מובנים וב קידום האקסון התחדשות לאורך הגשר בין ליער rostral, סימטרית. כלי דם, ו דנדריטים נמצאו גם במרכז הגשר SC (דמות תלת-ממד). עוד פרטים על ההשפעה של SCs עם תעלות סיביים PVDF-TrFE electrospun על התחדשות האקסון יכול להימצא ב שלנו עבודה שפורסמה לאחרונה31.

אמצעים אחרים התוצאה יכולה להתבצע כולל: לכימות האקסון התחדשות בסעיפים הסאגיטלי בשיטת הקו-transect-שמתואר העבודה האחרונה שלנו31 וכימות למספר ו דנדריטים ואת כלי פלסטיק חתכי רוחב. דוגמאות שהוכנו עבור מקטעים פלסטיק יכול להיות למחלקה נוספת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים לכמת את מספר אקסונים unmyelinated. חוט השדרה cryoprotected דוגמאות ניתן גם בחתך רוחב במקום sagittally למחלקה של immunostained לכמת האקסון התחדשות ואת נוכחותם של GFP-SCs-התנהגותיות גם ניתן לבצעם על החיות במרווחי זמן מתאימים תוך החיות מתוחזקים להיות.

Figure 1
איור 1: הכנת חלון בתוך הצינור. קפלו צד אחד לאורך ציר האורך של התעלה 5 מ מ (א). חותכים ארבעה חתכים על 0.4 מ מ אורך, לפחות 1 מ מ הפתחים של הצינור (B). כל החתך הוא בערך 1 מ מ אחד מהשני. מאת התגלגלות הצינור, הקיצוצים מקביל 4 שנצפו (C). לחתוך בין שני חתכים לאורך הציר rostral-סימטרית כדי ליצור חלון שניתן לפתוח על-ידי הרמת הכנף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סגירת החלון לאחר ההזרקה SC/DMEM/F12/מטריצה. חלונות נפתחים על ידי קיפול הכנף כל חזרה לאחר הנחת הצינור בין העצים הגדועים rostral וסימטרית (A). החלונות סגורים לאחר ההזרקה (B). סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: קונאפוקלית פלורסנט סעיפים הסאגיטלי ותמונות תמונת שדה בהיר של חתך פלסטיק מ שידרה מושתלים עם GFP-SCs ב מיושר סיביים תעלות PVDF-TrFE. מבט כולל על הגשר SC בתוך התעלות שבו הקירות הפנימיים יצוינו באמצעות קווים צהוב immunostained עבור ה-GFP, גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) כדי להמחיש מושתלים SCs ו האסטרוציטים חוט השדרה מארח, בהתאמה. אקסונים regenerated הודבקו תוויות עם RT97 (כבד-שרשרת neurofilament) (A, B), נוגדנים בינוני-שרשרת neurofilament (NF, ג). אקסונים אינם גלויים כמו ב- (א) עקב שיוכן GFP-SCs כפי נצפית באזור צינור באמצע (C) עם הגדלה גבוהה יותר קרוב. אקסונים אינן גלויות ב הגדם rostral עקב הסריקה לא שלם במעמקי בסעיף רקמות כאשר הדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כלי דם (כאנטי v ברה), ו דנדריטים (כאנטי MA ברה) נצפו שניהם באזור אמצע הצינור במקטע פלסטיק. הגדלה וברים קנה מידה: A, B (10 x, 200 מיקרומטר); C (20 x, 100 מיקרומטר); D (63 x, 25 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלב הקריטי ביותר ביצירת מודל חיתוך יעיל קטיעת חוט השדרה ב חתכים אחד או שניים. פער 2-2.5 מ מ בין ליער rostral, סימטרית השדרה צריך להיות נוכח באתר חיתוך. הסיבות ככל הנראה שלושה פער לא מופיע הן שורשים הגחוני הגבי / / (1) שלא הוסרו כראוי, (2) דורא הגחון לא הוסר כראוי, ו/או היה (3) בעל החיים אינו ממוקם כראוי על הסליל להציב תחתיה.

כדי לבצע ההכנסה conduit יעיל בין גדמי: (1) הקוטר של הצינור שלתלמידים מינים ספציפיים, הגיל של החיה המשמשים את הניסוי; (2) שנבזזו להסירו מספיק רוחבית עד, ניתן לאבחן את הפער בין התהליכים רוחבי; (3) שורשים להסירו, (4) צינור הכניסה בין גדמי צריך להתבצע על הניסיון הראשון. אם נסיונות מרובים נדרשים, הדבר עלול לגרום לבצקת בשנת גדמי, נוסף שמסבך את המשימה של צינור הכניסה בין ליער, גרימת חבלה נוספים.

לביצוע יעיל מבוא מטריקס GFP-SC/DMEM/F12/להזרקה לתוך הצינור, להבטיח כי: (1) חוט השדרה מדמם לא לפני ההוספה צינור בין ליער. אם יש נוזל בתוך הצינור לאחר ההוספה בין ליער, השתמש חתיכה קטנה של חנית הקליטה כדי להסיר אותו דרך החלונות חתוכות מראש. (2) ודא הצינור היא עלתה בשני גדמי חוט השדרה טוב ו- (3) כי החלונות חתוכות מראש הגבי פתוחות. ההזרקה של 20 µl תערובת מטריקס להזרקה/SC צריכים להיות יותר ממספיק כדי למלא את הצינור. גלישה מן החלונות חתוכות מראש הוא דוגמה טובה עבור השתלת יעיל.

המגבלות של הליך זה הם: (1) לא שיקום של דורה, (2) אין שליטה על התנועה של הצינור/SC ההשתלה לאחר סיום הניתוח, ו- (3) אין שיטה חלופית אם יש דליפה תוך הזרקת התערובת מטריקס SC/להזרקה.

היתרון של הליך זה הוא השילוב של השימוש של שני צינור מובנית עם מטריקס להזרקה. כל צינור עם חומר של בחירה זה גמיש שיתווספו בין גדמי יכול לשמש הליך כירורגי. כל מטריצה להזרקה של בחירה יכול לשמש גם בהליך זה; ג'ל הרגיש עדיפה בשל יכולתה ג'ל בחיי עיר , מתאר את הצורה של הגדם יצירת ממשק חלקה. תעלות עם מבנה פנים מורכבים יותר יכולים לשמש במקום פנים חלול. סמים, גורמי גדילה, מולקולות קטנות או כל סוג התא ניתן לשלב לתוך הצינור מובנית או המטריקס להזרקה או שניהם כדי לשפר את ההישרדות להשתלה, מספקים הגנה עצבי מיד לאחר פציעה, להפחית את הדלקת, לקדם את האקסון התחדשות, ולקדם אנגיוגנזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות את וקטור ויראלי ואת חיה ליבות בפרויקט מיאמי תרופה לשיתוק בהפקת הטיפול בבעלי חיים lenti-GFP-וירוס ומספקת, בהתאמה, היסטולוגיה ואת ליבות הדמיה לשימוש של cryostat, מיקרוסקופ קונפוקלי, והוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם החוקר סטריאו. מימון סופק על ידי NINDS (09923), משרד ההגנה (W81XWH-14-1-0482) ואת ה-NSF (DMR-1006510). מ ב בונחה הוא כריסטין E לין נכבדים פרופסור של מדעי המוח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).

Tags

רפואה גיליון 129 שוואן תאים חוט השדרה פציעה PVDF-TrFE conduit חיתוך מלאה electrospinning פיזואלקטריים
השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L.,… More

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter