Summary
Denna artikel beskriver en teknik för att infoga en ihålig kanal mellan ryggmärgen stubbarna efter komplett transection och fylla med Schwann celler (SCs) och injicerbara basalmembranet matris för att överbrygga och främja axon regenerering över gapet.
Abstract
Bland olika modeller för ryggmärgsskada hos råttor används kontusion modellen oftast eftersom det är den vanligaste typen av mänskliga ryggmärgsskada. Den kompletta transection modellen, är även om inte vara kliniskt som kontusion modell, den mest rigorösa metoden att utvärdera axon regenerering. I den kontusion modellen är det svårt att skilja regenererad från grodda eller avvarad axoner på grund av återstående post vävnadsskada. I komplett transection modellen är en överbryggande metod nödvändigt att fylla tomrummet och skapa kontinuitet från den rostralt till stjärtfenan stubbarna för att utvärdera effektiviteten av behandlingarna. En tillförlitlig överbryggande kirurgi är viktigt att testa resultatåtgärder genom att minska variationen på grund av den kirurgiska metoden. De protokoll som beskrivs här används för att förbereda Schwann celler (SCs) och conduits före transplantation, komplett transection av ryggmärgen på thorakal nivå 8 (T8), infoga specialföretaget och transplantera SCs till specialföretaget. Detta tillvägagångssätt används också i situ gelbildande av en injicerbara basalmembranet matris med SC transplantation som tillåter förbättrad axon tillväxt över de rostralt och stjärtfenan gränssnitt med värd vävnaden.
Introduction
Ryggmärgen skada reparation är komplexa och utmanande problem som kommer att kräva en kombinatorisk behandlingsstrategi som t.ex, användning av celler och en biomaterial att ge en gynnsam närmiljön för transplanterade cellernas funktion och axon förnyelse på platsen av skada. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 och komplett transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modeller används ofta för att bedöma effekterna av biomaterial-baserade överbryggande behandlingar. Fördelen med att använda en hemisection modell är att det ger mer stabilitet för den överbryggande konstruktion jämfört med komplett transection. I hemisection modeller är det dock svårt att bevisa axon förnyelse som ett resultat av den terapeutiska metoden som tillämpas på grund av förekomsten av avvarad vävnad. Komplett transection modellen är den mest rigorösa metoden att påvisa axon regenerering.
Olika naturliga och syntetiska material har studerats för användning som en injicerbar gel, en förformad gel placeras i kontusion eller hemisection modeller, eller som en strukturerad kanal i hemisection eller slutföra transection modeller (detaljerad i recensioner23 , 24 , 25). i situ gelbildande av blandningen injicerbara matris/SC skapar ett mer tillåtande gränssnitt mellan transplantationen och värd sladden för axon korsar26,27 jämfört med före geléartad matris/SC implantat 5 , 18 , 19 , 28. i situ gelbildande tillåtna matrisen till kontur runt de oregelbundna host gränssnitt medan en mer styv och strukturerad conduit eller mindre formbara förformad gel inte kunde. En strukturerad conduit ger ofta kontakt vägledning och implantatet stabilitet i motsats till en injicerbara matris. De protokoll som presenteras här beskriva ett kirurgiskt ingrepp som drar nytta av både en injicerbara basalmembranet matris (t.ex. matrigel, se Tabell av material, avses som injicerbara matris här) och en strukturerad kanal till utvärdera axon förnyelse i den mest rigorösa ryggmärgen skadan modellen.
Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoreten (PVDF-TrFE) arrangera i rak linje fibrösa ihåliga conduits används i våra experimentella tillvägagångssätt. PVDF-TrFE är en piezoelektrisk polymer som genererar en övergående avgift när mekaniskt deformeras och har visat sig främja neurite förlängning och axon förnyelse både in vitro-29,30 och i vivo 31. Electrospinning är en vanlig byggnadsställning fabrication metod som kan snabbt producera tillförlitlig fibrösa ställningar med hjälp av olika polymerer med kontrollerbara egenskaper såsom fiber justering, fiber diameter och tjocklek av ställningen för neurala och andra program32,33,34.
Många studier av råtta SCs transplanteras i ryggmärgen skadan platser har visat behandling effekt5,9,18,19,20,21 ,26. Dessa transplantationer är nervskyddande för vävnaden som omger lesionen, minska lesionsstorlek hålighet och främja axon förnyelse i lesionen/transplantation webbplats och myelinisering av regenererad axoner. Mänskliga SCs kan transplanteras autologously, en fördel jämfört med de flesta andra neurala-relaterade celler24. Efter en perifer nerv biopsi, SCs kan vara isolerade och renade och kommer att skena iväg till önskad mängd för transplantation till människor. Autolog SC transplantation för ryggmärg skadade patienter har visat sig vara säkra i Iran35,36,37,38, Kina39,40, och den Sverige har41,42. SCs är kända att utsöndra talrika neurotrofa faktorer och extracellulära matrix proteiner viktiga för axon tillväxt och att spela en viktig roll i axon förnyelse efter perifer nervskada. Vårt mål här är att beskriva metoder som kan undersöka conduit mönster för att förbättra resultatet av SC transplantation i en komplett råtta ryggmärgen transection modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
vuxen Fischer honråttor (180-200 g kroppsvikt) är inrymt enligt NIH och USDA riktlinjer. De institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Miami godkända alla djur förfaranden.
1. före Transplantation utarbetandet
- Conduit förberedelse.
- Klipp specialföretaget till 5 mm i längd med hjälp av en #10 blad i dissekera Mikroskop.
Obs: Den inre diametern av specialföretaget är mellan 2,4-2,7 mm; den yttre diametern är mellan 2.5-2.8 mm. - Vik specialföretaget försiktigt längs den längsgående sidan ( figur 1A). Skär fyra små snitt om 0,4 mm lång och minst 1 mm från öppningarna i specialföretaget och ca 1 mm isär med rak kant Vännäs sax ( figur 1B).
- Veckla upp specialföretaget ( figur 1 c) och skär mellan två snitt längs samma sida att skapa två fönster sida vid sida ( figur 1 d). Se till att Fönstren kan öppnas och stängas ordentligt längs uncut.
- Sterilisera conduits i 75% etanol för 25 min i en 10-cm petriskål. Skölj kanaler en gång för 4 min med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och överföra ledningarna med steril pincett till en ny 10-cm petriskål. Skölj kanaler två gånger med 1 x PBS för 25 min varje.
- Lagra conduits i 1 x PBS tills kirurgi.
Obs: Många kraftledare kan steriliseras på en gång. Lagra conduits i separata sterila 1,5 mL centrifugrör att hålla dem sterila.
- Klipp specialföretaget till 5 mm i längd med hjälp av en #10 blad i dissekera Mikroskop.
- Grönt fluorescerande protein (GFP)-Schwann celler (SC) förberedelse
- förbereda renat SC kulturer från tibial nerverna i vuxna kvinnliga Fischer råtta som tidigare beskrivits 43. Vid slutförandet av detta steg, tallrik SCs på poly-L-lysin (PLL)-belagda 10-cm petriskålar och underhålla i D10 / 3M medium; dessa SCs definieras som passage 0.
Obs: D10 / 3M medium består av följande: 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (penna/strep), 20 µg/mL hypofysen extrakt, 2 µM forskolin, 2,5 nM heregulin i Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium (DMEM). - Fylla på med färska D10 / 3M medium (7 mL/10 cm petriskål) varje 3 till 4 dagar.
- Split SC kultur när den når 70-80% sammanflödet.
- Ta bort medium och skölj två gånger med Hank ' s balanserad saltlösning (HBSS) utan kalcium eller magnesium.
- Tillsätt 5 mL av 0,25% trypsin/EDTA till varje 10-cm petriskål och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (RT).
- Tillsätt 5 mL av D10 medium (10% FBS och 1% penna/strep i DMEM) i ett 50 mL centrifugrör att neutralisera trypsin.
- Försiktigt Pipettera den trypsin/EDTA lösning till Petri maträtt flera gånger för att lossa SCs. ta bort cellsuspensionen från skålen och placera det i centrifugröret beredd i föregående steg. Skölj skålen med 5 mL D10 medium och placera det i centrifugröret att maximera cellen skörd.
- Centrifugera cellerna vid 370 x g i 5 min på 4 o C. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 4 mL D10/3 M medium för varje petriskål split.
- Dosera 1 mL SC suspension och 6 mL D10 / 3M medium i en 10-cm petriskål; varje petriskål split kommer att resultera i 4 petriskålar. Dessa SCs definieras som passage 1.
- Fyll med färska D10 / 3M medium dagen efter plätering och varje 3-4 dagar efter plätering.
- En gång SCs nå 70-80% sammanflödet, upprepa steg 1.2.3.1 till 1.2.3.6. SCs är nu på passage 2.
- Transduce SCs en gång når 50% sammanflödet, med en lentiviral vektor kodning GFP i D10 / 3M medium över natten vid en multiplicity av infektion av 30 som tidigare beskrivs 44 , 45 .
- Fylla på med färska D10 / 3M medium nästa dag och varje 3-4 dagar efter plätering.
- När GFP-SCs nå 70-80% confluence, upprepa steg 1.2.3.1 till 1.2.3.5 men Återsuspendera GFP-SCs i 6 mL D10 medium istället. Fördela 15 µL av GFP-SC suspensionen i en 1,5 mL centrifugrör och tillsätt 15 µL av 0,4% trypan blå lösning. Flick centrifugröret försiktigt och fördela 10 µL av blandningen i en kammare av cell-räkna bilden.
- Placera bilden i en automatiserad cell räknare och bestämma cell densiteten.
- Centrifugera cellerna vid 370 x g i 5 min på 4 o C. ta bort supernatanten, blandas med 1,5 mL frysning medium för varje 3 x 10 6 GFP-SCs. dispensering 1,5 mL GFP-SC suspension till en kryogen injektionsflaska och frysa vid -80 o C under minst 24 h innan han flyttade till flytande kväve lagring.
Obs: Frysning medium: 25% FBS och 8% dimetyl sulfoxid i DMEM. - Tina GFP-SCs en vecka före operation.
- Lägg till 10 mL D10 medium i ett 50 mL centrifugrör.
- Tina injektionsflaskor med frysta GFP-SCs i vattenbad vid 37 o C tills delvis upptinade.
- Ta bort GFP-SC fjädringen från injektionsflaskan med kryogen och placera den i den 50 mL centrifugrör tillagas i 1.2.8.1. Försiktigt lösningen Pipettera upp och ner flera gånger.
- Centrifugera cellerna vid 370 x g i 5 min på 4 o C. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 4 mL D10/3 M medium för varje injektionsflaska tinade.
- Fördela 2 mL GFP-SC suspension och D10 / 3M medium 5 mL i en 10-cm petriskål; varje injektionsflaska bör resultera i 2 petriskålar. GFP-SCs definieras som passage 3.
Obs: En 10-cm petriskål ger vanligtvis runt 8 x 10 6 GFP-SCs efter en vecka.
- Samma dag som operationen, upprepa steg 1.2.6. Användning cell densiteten som beräknades i steg 1.2.10.
- Dispensering alikvoter av 3 x 10 6 GFP-SCs i sterila 1,5 mL Centrifugera rören baserat på cell densiteten beräknas från steg 1.2.9. Centrifugera i GFP-SC alikvoter vid 370 x g i 5 min på 4 o C och avlägsna supernatanten. Tillsätt 1 mL DMEM/F12 medium till varje alikvot och centrifugera vid 370 x g.
Obs: Varje djur får 3 x 10 6 GFP-SCs. Medium med serum används med GFP-SCs fram till detta steg. - Hålla GFP-SCs på is tills tiden för transplantationen.
- förbereda renat SC kulturer från tibial nerverna i vuxna kvinnliga Fischer råtta som tidigare beskrivits 43. Vid slutförandet av detta steg, tallrik SCs på poly-L-lysin (PLL)-belagda 10-cm petriskålar och underhålla i D10 / 3M medium; dessa SCs definieras som passage 0.
2. Slutföra Transection på thorakal nivå 8 (T8)
- djur inför kirurgi
- Anesthetize en kvinnlig Fischer råtta (180-200 g) med en intraperitoneal injektion av ketamin (60 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (5 mg/kg kroppsvikt). Övervaka djup anestesi innan du fortsätter till nästa steg genom att kontrollera tå klämmande och ögon blinkande svaren.
- Raka baksidan av råtta med en elektrisk klippare och torka huden med 70% etanol. Tillämpa oftalmologiska smörjmedel på båda ögonen. Överföra djuret till tabellen kirurgi på en värmedyna att bibehålla kroppstemperatur på ca 37 o C. plats djuret på rulle så kotorna är lätt att tillgång.
Obs: Rullen kan göras från pappershandduk eller 2 i x2 i gasbinda som kan steriliseras. Större rullar rekommenderas när T7-T9 behöver läggas platt ovanpå rullen.
- T7 till T9 laminektomi
- lokalisera landmarken för T9-T11 spindelkrabba processer.
Obs: Klyftorna mellan T9 och T10 T11 är små jämfört med andra segment in regionen. Efter att råttan på rulle, T9-T11 spindelkrabba processer kommer att kännas som en liten triangulär bula genom huden. - Gör en 4 till 5 cm mittlinjen snitt i huden med hjälp av en #10 blad från T4 till T11. Gör ett litet snitt i ytliga fettlagret med böjd sax med trubbiga ändar att dissekera fettet.
Obs: Andra typer av instrument kan användas för att separera fettet men böjd sax med trubbiga ändar aktivera den mest effektiva och minst invasiva metoden för fettavskiljning. - Hitta T7 T9 spindelkrabba processer med hjälp av baksidan av bladet #10. Håll muskeln på om T4 med trubbig pincett och gör ett snitt i muskeln längs varje sida av Kotor från T6-T10. Göra snittet så nära kotorna som möjligt att göra en ren öppning och orsaka minimal skada på djurets.
- Isolera varje enskild spindelkrabba process från T7 T9 genom att skära muskler och ligament mellan T6 och T7, T7 och T8, T8 och T9, och T9 och T10 med #10 blad.
- Använda en rongeur för att ta bort alla muskler och ligament på bladskivan från T7 till T9. Ta bort muskler och ligament som sidled som möjligt tills klyftorna mellan de tvärgående processerna från T7 till T9 syns.
- Ta bort T9 spindelkrabba processen med en rongeur. Håll den T8 spindelkrabba processen med trubbig pincett och lyft försiktigt för att höja den T9 lamina på den lilla öppningen mellan T9 och T10 processer.
- Ta bort den lamina start från öppningen och flytta rostrally med en rongeur på T9. Ta bort lamina sidled så mycket som möjligt. dorsala rötterna ska synas efter laminektomi.
- När lamina avlägsnas, upprepa processen för T8 och T7.
Obs: Under laminektomi, använda absorption spjut för att ta bort blod samtidigt som man fortsätter med laminektomi. Om överskott blödning uppstår, placera en komprimerad svamp på blödningsstället och tillsätt koksaltlösning att hjälpa blodkoaguleringen.
- lokalisera landmarken för T9-T11 spindelkrabba processer.
- Transection på T8
- Placera upprullningsdonet runt T7 till T9. När alla bladskivan tas bort, se till att klyftorna mellan de tvärgående processerna är synliga, särskilt vid T8. Också undersöka ben längs längden på båda sidor mellan T7 till T9 så det finns ingen benfragment utskjutande utåt.
Obs: Denna lucka på T8 är viktigt för att utföra den komplett transection. Kotorna längs längden bör tas bort för enklare conduit införande. - Skär den dorsala och ventrala rötterna ovan och nedanför T8 med vinklade våren sax. Lägga till koksaltlösning i ryggmärgen och vänta för blodet att levra.
Obs: detta steg är viktigt för korrekt conduit införande. - Placera vinklade våren saxen ovanför ryggmärgen i luckorna mellan de tvärgående processerna på T8 och göra ett snitt att helt bryta ryggmärgen. Placera en liten bit av komprimerade skum i den resulterande 2-2,5 mm gap och lägger till koksaltlösning i området omedelbart.
- Placera upprullningsdonet runt T7 till T9. När alla bladskivan tas bort, se till att klyftorna mellan de tvärgående processerna är synliga, särskilt vid T8. Också undersöka ben längs längden på båda sidor mellan T7 till T9 så det finns ingen benfragment utskjutande utåt.
3. Conduit insättning
- väntan på avhuggna sladd stubbarna att nå hemostas, ta ut en kanal från 1 x PBS. Skär absorption trianglar i tunna långa bitar och placera dem i specialföretaget ta bort överflödig PBS. Kontrollera att färdigskurna Fönstren är öppna.
- Ta bort saltlösning och blod med tunna långa bitar av absorption trianglar. Lyfta två stubbarna av ryggmärgen med en microspatula för att säkerställa god separation. Försiktigt lyft rostralt stubben med microspatula och glida kanal över stubben med windows inför sig själv. Se till att hela stubben infogas och det finns ingen överflödig blödning i specialföretaget.
- Försiktigt lyft kaudala stubben och glida den andra änden av specialföretaget över stubben. Kontrollera att hela stubben infogas och Fönstren är på den dorsala ytan ( figur 2A).
4. Schwann Cell / injicerbara matris (se tabell för material) beredning och injektion
- väntan på avhuggna sladden att nå hemostas, ta bort mediet ovan GFP-SC pelleten (bereddes i steg 1.2). Återsuspendera GFP-SCs i 10 µl kallt DMEM/F12. Tillsätt 10 µl kallt injicerbar gel i cellsuspensionen och blanda väl genom upprepad pipettering. Hålla GFP-SC/DMEM/F12/injicerbara matrix blandningen på is tills conduit införande har slutförts.
- Efter att se till att Fönstren på den dorsala ytan är öppna ( figur 2A), injicera 20 µl av GFP-SC/DMEM/F12/injicerbara matrix blandningen i specialföretaget genom en av de färdigskurna windows 46 använda en western blot lastning spets och en mikropipett. Om SC/DMEM/F12/injicerbara matrix blandningen bör överfyllnad specialföretaget, ta bort överskottet med absorption trianglar. Stäng fönstren efter injektion; suturering är inte behövs ( figur 2B).
5. Såret stängning och postoperativ vård
- suturen muskeln lager och ytliga fettdepåer. Rengör huden med 70% etanol och sedan häfta (t.ex. med hjälp av såret klipp) huden stänger. Hålla djuren i en termiskt reglerade inkubator tills de återfår medvetandet. Överföra djuren tillbaka i burarna. Ge vatten med en lång inmatningsrör och placera mat pellets på sängkläder för enkel åtkomst.
- Administrera buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvikt) två gånger dagligen i 3 dagar subkutant börjar genast efter operationen för att minska smärta. Injicera gentamycin (5 mg/kg kroppsvikt) subkutant en gång dagligen i 7 dagar omedelbart efter operationen för att förebygga och minska infektion. Injicera 10 ìl av ringer Ringers lösning subkutant två gånger dagligen för 7 dagar för hydrering.
- Tom blåsor funktionen manuellt två gånger dagligen tills blåsan returnerar. Om blåsan infektion uppstår, sedan administrera 10 mL koksaltlösning subkutant tills urinen blir tydlig. Om det finns någon förbättring i två dagar, injicera gentamycin (5 mg/kg kroppsvikt, en gång dagligen) subkutant tills urinen blir frikänden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denna operationsteknik är att utvärdera användningen av en strukturerad conduit och injicerbara matris som maximerar SC funktion efter transplantation in ifyllda transected ryggmärg. Tre veckor efter transplantation, djuren är perfusion med 4% PARAFORMALDEHYD och spinal kolumnerna är grovt dissekeras och fast i den samma fixativ för en annan 24 h. Ryggmärgen är sedan dissekerade och proverna för kryostaten sagittal sektioner placeras i en 30% sackaroslösning för cryoprotection. 1 mm tjock tvärsnitt isolerade från mitten av bron SC av en annan uppsättning dissekerade ryggmärg är placerade i glutaraldehyd fixativ att bearbeta för plast sektioner. Proverna utsätts för ett schema för elektron mikroskopisk förberedelse som detaljerad av Bates et al. 47. kryostaten sagittal delar var immunostained med primär antikropp mot GFP, glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande), tung kedja neurofilament (RT97) och medellång kedja neurofilament (NF) följt av sekundära antikroppar inklusive get-anti-kyckling-488, get-anti-kanin-546, get-anti-mus-647 och get-anti-kanin 647, respektive. GFP-SCs var jämnt fördelade längs och inom specialföretaget (figur 3A; innerväggar som markeras med gula linjer). Axon regenerering observeras (figur 3B) och är starkt förknippat med förekomsten av GFP-SCs (figur 3A och figur 3 c) som anger att denna teknik är framgångsrik i att tillhandahålla en SC bro inom en strukturerad conduit och i att främja axon förnyelse längs bron mellan rostralt och stjärtfenan stubbarna. Blodkärl och myeliniserade axoner hittades också i mitten av bron SC (figur 3D). Mer information om effekten av SCs med electrospun PVDF-TrFE fibrösa conduits på axon regenerering kan hittas i vår nyligen publicerade arbete31.
Andra resultatåtgärder kan utföras inklusive: kvantifiera axon förnyelse i sagittal sektioner av linje transekt-metoden beskrivs i vår senaste arbete31 och kvantifiera antalet myeliniserade axoner och fartyg i plast tvärsnitt. Prover som förberett för plastsektioner kan vara ytterligare sektioneras för transmissionselektronmikroskopi att kvantifiera antalet unmyelinated axoner. Cryoprotected ryggmärg prover kan också vara över uppställd i stället för sagittally sektioneras och immunostained att kvantifiera axon regenerering och förekomsten av GFP-SCs. beteendemässiga tester kan också utföras på djur med lämpliga mellanrum medan djuren upprätthålls.
Bild 1: fönstret förberedelse i specialföretaget. Vik ena sidan längs den längsgående axeln av 5 mm vp (A). Skär fyra snitt om 0,4 mm lång och minst 1 mm från öppningarna i specialföretaget (B). Varje snitt är ca 1 mm från varandra. Av utspelar sig specialföretaget, observeras 4 parallella nedskärningarna (C). Skär mellan de två snitt längs den rostralt-kaudala axeln att skapa ett fönster som kan öppnas genom att lyfta luckan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: fönster stängning efter SC/DMEM/F12/matris injektion. Fönster som öppnas genom att vika tillbaka varje flik efter utsläppande ledningen mellan rostralt och stjärtfenan stubbarna (A). Fönster är stängda efter injektion (B). Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Confocal fluorescerande bilder av sagittal sektioner och en ljusa fältet bild av ett plast tvärsnitt från ryggmärgen transplanteras med GFP-SCs i linje fibrösa PVDF-TrFE conduits. Översikt över bron SC inom de kanaler där innerväggarna markeras med gula linjer och immunostained för god Jordbrukarsed och glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) att visualisera transplanterade SCs och värd ryggmärgen astrocyter, respektive. Regenererad axoner var märkt med RT97 (heavy-kedjan neurofilament) (A, B) och medellång kedja neurofilament (NF, C) antikroppar. Axoner är inte lika synliga i (A) på grund av deras nära samarbete med GFP-SCs som observeras i regionen Mid conduit i (C) med högre förstoring. Axoner är inte synliga i rostralt stubben på grund av ofullständig scan i djupet av avsnittet vävnad när imaging av konfokalmikroskopi. Blodkärl (märkt som v i D) och myeliniserade axoner (märkt som MA d) observerades både i mitten av conduit regionen i en plast avsnitt. Förstoringar och skala barer: A, B (10 x, 200 µm); C (20 x, 100 µm). D (63 x, 25 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigaste steget i att skapa en effektiv transection modell är severing ryggmärgen i en eller två nedskärningar. Ett 2-2,5 mm gap mellan rostralt och stjärtfenan ryggmärgen stubbarna bör förekomma på webbplatsen transection. Av tre mest sannolika skäl för sådan lucka inte visas är (1) dorsala/ventrala rötterna inte togs bort ordentligt, (2) den ventrala Duran togs inte bort tillräckligt eller (3) djuret var inte rätt placerade på rulle placeras under henne.
Att utföra en effektiv conduit insättningspunkten mellan stubbarna: (1) diameter från specialföretaget bör vara anpassade för specifika arter och ålder av de djur som används i experimentet; (2) bladskivan måste avlägsnas sidled nog tills klyftan mellan de tvärgående processerna kan visualiseras; (3) rötter måste tas bort och (4) conduit insättningspunkten mellan stubbarna bör vara fulländad på första försöket. Om flera försök behövs, kan detta orsaka ödem i stubbarna, ytterligare komplicerar uppgiften att conduit insättningspunkten mellan stubbarna och vållar ytterligare skada.
För att utföra effektiva GFP-SC/DMEM/F12/injicerbara matrix införsel till specialföretaget, se till att: (1) ryggmärgen är inte blödning före conduit insättning mellan stubbarna. Om det finns vätska i specialföretaget efter insättningspunkten mellan stubbarna, Använd en liten bit av absorption spjut att ta bort den via färdigskurna windows. (2) Kontrollera att specialföretaget träs på båda stubbarna i ryggmärgen väl och (3) att dorsala färdigskurna Fönstren är öppna. Injektion av 20 µl av SC/injicerbara matrix blandningen bör vara mer än tillräckligt för att fylla specialföretaget. Spill från färdigskurna windows är en bra mätare för effektiv transplantation.
Begränsningarna i detta förfarande är: (1) ingen restaurering av dura, (2) ingen kontroll över rörelsen av conduit/SC transplantation efter avslutad kirurgi och (3) ingen alternativ metod om det finns läckage medan du injicerar SC/injicerbara matrix blandningen.
Fördelen med detta förfarande är kombinationen av användningen av både en strukturerad kanal med en injicerbar matrix. Någon conduit tillverkade i ett material av val som är smidig som ska infogas mellan stubbarna kan användas i detta kirurgiska ingrepp. Alla injicerbara matris av val kan också användas i detta förfarande. en temperatur-känslig gel är att föredra på grund av dess förmåga att gel i situ och kontur till formen på stubben att skapa en sömlös gränssnitt. Ledningar med en mer komplex inre struktur kan användas istället för en ihålig interiör. Droger, tillväxtfaktorer, små molekyler eller vilken celltyp kan införlivas i den strukturerade conduit eller injicerbara matrisen eller båda att förbättra transplantation överlevnad, ge neurala skydd omedelbart efter skada, minska inflammation, främja axon förnyelse, och främja angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka de virala vektorn och djur kärnor på Miami projektet till bota förlamning för producerar den lenti-GFP-virus och ge Djurvård, respektive, histologi och Imaging kärnor för användning av kryostaten, confocal mikroskopet, och fluorescerande Mikroskop med Stereo utredare. Finansieringen tillhandahölls av NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) och NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge är det Christine E Lynn Distinguished Professor i neurovetenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
- King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
- Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
- Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
- Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
- Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
- Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
- Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
- Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
- Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
- Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
- Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
- Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
- Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
- Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
- Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
- Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
- Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
- Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
- Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
- Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
- Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
- Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
- Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
- Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
- Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
- Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
- Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
- Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
- Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
- Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
- Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
- Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
- Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
- Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
- Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
- Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
- Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
- Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
- Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
- Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
- Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
- Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).
