Summary
Questo articolo descrive una tecnica per inserire un cavo condotto tra i ceppi del midollo spinale dopo il transection completo e riempimento con cellule di Schwann (SCs) e matrice di iniettabili della membrana basale al fine di colmare e promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il gap.
Abstract
Tra i vari modelli per la ferita del midollo spinale nei ratti, il modello di contusione viene utilizzato più spesso perché è il tipo più comune di ferita del midollo spinale umano. Il modello di transection completo, anche se non come clinicamente rilevanti come il modello di contusione, è il metodo più rigoroso per valutare la rigenerazione assonale. Nel modello di contusione, è difficile distinguere rigenerata da assoni germogliati o risparmiati a causa della presenza di rimanere ferita post del tessuto. Nel modello transection completo, un metodo di transizione è necessario colmare la lacuna e creare continuità dalla rostrale ai monconi caudali al fine di valutare l'efficacia dei trattamenti. Una chirurgia ponte affidabile è essenziale per verificare le misure di risultato riducendo la variabilità a causa del metodo chirurgico. I protocolli descritti qui sono utilizzati per preparare Schwann cellule (SCs) e condotti prima del trapianto, transection completo del midollo spinale al livello toracico 8 (T8), inserire il condotto e trapiantare SCs in conduit. Questo approccio viene utilizzato anche in situ gelificante di matrice della membrana dello scantinato iniettabili con trapianto di SC che consente la crescita assonale migliorata attraverso le interfacce rostrale e caudale con il tessuto ospite.
Introduction
Riparazione di lesioni del midollo spinale è un problema complesso e impegnativo che richiederà una strategia di trattamento combinatorio che coinvolgono, ad esempio, l'uso delle cellule e un biomateriale per fornire un microambiente favorevole per la funzione delle cellule trapiantate e axon rigenerazione al luogo della ferita. Emisezione1,2,3,4,5,6,7,8,9 e transection completo10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelli vengono spesso utilizzati per valutare gli effetti delle terapie a base di biomateriale bridging. Il vantaggio dell'utilizzo di un modello di emisezione è che fornisce maggiore stabilità per il costrutto bridging rispetto al transection completo. Tuttavia, nei modelli emisezione, è difficile dimostrare la rigenerazione dell'assone come risultato del metodo terapeutico applicato a causa della presenza del tessuto ha risparmiato. Il modello di transection completo è il metodo più rigoroso per dimostrare la rigenerazione assonale.
Vari materiali naturali e sintetici sono stati studiati per l'uso come un gel iniettabile, un gel pre-formato inseriti nei modelli emisezione o contusione, o come un condotto strutturato di emisezione o completare il transection modelli (dettagliati nel23 recensioni , 24 , 25). in situ gelificante di una miscela di iniettabili matrice/SC crea un'interfaccia più permissiva tra il trapianto e il cavo di host per l'assone attraversamento26,27 rispetto agli impianti di pre-gellati matrice/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelificante ammessi la matrice rifinire i contorni intorno le interfacce host irregolari mentre un condotto più rigido e strutturato o un gel pre-formato meno modellabile non poteva. Un condotto strutturato fornisce spesso Contatta stabilità di guida e dell'impianto in contrasto con una matrice iniettabile. I protocolli presentati qui descrivono una procedura chirurgica che si avvale di una matrice della membrana dello scantinato iniettabili (ad es., matrigel, vedi che la Tabella dei materiali, di cui al come iniettabili matrice qui) e di un condotto strutturato per valutare la rigenerazione assonale nel modello di ferita del midollo spinale più rigoroso.
Elettrofilati poli-vinylidenedifluoride-strato (PVDF-TrFE) allineati fibrosi condotti cavi sono utilizzati nel nostro approccio sperimentale. PVDF-TrFE è un polimero piezoelettrico che genera una carica transitoria quando meccanicamente deforme e ha dimostrato di promuovere la rigenerazione di estensione e assone del neurite sia in vitro29,30 e in vivo 31. elettrofilatura è un comune metodo di fabbricazione di impalcatura che possa rapidamente produrre impalcature fibrose affidabili utilizzando una varietà di polimeri con proprietà controllabile come allineamento della fibra, fibra diametro e spessore dell'impalcatura per neurale e per altre applicazioni32,33,34.
Numerosi studi del ratto SCs trapiantate nei siti di lesione del midollo spinale hanno dimostrato trattamento efficacia5,9,18,19,20,21 ,26. Questi trapianti sono neuroprotective per il tessuto che circonda la lesione, ridurre la dimensione della lesione cavità e promuovere la rigenerazione assonale nel sito di lesione/trapianto e mielinizzazione degli assoni rigenerati. SCs umana può essere autologously trapiantato, un vantaggio rispetto alla maggior parte degli altri correlati neurali cellule24. Dopo una biopsia di nervo periferico, SCs può essere isolato e purificato e prolifereranno fino alla quantità desiderata per il trapianto negli esseri umani. Trapianto autologo di SC per i pazienti danneggiati del midollo spinale ha dimostrato di essere sicuro in Iran35,36,37,38, Cina39,40e la Stati Uniti41,42. SCs sono noti a secernere numerosi fattori neurotrofici e importante per la crescita dell'assone proteine della matrice extracellulare e a svolgere un ruolo essenziale nella rigenerazione assonale dopo lesione del nervo periferico. Nostro obiettivo è quello di descrivere i metodi che possono indagare disegni conduit per migliorare il risultato del trapianto di SC in un modello di transection del midollo spinale del ratto completa.
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Protocol
femmina ratti Fischer adulti (peso corporeo di 180-200 g) sono alloggiati secondo linee guida NIH e USDA. L'Animal Care istituzionali ed uso Committee (IACUC) dell'Università di Miami ha approvato tutte le procedure di animali.
1. preparazione pre-trapianto
- preparazione Conduit.
- Poi tagliato a 5 mm di lunghezza con una lama #10 sotto un microscopio per dissezione.
Nota: Il diametro interno del condotto è tra 2.4-2.7 mm; il diametro esterno è fra 2.5-2.8 mm. - Piegare il tubo dolcemente lungo il lato longitudinale ( Figura 1A). Tagliare quattro piccole incisioni circa 0,4 mm di lunghezza e almeno 1 mm dalle aperture del condotto e circa 1 mm a pezzi con bordo dritto Allerød forbici ( Figura 1B).
- Aprire il condotto ( Figura 1) e tagliare tra due incisioni lungo lo stesso lato creando due finestre affiancate ( Figura 1). Assicurarsi che le finestre possono essere aperto e chiuso correttamente lungo il lato uncut.
- Sterilizzare i condotti in etanolo di 75% per 25 min in una capsula Petri 10 cm. Sciacquare i condotti una volta per 4 min con 1x tamponato fosfato salino (PBS) e i condotti di trasferimento con pinze sterili per un nuovo piatto di Petri di 10 cm. Sciacquare i condotti due volte con PBS 1X per 25 minuti ciascuno,.
- Conservare i condotti in PBS 1X fino alla chirurgia.
Nota: Molti condotti possono essere sterilizzati in una sola volta. Conservare i condotti in provette da centrifuga separata sterili da 1,5 mL per mantenerli sterili.
- Poi tagliato a 5 mm di lunghezza con una lama #10 sotto un microscopio per dissezione.
- Verde proteina fluorescente (GFP)-preparazione delle cellule di Schwann (SC)
- preparare colture purificate di SC dai nervi tibiali del Fischer femmina adulto ratti come descritto in precedenza 43. Al completamento di questo passaggio, piastra SCs su poli-L-lisina (PLL)-rivestito-10cm di Petri e mantenere in mezzo D10 / 3M; questi SCs sono definiti come passaggio 0.
Nota: D10 / 3M medium è composto dei seguenti: Estratto 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina-streptomicina (pen/strep), ipofisi di 20 µ g/mL, 2 µM forskolin, 2,5 nM heregulin in Dulbecco ' s modificato Eagle ' medium (DMEM) di s. - Ricostituire con medium fresco D10/3M (7 mL/10 cm di Petri) ogni 3-4 giorni.
- Cultura Split SC una volta che raggiunge la confluenza di 70-80%.
- Medio di rimuovere e sciacquare due volte con Hank ' soluzione salina (HBSS) senza calcio o magnesio equilibrata di s.
- Aggiungere 5 mL di tripsina/EDTA 0,25% per ogni 10 cm di Petri e incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA).
- Aggiungere 5 mL di mezzo di D10 (10% FBS e 1% pen/strep in DMEM) in una provetta da centrifuga da 50 mL per neutralizzare la tripsina.
- Delicatamente dispensare la tripsina/EDTA soluzione in Petri piatto più volte per staccare SCs. rimuovere la sospensione cellulare dal piatto e inserire la provetta da centrifuga preparato nel passaggio precedente. Risciacquare il piatto con 5 mL di terreno di D10 e posizionarlo nella provetta da centrifuga per massimizzare la raccolta delle cellule.
- Centrifugare le cellule a 370 x g per 5 min a 4 o C. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 4 mL di terreno di D10/3 M per ogni scatola di Petri Spalato.
- Dispensare 1 mL di sospensione di SC e 6 mL di terreno di D10 / 3M in una capsula Petri 10 cm; ogni divisione di Petri si tradurrà in 4 capsule di Petri. Questi SCs sono definiti come passaggio 1.
- Ricostituire con mezzo D10/3M fresco il giorno dopo il placcaggio e ogni 3-4 giorni dopo il placcaggio.
- Una volta la SCs raggiungere 70-80% confluenza, ripetere i passaggi 1.2.3.1 per 1.2.3.6. La SCs sono ora al passaggio 2.
- Trasducono il SCs una volta raggiunta la confluenza del 50%, con un vettore lentivirale codificante GFP in D10/3M medio durante la notte ad una molteplicità di infezione di 30 come precedentemente descritto 44 , 45 .
- Ricostituire con medium fresco D10 / 3M il giorno successivo e ogni 3-4 giorni dopo il placcaggio.
- Una volta che raggiungono la GFP-SCs confluenza di 70-80%, ripetere i passaggi 1.2.3.1 per 1.2.3.5 ma Risospendere la GFP-SCs in 6 mL di terreno di D10 invece. Pipettare 15 µ l della sospensione di GFP-SC in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e aggiungere 15 µ l di soluzione di blu di trypan 0,4%. Flick delicatamente la provetta da centrifuga e Pipettare 10 µ l della miscela in una camera della diapositiva conta cellulare.
- Porre il vetrino in un contatore di cellule automatizzato e determinare la densità delle cellule.
- Centrifugare le cellule a 370 x g per 5 min a 4 o C. Rimuovi il sovranatante, risospendere con 1,5 mL di mezzo di congelamento per ogni 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispensare 1,5 mL di sospensione di GFP-SC in un vial criogeniche e congelare a -80 o C per almeno 24 h prima di trasferirsi in azoto liquido per deposito.
Nota: Congelamento medio: 25% FBS e 8% dimetilsolfossido in DMEM. - SCs-GFP scongelare una settimana prima dell'intervento chirurgico.
- Aggiungere 10 mL D10 liquido in una provetta da centrifuga 50ml.
- Scongelare i flaconcini di GFP-SCs congelati in bagnomaria a 37 o C fino a parzialmente scongelati.
- Rimuovere la sospensione di GFP-SC dal flaconcino criogenico e inserire la provetta da centrifuga 50 mL preparato in 1.2.8.1. Delicatamente dispensare la soluzione su e giù ripetutamente.
- Centrifugare le cellule a 370 x g per 5 min a 4 o C. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 4 mL di terreno di D10/3 M per ciascun flaconcino scongelato.
- Pipettare 2 mL di sospensione di GFP-SC e 5 mL di terreno di D10 / 3M in una capsula Petri 10 cm; ogni flaconcino deve comportare 2 capsule di Petri. Il GFP-SCs è definito come passage 3.
Nota: Una capsula di Petri 10 cm solitamente produce circa 8 x 10 6 GFP-SCs dopo una settimana.
- Il giorno dell'intervento chirurgico, ripetere il passaggio 1.2.6. Uso la densità delle cellule calcolata nel passaggio 1.2.10. Tubi
- dispensare aliquote di 3 x 10 6 GFP-SCs nella centrifuga sterili da 1,5 mL basati sulla densità della cella calcolata dal passaggio 1.2.9. Centrifugare le aliquote di GFP-SC 370 x g per 5 min a 4 o C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM/F12 per ciascuna aliquota e centrifugare a g. 370 x
Nota: Ogni animale riceve 3 x 10 6 GFP-è utilizzato con GFP-SCs SCs. Medium con siero fino a questo passaggio. - Mantenere GFP-SCs su ghiaccio fino al momento del trapianto.
- preparare colture purificate di SC dai nervi tibiali del Fischer femmina adulto ratti come descritto in precedenza 43. Al completamento di questo passaggio, piastra SCs su poli-L-lisina (PLL)-rivestito-10cm di Petri e mantenere in mezzo D10 / 3M; questi SCs sono definiti come passaggio 0.
2. Completare il Transection al livello toracico 8 (T8)
- animale preparazione per la chirurgia
- Anesthetize una femmina Fischer ratto (180-200 g) con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (60 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (5 mg/kg di peso corporeo). Monitorare la profondità dell'anestesia prima di procedere al passaggio successivo controllando punta pizzicotti e occhio lampeggiante responses.
- Radere la parte posteriore del ratto con un clipper elettrico e pulire la pelle con etanolo al 70%. Applicare il lubrificante oftalmico in entrambi gli occhi. Trasferire l'animale nella tabella di chirurgia su un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea a circa 37 o C. posto l'animale su un rotolo così le vertebre sono facilmente accessibili.
Nota: Il rotolo può essere fatto da tovagliolo di carta o 2 in x2 in garza che può essere sterilizzato. Più grandi rotoli sono raccomandati quando T7-T9 deve essere disteso sulla parte superiore del rotolo.
- T7 alla laminectomia T9
- individuare il punto di riferimento per i processi spinous T9-T11.
Nota: Il divario tra T9, T10 e T11 è piccolo rispetto ad altri segmentin la regione. Dopo aver posizionato il ratto sul rullo, T9-T11 apofisi si sentirà come un piccolo urto triangolare attraverso la pelle. - Fare un'incisione mediana di 4-5 cm della pelle usando una lama #10 da T4 a T11. Praticare una piccola incisione dello strato grasso superficiale con forbici curve con estremità smussate di sezionare il grasso.
Nota: Altri tipi di strumenti possono essere utilizzati per separare il grasso ma forbici curve con estremità smussate abilitare il metodo più efficace e meno invasivo per separazione grassi. - Individuare il T7 ai processi spinous T9 utilizzando il dorso della lama #10. Tenere il muscolo a su T4 con il forcipe smussato e fare un'incisione nel muscolo lungo ogni lato delle vertebre da T6-T10. Effettuare il taglio più vicino le vertebre come possibile fare un'apertura pulita e minimale ferire l'animale.
- Isolare ogni singolo processo spinous da T7 T9 tagliando i muscoli e legamenti tra T6 e T7, T7 e T8, T8 e T9 e T9 e T10 con una lama di 10 #.
- Utilizzare una Pinza ossivora per rimuovere qualsiasi muscoli e legamenti sulle lamine da T7 a T9. Rimuovere i muscoli e i legamenti lateralmente possibile fino a quando i divari tra le apofisi trasverse da T7 a T9 sono visibili.
- Rimuovere il processo spinous T9 con una Pinza ossivora. Tenere il processo spinous T8 con forcipe smussato e sollevare delicatamente per elevare la lamina di T9 presso la piccola apertura tra i processi T9 e T10.
- Rimuovere la lamina a partire dall'apertura e rostralmente in movimento con una Pinza ossivora al T9. Rimuovere la lamina lateralmente per quanto possibile; radici dorsali dovrebbe essere visibile dopo il laminectomy.
- Una volta rimossa la lamina, ripetere il processo per T8 e T7.
Nota: Durante la laminectomia, utilizzare lance di assorbimento per rimuovere il sangue pur continuando con laminectomia. Caso di sanguinamento in eccesso, posizionare una spugna compressa presso il luogo di spurgo e aggiungere soluzione fisiologica per aiutare con la coagulazione del sangue.
- individuare il punto di riferimento per i processi spinous T9-T11.
- Transection a T8
- posto del riavvolgitore intorno T7 a T9. Dopo aver rimosso tutte le lamine, assicurarsi che i divari tra le apofisi trasverse sono visibili, soprattutto a T8. Anche esaminare le ossa lungo la lunghezza su entrambi i lati tra T7 a T9 per garantire non ci sono nessun frammenti di ossa che sporgono verso l'esterno.
Nota: Questa lacuna a T8 è importante per l'esecuzione il transection completo. Le vertebre lungo la lunghezza dovrebbero essere rimosso per facilitare l'inserimento conduit. - Taglio dorsale e radici ventrali sopra e sotto T8 utilizzando angolato forbici di primavera. Aggiungere soluzione fisiologica al midollo spinale e attendere che il sangue coaguli.
Nota: questo passaggio è importante per l'inserimento corretto conduit. - Mettere le forbici angolate primavera sopra il midollo spinale le lacune tra le apofisi trasverse a T8 e fare un taglio di recidere completamente il midollo spinale. Inserire un piccolo pezzo di schiuma compressa il divario risultante di 2-2,5 mm e aggiungere soluzione fisiologica per l'area immediatamente.
- posto del riavvolgitore intorno T7 a T9. Dopo aver rimosso tutte le lamine, assicurarsi che i divari tra le apofisi trasverse sono visibili, soprattutto a T8. Anche esaminare le ossa lungo la lunghezza su entrambi i lati tra T7 a T9 per garantire non ci sono nessun frammenti di ossa che sporgono verso l'esterno.
3. Inserimento di Conduit
- durante l'attesa per i ceppi di cavo mozzata raggiungere emostasi, estrarre un condotto da 1X PBS. Tagliare i triangoli di assorbimento in pezzi lunghi sottili e metterli nel raccordo per rimuovere l'eccesso di PBS. Verificare che le finestre pre-tagliate sono aperte.
- Rimuovi saline e sangue utilizzando sottili lunghi pezzi di triangoli di assorbimento. Sollevare i due ceppi del midollo spinale con un microspatula per garantire la buona separazione. Il ceppo rostrale con il microspatula di sollevare delicatamente e scivolare il condotto sopra il ceppo con le finestre di fronte a se stessi. Assicurarsi che sia inserito il ceppo intero e non c'è Nessun sanguinamento in eccesso nel raccordo.
- Delicatamente sollevare il ceppo caudale e scivolare l'altra estremità del condotto sopra il ceppo. Assicurarsi che sia inserito il ceppo intero e le finestre sono sulla superficie dorsale ( Figura 2A).
4. Cellula di Schwann / Matrix iniettabili (Vedi tabella materiali) preparazione e iniezione
- durante l'attesa per il cavo mozzato raggiungere emostasi, rimuovere il supporto sopra il pellet di GFP-SC (preparato al punto 1.2). Risospendere il GFP-SCs in 10 µ l di freddo DMEM/F12. Aggiungere 10 µ l di gel iniettabile freddo alla sospensione cellulare e mescolare bene dal ripetuto pipettaggio. Mantenere la miscela di matrice di GFP-SC/DMEM/F12/iniettabili su ghiaccio fino al completamento di inserimento conduit.
- Dopo aver verificato che le finestre sulla superficie dorsale sono aperte ( Figura 2A), iniettare 20 µ l della miscela matrice GFP-SC/DMEM/F12/iniettabili il condotto attraverso uno dei pre-tagliata windows 46 utilizzando un western blot, carico di punta e una micropipetta. Se la miscela di matrice SC/DMEM/F12/iniettabile dovrebbe riempire troppo il condotto, rimuovere l'eccesso con triangoli di assorbimento. Chiudere le finestre dopo l'iniezione; la sutura non è necessaria ( Figura 2B).
5. Ferita di chiusura e cura postoperatoria
- sutura del muscolo strati e strati di grasso superficiali. Pulire la pelle con etanolo al 70% e poi fiocco (ad es., utilizzando clip ferita) Chiudi la pelle. Tenere gli animali in un incubatore termicamente regolamentato, fino a quando non riacquistano la coscienza. Trasferire gli animali nuovamente dentro le gabbie. Fornire l'acqua con un tubo di alimentazione lungo e posizionare le palline dell'alimento la biancheria da letto per un facile accesso.
- Amministra buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo) due volte al giorno per 3 giorni per via sottocutanea a partire immediatamente dopo l'intervento chirurgico per ridurre il dolore. Iniettare la gentamicina (5 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea una volta al giorno per 7 giorni immediatamente dopo l'intervento chirurgico per prevenire e ridurre le infezioni. Iniettare 10 mL di soluzione di Ringer lattato sonerie per via sottocutanea due volte al giorno per 7 giorni per idratazione.
- Empty vesciche manualmente due volte al giorno fino alla vescica funzionano restituisce. In caso di infezione della vescica, quindi somministrare 10 mL di soluzione salina per via sottocutanea fino a quando l'urina diventa chiaro. Se non c'è nessun miglioramento in due giorni, iniettare la gentamicina (5 mg/kg peso corporeo, una volta al giorno) per via sottocutanea fino a quando l'urina diventa chiaro.
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Representative Results
L'obiettivo dell'utilizzo di questa tecnica chirurgica è quello di valutare l'uso di un tubo strutturato e matrice iniettabili che massimizza la funzione SC dopo trapianto in midolli spinali transected completati. Tre settimane dopo il trapianto, gli animali sono perfusi con paraformaldeide al 4% e le colonne vertebrali sono grossolanamente dissecate e risolto nel fissativo stesso per altre 24 ore. Il midollo spinale viene poi sezionato e i campioni per sezioni sagittali criostato vengono posti in una soluzione di saccarosio 30% per crioprotezione. 1 mm spessore sezioni trasversali isolati dalla metà del ponte SC di un'altra serie di dissecata midolli spinali sono inseriti in fissativo di glutaraldeide per elaborare per profilati plastici. I campioni vengono sottoposti ad un programma per la preparazione al microscopio elettronico come descritto da Bates et al. 47. sezioni sagittali criostato immunostained con l'anticorpo primario contro GFP, proteina silicea fibrillare glial (GFAP), neurofilamenti catena pesante (RT97) e dei neurofilamenti catena media (NF) seguita da anticorpi secondari tra cui capra-anti-pollo-488, capra-anti-coniglio-546, capra-anti-mouse-647 e capra-anti-coniglio 647, rispettivamente. GFP-SCs sono stati distribuiti in modo uniforme lungo e all'interno del condotto (Figura 3A; pareti interne indicate da linee gialle). Rigenerazione dell'assone è osservata (Figura 3B) ed è strettamente associata con la presenza di GFP-SCs (Figura 3A e Figura 3) che indica che questa tecnica è riuscita a fornire un ponte di SC all'interno di un condotto strutturato e in promuovere la rigenerazione assonale lungo il ponte tra i ceppi rostrali e caudali. Vasi sanguigni e gli assoni myelinated inoltre sono stati trovati nel centro del ponte SC (Figura 3D). Maggiori dettagli dell'effetto di SCs con elettrofilate PVDF-TrFE guaine fibrose sulla rigenerazione degli assoni possono essere trovati nel nostro recente lavoro pubblicato31.
Altre misure di risultato possono essere eseguite tra cui: quantificare la rigenerazione assonale in sezioni sagittali con il metodo transetto di linea descritto nel nostro recente lavoro31 e quantificare il numero di assoni myelinated e vasi in plastica sezioni trasversali. Campioni preparati per profilati plastici possono essere ulteriormente sezionati per microscopia elettronica di trasmissione quantificare il numero degli assoni unmyelinated. Midollo spinale crioprotetti campioni possono anche essere le anziché sagittally sezionati e immunostained per quantificare la rigenerazione assonale e la presenza di GFP-SCs. test comportamentali possono essere eseguite anche sugli animali ad intervalli adeguati, mentre gli animali siano mantenuti.
Figura 1: preparazione di finestra nella canalina. Piegare un lato lungo l'asse longitudinale del tubo 5 mm (A). Tagliare quattro incisioni circa 0,4 mm di lunghezza e almeno 1 mm dalle aperture del condotto (B). Ogni incisione è distanziate di circa 1 mm. Spiegando il condotto, i 4 tagli paralleli sono osservati (C). Taglio tra le due incisioni lungo l'asse rostro-caudale per creare una finestra che può essere aperto da sollevamento del lembo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: chiusura finestra dopo iniezione SC/DMEM/F12/matrix. Finestre aperte piegando indietro ogni falda dopo aver posizionato il condotto tra ceppi rostrale e caudale (A). Finestre sono chiuse dopo l'iniezione (B). Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini fluorescenti Confocal di sezioni sagittali e un'immagine del campo luminoso di una sezione trasversale di plastica da midolli spinali trapiantati con GFP-SCs in allineati fibroso PVDF-TrFE condotti. Panoramica del ponte SC entro i condotti dove le pareti interne sono indicate dalle linee gialle e immunostained per GFP e la proteina silicea fibrillare glial (GFAP) visualizzare trapiantato SCs e host del midollo spinale astrociti, rispettivamente. Assoni rigenerati sono stati etichettati con RT97 (neurofilamento pesante-catena) (A, B) e gli anticorpi della mezzo-catena neurofilamenti (NF, C). Gli assoni non sono visibili come in (A) a causa della loro stretta associazione con GFP-SCs come si osserva nella regione Mid-condotto in (C) a maggiore ingrandimento. Gli assoni non sono visibili nel ceppo rostrale a causa della scansione incompleta nella profondità della sezione di tessuto quando la formazione immagine di microscopia confocale. Vasi sanguigni (etichettati come v a D) e gli assoni myelinated (etichettati come MA a D) sono stati osservati sia nella regione Mid-condotto in una sezione di plastica. Ingrandimenti e barre della scala: A, B (10x, 200 µm); C (20x, 100 µm); P (63 x, 25 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La fase più critica nella creazione di un modello efficace transection è recidere il midollo spinale in uno o due tagli. Un 2-2.5 mm di distanza tra i ceppi rostrale e caudale del midollo spinale dovrebbe essere presente nel sito di transection. (1) le radici dorsali/ventrali non sono stati rimossi correttamente, (2) il dura ventrale non è stato rimosso adeguatamente, e/o (3) l'animale non è stato posizionato correttamente sul rullo posizionato sotto di lei sono i tre motivi più probabili per un tale divario non appare.
Per eseguire un inserimento efficace condotto tra i ceppi: il diametro del tubo (1) dovrebbe essere su misura per le specifiche specie e l'età dell'animale utilizzato nell'esperimento; (2) lamine devono essere rimossi abbastanza lateralmente fino a quando il divario tra le apofisi trasverse possa essere visualizzato; (3) le radici devono essere rimossi e (4) inserimento di condotto tra i ceppi dovrebbe essere compiuta al primo tentativo. Se sono necessari più tentativi, ciò potrebbe causare l'edema in ceppi, ulteriormente complicare il compito di inserimento di condotto tra i ceppi e provocare ulteriori lesioni.
Per eseguire effettiva introduzione di matrice GFP-SC/DMEM/F12/iniettabili nel raccordo, accertarsi che: (1) il midollo spinale non sanguina prima dell'inserimento di condotto tra i ceppi. Se c'è liquido nel condotto dopo l'inserimento tra i ceppi, è possibile utilizzare un piccolo pezzo della lancia di assorbimento per rimuoverlo tramite le finestre pre-tagliate. (2) assicurarsi che il condotto è scivolato su due ceppi di midollo spinale bene e (3) che le finestre pre-tagliare dorsale sono aperte. L'iniezione di 20 µ l della miscela matrice SC/iniettabile dovrebbe essere più che sufficiente a riempire il condotto. Overflow dalle finestre pre-tagliate è un buon calibro per trapianto efficace.
Le limitazioni di questa procedura sono: (1) nessun restauro del dura, (2) nessun controllo sopra il movimento del condotto/SC non trapiantare dopo completamento della chirurgia e (3) nessun metodo alternativo se c'è dispersione durante l'iniezione della miscela di matrice SC/iniettabili.
Il vantaggio di questa procedura è la combinazione dell'uso di un condotto sia strutturato con una matrice iniettabile. Qualsiasi condotto realizzato con un materiale di scelta che è flessibile per essere inserito tra i monconi può essere utilizzato in questa procedura chirurgica. Qualsiasi matrice iniettabili di scelta possa anche essere utilizzati in questa procedura; un gel termosensibile è preferibile a causa della sua capacità di gel in situ e contorno alla forma del moncone creando un'interfaccia senza giunte. Condotti con una struttura interna più complessa possono essere utilizzati invece di un interno cavo. Farmaci, fattori di crescita, piccole molecole o qualsiasi tipo di cellula può essere incorporato in conduit strutturato o la matrice iniettabile o entrambi per migliorare la sopravvivenza del trapianto, fornire protezione neurale immediatamente dopo la lesione, ridurre l'infiammazione, promuovere assone rigenerazione e promuovere l'angiogenesi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il vettore virale e animale core nel progetto di Miami alla cura paralisi per produrre la cura degli animali lenti-GFP-virus e fornendo, rispettivamente e l'istologia e Imaging Core per l'uso del criostato, microscopio confocale, e microscopio a fluorescenza con Stereo Investigator. Finanziamento è stato fornito da NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) e NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge è il Christine E Lynn distinto professore di neuroscienze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
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