シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine
Summary
この資料では、完全断裂後脊髄切り株とシュワン細胞 (SCs) と橋し、のギャップの間で軸索の再生を促進するために注射の基底膜マトリックス塗りつぶしの中空管を挿入する方法について説明します。
Abstract
ラットの脊髄の傷害の様々 なモデルの間で、人間の脊髄損傷の最も一般的な型なので挫傷モデルを使用、頻繁。完全断裂モデルが挫傷モデルとして臨床的にない関連は、軸索の再生を評価する最も厳格な方法です。挫傷モデル残りの組織のポスト傷害の存在のために発芽や倹約の軸索から再生を区別することは困難です。完全断裂モデルのブリッジ メソッドは、ギャップを埋めるし、治療の効果を評価するために、吻側から尾側の切り株に継続性を作成する必要です。信頼性の高いブリッジ手術は、手術による変動を減らすことによって結果の措置をテストに不可欠です。ここで説明されているプロトコルを使用するシュワン細胞 (SCs) と移植、胸椎レベル 8 (T8) 脊髄の完全断裂前管、導管を挿入、コンジットに SCs を移植します。このアプローチはまたその場のホスト組織と吻側と尾側のインタ フェース間で改良された軸索の伸長ができる SC 移植と注射の基底膜マトリックスのゲル化を使用します。
Introduction
脊髄損傷修復、複雑で困難な問題、たとえばを含む組合せ治療戦略を必要とする細胞と移植細胞の機能および軸索の有利な微小環境を提供する生体材料の使用傷害のサイトで再生します。ヘミセクション1,2,3,4,5,6,7,8,9と完全断裂10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22モデルは生体材料ベースのブリッジ治療の効果を評価するために使用頻繁。ヘミセクション モデルを使用しての利点は、完全断裂と比較してブリッジ構築のためより安定性を提供することです。ただし、ヘミセクションのモデルで免れる組織の存在のため適用される治療法の結果として軸索の再生を証明することは困難です。完全断裂モデルは、軸索の再生を実証する最も厳格な方法です。
注射ジェルとして使用する様々 な天然および合成材料を研究されている、前もって形成されたゲル ヘミセクションに挫傷、ヘミセクション モデルまたは構造のパイプ役としてを配置または (詳細レビュー23断裂モデルを完了,24,25). 移植と軸索交差26,27前ゲルのマトリックス/SC のインプラントと比較してのホスト コードのより寛容なインターフェイスを作成します注射マトリックス/SC の混合物のゲル化その場観察5,18,19,28. より剛性と構造電線管またはより少なく成形の前もって形成されたゲルはできなかったに対し、不規則なホスト ・ インターフェース周り輪郭にマトリックスを許可されてその場でゲル化します。構造電線管は多くの場合注射マトリックスと対照をなしてガイダンスとインプラントの接触の安定性を提供します。ここに示すプロトコル記述 (例えばマトリゲル、ここで注射のマトリックスとしての参考資料の表を参照してください) 注射の基底膜マトリックスとする構造化された水路活用術最も厳格な脊髄損傷モデルにおける軸索再生を評価します。
エレクトロスピニング ポリ-vinylidenedifluoride-トリフルオロ エチレン (PVDF ・ セッション) 一直線に並べられた繊維中空管、実験的取り組みで使用されます。PVDF ・ セッションは機械的に変形したとき一時的な電荷を生成し、神経突起の延長と軸索の再生を促進するために示されている圧電高分子30 29,の in vitroとin vivoの両方31. エレクトロスピニングは急速にファイバアライメント、ファイバー径の足場の厚さなどの制御可能なプロパティを持つさまざまな高分子材料を使用して信頼性の高い線維性足場を作り出すことができる一般的な足場工法神経やその他のアプリケーション32,33,34。
ラット脊髄損傷のサイトに移植した SCs の数多くの研究が治療効果5,9,18,19,20,21 を実証しています。 ,26。これらの移植は神経組織の病変部を周囲の巣キャビティ サイズを縮小し、病変/移植サイトと再生軸索の髄鞘形成に軸索の再生を促進します。人間 SCs は autologously 移植することができる、優位性神経関連他のほとんどと比較されたとき細胞は24。SCs の分離し、精製末梢神経生検後、ヒトへの移植の希望の金額に増殖されます。頸髄損傷患者に対する移植 SC イラン35,36,37,38、中国39,40, 念のために証明されているし、アメリカ合衆国の41,42。SCs には、多数の神経栄養因子と軸索の成長にとって重要な細胞外マトリックス蛋白質を分泌して末梢神経損傷後の軸索再生に重要な役割を果たすことが知られています。ここでの目標は、完全なラット脊髄離断モデルにおける SC 移植の予後を改善するコンジット デザインを調べることのできる方法を説明します。
Protocol
NIH および米国農務省のガイドラインによると女性アダルト Fischer ラット (180-200 g 体重) が収容されています。制度上の動物のケアおよび使用委員会 (IACUC)、マイアミ大学の動物のすべてのプロシージャを承認した。 1 移植前準備 導管準備。。 は解剖顕微鏡の下で #10 刃を使用して 5 mm が導管をカットします 。 注: 導管の内径 2.4 2.7 mm の?…
Representative Results
この手技を使用しての目的は、構造電線管および完成した切断脊髄に移植後 SC 関数を最大化する注射のマトリックスの使用を評価することです。移植後 3 週間動物は 4% パラホルムアルデヒドで灌流と脊柱を肉眼的切除し、さらに 24 時間同じ固定液で固定します。脊髄を解剖し、矢状切片のサンプルはに対する凍害保護作用の 30% ショ糖液に配置されます。切り裂か?…
Discussion
効果的な断裂モデルを作成する最も重要なステップは、1 つまたは 2 つのカットで脊髄を切断です。吻側と尾側の脊髄切り株の間 2 〜 2.5 mm のギャップが離断サイトで表示されます。表示されないこのようなギャップの 3 つの最も可能性の高い理由は、(1) 背/腹根が正常に削除されませんでした、(2) 腹側硬膜は適切に削除されませんでしたまたは (3) の動物だった彼女の下に置かれたロールに?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マイアミ麻痺治療プロジェクトでのウイルスのベクトルと動物コアをクライオスタット、共焦点顕微鏡の使用のため遺伝子導入 GFP ウイルス、動物のケアをそれぞれ、生産および組織学とイメージング コアに感謝したいと蛍光顕微鏡ステレオ捜査官。資金調達は、NSF (DMR-1006510)、国防総省 (W81XWH-14-1-0482)、NINDS (09923) によって提供されました。M.B. バンジはクリスティン E リン識別教授の神経です。
Materials
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
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Cite This Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).